Universiẗat, Diss., 2003--Göttingen.

Universiẗat, Diss., 2005--Düsseldorf.

Invertasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden über eine Vielzahl von Faktoren in ihrer Regulation beeinflusst. Invertasen mit pH-Optimum im sauren Bereich liegen dabei als vakuoläre und zellwandgebundene Isoformen einer Genfamilie in den Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal 9 putative Invertasen aus der Nutzpflanze Brassica napus, sowie 4 weitere putative Mitglieder der bereits bekannten Tabakinvertasenfamilie isoliert und Expressionsprofile für die neu klonierten Invertasen erstellt. Symplastisch isolierte Zellen, wie z. B. Pollen und Pollenschläuche, sind auf die Expression zellwandgebundener Invertasen besonders angewiesen, da sie Kohlen-hydrate primär in Form von Fructose und Glucose aufnehmen, die über die Invertasen-vermittelte Spaltung aus Saccharose gebildet werden. An Tabak hatten Goetz et al. (2001) gezeigt, dass eine Inhibierung dieser pollen¬spezi¬fischen Invertaseaktivität zu männlich sterilen Pflanzen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass durch Inhibierung der Zellwandinvertase¬aktivität mittels Antisense-Technik oder Expression des proteinogenen Invertase-Inhbitors AtC/VIF2 auch männlich sterile Arabidopsis-Pflanzen generiert werden können. Ein Aktivitätsvergleich der Invertase-promotoren von Nin88 aus Tabak und AtcwINV2 aus Arabidopsis im jeweiligen homo- und heterologen System zeigte jedoch, dass der Einsatz dieser pollenspezifischen Promotoren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen über Familiengrenzen hinweg nicht möglich ist. Neben ihrer Funktion als Energieträger stellen Kohlenhydrate auch Signalmoleküle dar, die in die Regulation zentraler Prozesse der Pflanzen eingreifen. Anhand von Keimungsanalysen mit Arabidopsis-Pollen wurde festgestellt, dass Hexokinase-unabhängige Signalingwege involviert sein müssen, um ein Auskeimen der Pollen zu ermöglichen. Dabei kann die Hexokinase-vermittelte Inhibition der Pollenkeimung vermutlich durch die Beteiligung anderer Signaling-Wege aufgehoben werden. Es wurde außerdem die zuckerabhängige Ausbildung blasenartiger Strukturen an Arabidopsis-Pollen nachgewiesen, die vermutlich durch einen Zucker-spezifischen Abbruch des Pollenschlauchwachstums gebildet werden. / Invertases with acid pH-optimum play a central role in plant metabolism and are regulated by numerous biotic and abiotic factors. They consist of vacuolar and extracellular isoforms of a gene family in plants. For the first time 9 putative members of the invertase family of Brassica napus, as well as 4 additional putative tobacco acid invertases were cloned in this work and expression profiles were analysed. Symplastically isolated cells, like pollen and pollen tubes, in particular depend on the expression of extracellular invertases, since they prefer the uptake of glucose and fructose. These hexoses are generated by the invertase-mediated cleavage of sucrose. Goetz et al. (2001) have shown on tobacco that inhibition of the pollen specific invertase activity lead to male sterile plants. In this work it was shown that inhibition of cell wall invertase activity via antisense technology or expression of the proteinaceous invertase inhbitor AtC/VIF2 also causes male sterility in Arabidopsis thaliana. Comparison of the promoter activities of the invertases Nin88 (tobacco) and AtcwINV2 (Arabidopsis) in the corresponding homo- and heterologous systems revealed that the use of these pollen specific promoters for generating male sterile plants is not possible in diverse plant families. Besides their function as energy source, carbohydrates are signaling molecules that influcence regulation of central processes in the plants. On the basis of germination assays with Arabidopsis pollen, it was shown that hexokinase-independent signaling pathways must be involved to permit normal pollen germination. In this context, hexokinase-mediated inhibition of pollen germination might be overrode by the involvement of other signaling pathways. In addition, the sugar-dependent generation of bubble-like structures at Arabidopsis pollen was demonstrated, which might be caused by the sugar-specific interruption of pollen tube growth.

Es ist bekannt, dass Änderungen im Kohlenstoff- bzw. Stickstoffstaus der Pflanzen zu einer parallelen statt reziproken Änderung der kohlenstoff- und stickstoffhaltigen Primärmetabolite führen. Unter diesem Gesichtspunkt wurden in der vorliegenden Arbeit der Aminosäurestoffwechsel und der Sekundärstoffwechsel unter reduzierten Stickstoffbedingungen untersucht. Zur Beeinflussung des Stickstoffstoffwechsels wurden nitratmangelernährte Tabakwildtyppflanzen und Genotypen mit unterschiedlich stark reduzierter Nitratreduktase-Aktivität verwendet. Dieses experimentelle System erlaubt zusätzlich durch den Vergleich Nitrat defizienter Wildtyppflanzen mit Nitrat akkumulierenden NIA-Transformanten Prozesse zu identifizieren, die durch Nitrat gesteuert werden. Die Analysen der Primär- und Sekundärmetabolite wurde in allen Genotypen diurnal durchgeführt, um auch tageszeitlich abhängige Prozesse zu identifizieren. Die Analyse der absoluten Gehalte aller individuellen Aminosäuren enthüllte bei den meisten erstaunlich stabile diurnale Muster mit einem Anstieg während des Tages und einem Abfall in der Nacht in Wildtyppflanzen gewachsen mit ausreichend Nitrat. Dieses Ergebnis legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Biosynthese der Aminosäuren koordiniert abläuft. In Pflanzen mit reduziertem Stickstoffstatus haben diese diurnalen Muster jedoch keinen Bestand. Die Kombination des erzeugten stickstoffbasierten Aminosäuredatensatz in Kombination mit einem bereits erzeugten Aminosäuredatensatz unter kohlenstofflimitierten Bedingungen von Matt et al. (2002) führte durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Korrelationsanalyse zu dem Ergebnis, dass die Hypothese nach einer koordinierten Aminosäurebiosynthese nicht allgemeine Gültigkeit hat. Die PCA identifizierte Glutamin, Glutamat, Aspartat, Glycin, Pheny-lalanin und Threonin als Faktoren, die den Datensätzen ihre charakteristische Eigenschaft und deren Varianz verleihen. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die sehr guten Korrelationen der individuellen Aminosäuren untereinander in reduzierten Stickstoff- und Kohlenstoffbedingungen sich verschlechtern. Das Verhältnis einer einzelnen Aminosäure relativ zu den anderen führte zur Identifizierung einiger Aminosäuren, die individuelle Antworten auf Stickstoff- und/oder Kohlenstoffstatus zeigen, und/oder speziell auf Nitrat, Licht und/oder den E-nergiestatus der Thylakoidmembran. Glutamat beispielsweise verhält sich in den meisten Situationen stabil, Phenylalanin dagegen zeigt in jeder physiologischen Situation eine individuelle Antwort. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu einer Erweiterung der Hypothese einer koordinierten Synthese der Aminosäuren dahingehend, dass diese nicht generell für alle Aminosäuren angenommen werden kann. Es gibt einige Aminosäuren deren, Anteile sich situationsbedingt anpassen. Die Reduktion des Stickstoffstatus in nitratmangelernährten Tabakwildtyppflanzen führte zu der, nach der „Carbon-Nutrient-Balance“ Hypothese erwarteten Verlagerung der kohlenstoffreichen Phenylpropanoide und des stickstoffreichen Nikotins. Die Erhöhung der Phenylpropanoidgehalte war nicht in der Nitrat akkumulierenden NIA-Transformante zu beobachten und somit konnte Nitrat als regulatorisches Element identifiziert werden. Ein Einfluss der Vorläufermetabolite konnte ausgeschlossen werden, da sowohl nitratmangelernährter Wildtyp als auch die Nitrat akkumulierende NIA-Transformante ähnliche Gehalte dieser aufwiesen. Genexpressionsanalysen über Mikroarray-Hybridisierung und quantitative RT-PCR zeigten, dass Nitrat durch noch nicht geklärte Mechanismen Einfluss auf die Expression einiger Gene nimmt, die dem Phenylpropanoidstoffwechsels zugeordnet sind. Aus der Arbeit hervorgegangene Veröffentlichungen: Christina Fritz, Natalia Palacios-Rojas, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Regulation of Secondary Metabolism by the Carbon-Nitrogen Status in Tobacco: Nitrate Inhibits Large Sectors of Phenylpropanoid Metabolism. Plant Journal 46, 533 - 548 Christina Fritz, Petra Matt, Cathrin Müller, Regina Feil und Mark Stitt (2006) Impact of the Carbon-Nitrogen Status on the Amino Acid Profile in Tobacco Source Leaves. Plant, Cell and Environment 29 (11), 2009 - 2111 / It is known that changes in carbon and nitrogen status of a plant lead to parallel rather than reciprocal changes of carbon and nitrogen containing primary metabolites. Based on this finding the influence of carbon and nitrogen status on the amino acid profile as well as on secondary metabolism was investigated in tobacco. Manipulations of the nitrogen status were carried out in two ways: Tobacco wild type plants were cultivated in nitrogen-replete and nitrogen starved conditions; in addition nitrate accumulating transformants with reduced nitrate reductase (NIA) activity were used. The comparison of the nitrate starved wild type and the nitrate accumulating NIA-transformant allows to distinguish processes which were driven by the nitrogen status of a plant or by nitrate itself. Due to the fact that most primary metabolites have diurnal changes the analysis of primary and secondary metabolites were done at six different time points per day in order to identify diurnal processes. Analysis of the absolute levels of individual amino acids under normal nitrogen supply conditions reveals characteristic diurnal patterns for the majority of amino acids with an increase during the day and a decrease during the night. This result indicates that amino acid biosynthesis might be coordinated. However these diurnal patterns are no longer stable in plants with reduced nitrogen status; furthermore absolute levels of individual amino acids differed over a wide range of concentrations. The hypothesis of a coordinated regulation of amino acid metabolism was further tested by combining this dataset with an amino acid dataset produced under carbon limited conditions (Matt et al., 2002) and applying Principal Component Analysis (PCA) and correlation analysis. Glutamine, glutamate, aspartate, glycine, phenylalanine and threonine were responsible for the clear separation of the different genotypes and experimental conditions in the PCA plot. The data from the correlation analysis show that most of the minor amino acids have very good correlations under carbon and nitrogen sufficient conditions. These correlations became weaker with decreasing carbon and nitrogen status of the plants. These results clearly indicate that a coordinated biosynthesis of amino acids is not a general phenomenon. Comparing the levels of each individual amino acid to the total amino acid pool revealed specific answers of a particular amino acid to carbon and/or nitrogen status, to nitrate and/or light and to energy status of the thylakoid membrane. Glutamate for instance is remarkably stable in most of the conditions and phenylalanine shows an individual response in every situation. From these results it was concluded that the hypothesis of a coordinated biosynthesis of amino acids might be true for some amino acids, but clearly needs to be extended because some amino acids adjust their levels in an individual fashion depending on the external conditions. The reduction of nitrogen status of nitrate starved wild type plants leads to a shift from carbon-rich phenylpropanoids to nitrogen-rich nicotine as predicted by the “carbon-nutrient-balance hypothesis”. Increased phenylpropanoids were not observed in nitrate accumulating NIA-transformants. Therefore nitrate could be identified as a regulatory element in phenyl-propanoid metabolism. A regulatory influence of precursors could be excluded since nitrate starved wild type and NIA-transformant had similar levels. Genexpression analysis via microarry hybridisation and quantitative RT-PCR shows that nitrate acts a transcriptional regulator of genes involved in phenylpropanoid metabolism. The elucidation of this regulatory role of nitrate requires further investigation.

Heidelberg, Univ., Diss., 2007. / Online publiziert: 2008.

Techn. Hochsch., Diss., 2000--Aachen.

Techn. Hochsch., Diss., 2002--Aachen.

Techn. Hochsch., Diss., 2004--Aachen.

In dieser Arbeit wurde die plastidäre Genexpression hinsichtlich zweier Aspekte untersucht: der Cytokinineinfluss auf die plastidäre Transkription und ihrer Komponenten sowie eine in vivo-Charakterisierung von PrpoB-345, des Promotors des rpoB-Operons im Tabak. Cytokinine beeinflussen die Chloroplastenbiogenese und –funktion. Um den Einfluss von Cytokinin auf die plastidäre Genexpression zu untersuchen, wurden run-on-Transkriptionsassays und quantitative real-time RT-PCR von BA-behandelten seneszenten Tabakblättern und sieben-Tage-alten Arabidopsis- und Tabakpflanzen durchgeführt. Zeitreihenanalysen zeigten eine Aktivierung der plastidären Transkription in jungen Pflanzen und im seneszenten Tabak 2 h bzw. 3 h nach BA-Applikation. Abgeschnittene Blätter von Tabakmutanten mit konstitutiv reduziertem Cytokiningehalt antworteten bereits nach 30 min der Hormonbehandlung. Es gibt jedoch keinen eindeutigen Hinweis für eine direkte Korrelation zwischen der Expression der nukleär kodierten Phagentyp-RNA-Polymerasen und der BA-induzierten transkriptionellen Aktivierung der Plastidengene. Zusammengefasst, scheint die Antwort auf exogenes Cytokinin vom physiologischen Status der Chloroplasten, die von der Pflanzenart sowie vom endogenen Cytokiningehalt beeinflusst werden, abzuhängen. Plastidäre Gene höherer Pflanzen werden von mindestens zwei RNA-Polymerasen transkribiert: die plastidär kodierte RNA-Polymerase vom Bakterientyp (PEP) und die kernkodierte Phagentyp-RNA-Polymerase (NEP). NEP transkribiert das rpoB-Operon, das drei von vier Untereinheiten der PEP kodiert. Transkriptions- und Transkriptanalysen von rpoB-Promotor-Deletionsmutanten ergaben Hinweise auf mögliche Regulationsstellen der Kontrolle der rpoB-Transkription. Neben PrpoB-345 konnten zwei weitere Promotoren kartiert werden. Einer von ihnen ist ein putativer PEP-Promotor, der auf autoregulatorische Rückkopplungsmechanismen bei der PEP-Expression hindeutet. / In this study, plastid gene expression was analyzed focusing on two aspects: the effect of cytokinin on plastid gene transcription and its components, and the in vivo characterization of PrpoB-345, the promoter of the rpoB operon in tobacco. Cytokinins are involved in the control of chloroplast biogenesis and function. To study cytokinin effects on plastid gene expression, chloroplast run-on transcription and quantitative real-time RT-PCR from senescent tobacco leaves as well as Arabidopsis and tobacco seedlings after BA treatment were performed. Analyses of time series revealed that BA-induced changes in plastid gene expression are seemingly under circadian and homeostatic control. After 2 h and 3 h of incubation with cytokinin, a stimulation of chloroplast transcription could be observed in seedlings and senescent leaves, respectively. Detached leaves of tobacco mutants with reduced endogenous cytokinin content responded even faster to BA (30 min). There is no indication of direct correlation of the expression of nuclear-encoded plastid phage-type RNA-polymerases and the BA-induced transcriptional activation of plastid genes. In summary, the responsiveness to exogenous cytokinin depends on the physiological status of chloroplasts influenced by plant species and endogenous cytokinin pool. Plastid genes of higher plants are transcribed by at least two RNA polymerases: the plastid-encoded eubacterial-type RNA polymerase (PEP) and the nucleus-encoded phage-type RNA polymerase (NEP). NEP transcribes the rpoB operon encoding three of four subunits of PEP. Transcription and transcript analyses from rpoB promoter deletion mutants indicated putative regulatory sites of control of rpoB transcription which may also interact with (cytokinin-regulated) specificity factors. Beside PrpoB-345, two additional rpoB promoters could be mapped. One of them is a putative PEP promoter which may imply autoregulatory loops of PEP expression.

Transgenic plants expressing a foreign gene are a suitable system for the production of relevant immunogens in high amounts that can be used for the development of a new generation of vaccines against a variety of infectious diseases. In the present study, the expression of the nucleocapsid (N) protein of hantavirus serotype Puumala in tobacco and potato plants was investigated. Transgenic tobacco and potato plants were generated and established. These transgenic plants expressed the N protein of Puumala virus strain CG-1820. No major differences were observed when the phenotype and growth rates of transgenic plants were compared to those of normal plants. However, it was found that the leaves of transgenic tobacco plants were more slender and the tubers of transgenic potato plants were smaller than those in normal plants. In order to investigate the distribution of the expression of the foreign gene in transgenic plants, the proteins of leaves and roots of the individual transgenic tobacco and potato plants were examined by Western blot analyses. It was found that all transgenic tobacco and potato plants expressed the N protein in the leaves, whereas transgenic potato plants are able to significantly express the viral proteins also in the tubers and roots. The antigens were expressed at a level of 1 ng of protein/5 μg of dried leaves. The hantaviral recombinant N proteins obtained from transgenic tobacco and potato plants were able to elicit specific humoral and mucosal immune responses when administered intraperitoneally or orally to rabbits and mice. The expression of viral proteins in plants has two major advantages compared to other expression systems: firstly, there is no risk of contamination with mammalian viruses or other pathogens, and secondly, the production of high amounts of antigens is cheap and therefore of great economic interest. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.