La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative caractérisée d’un point de vue anatomopathologique par une accumulation extracellulaire de peptides amyloïdes et d’une dégénérescence neurofibrillaire (DNF), résultant de l’agrégation intraneuronale de protéines Tau hyper-et-anormalement phosphorylées. D’autres déterminants sont également associés à la MA dont une neuroinflammation chronique et une insulinorésistance centrale qui contribueraient tous deux au développement des lésions ainsi qu’aux troubles synaptiques et mnésiques associés.La neuroinflammation observée dans la MA est caractérisée par une activation des cellules gliales, une infiltration lymphocytaire ainsi que par la libération de médiateurs inflammatoires solubles dont les chimiokines. Le CCL3 est une chimiokine hautement dérégulée dans le cerveau des patients de MA. Dans notre laboratoire, nous avons montré que dans un modèle de DNF, le CCL3 était le facteur pro-inflammatoire le plus affecté au niveau hippocampique laissant ouverte l’hypothèse d’un rôle dans les dysfonctions mnésiques associées à la pathologie Tau. Pour aborder cette question, nous avons précisément évalué l’impact du CCL3 sur le fonctionnement synaptique hippocampique et sur les fonctions mnésiques. Nos travaux montrent que l’application de CCL3 sur des tranches d’hippocampe entraine une diminution des activités basales ainsi que de la potentialisation à long terme (LTP) sans altérer le fonctionnement présynaptique ni la dépression synaptique à long terme (LTD). Par ailleurs, l’élévation intracérébrale de CCL3 par injections intracérébroventriculaires sub-chroniques affecte également la transmission synaptique basale et la LTP ainsi que la mémoire spatiale à court terme et la mémoire à long terme. La réversion de ces altérations par le Maraviroc permet de conclure que l’effet néfaste du CCL3 est dépendant du récepteur CCR5. Ainsi, ces travaux soulignent l’importance du CCL3 dans la physiopathologie de la MA, notamment en lien avec la DNF.L’insulinorésistance observée dans les cerveaux de patients atteints de la MA est connue pour favoriser le développement des lésions caractéristiques et est suggérée comme participant aux atteintes synaptiques et mnésiques. Cependant les causes de cette insulinorésistance centrale sont peu connues. Quelques études montrent que les oligomères d’Aβ, le diabète de type II ou même la neuroinflammation sont susceptibles de conduire à une insulinorésistance centrale. Néanmoins, à ce jour aucune relation n'a été établie avec la protéine Tau. La seconde partie de ce travail s’est attachée à étudier le rôle de la protéine Tau dans la régulation de la réponse centrale à l’insuline. Diverses expériences réalisées in vitro et in vivo montrent que la surexpression de la protéine Tau induit une augmentation de la sensibilité neuronale à l’insuline alors que la délétion de Tau aboutit à l’effet inverse. Cette régulation semble être liée à une interaction entre la protéine Tau et PTEN, une phospholipase inhibitrice de la signalisation de l’insuline. L’interaction entre Tau et PTEN réduirait l’activité de cette dernière, favorisant de ce fait l’action de l’insuline au niveau central. Par ailleurs, des données physiologiques indiquent que cette régulation de la signalisation centrale de l’insuline pourrait avoir une répercussion sur la régulation de l’homéostasie énergétique. En ce sens, la délétion de la protéine Tau induit une prise de poids, une hyperinsulinémie et une glucointolérance périphérique. Ces données proposent donc une nouvelle fonction de la protéine Tau dans la signalisation neuronale et le métabolisme. Cette perte de fonction dans la MA pourrait expliquer les mécanismes d’insulinorésistance centrale liés à la DNF.En conclusion, nos données mettent en évidence deux mécanismes liant la pathologie Tau aux atteintes mnésiques, l’un passant par la production de la chimiokine CCL3, l’autre impliquant une résistance neuronale à l’insuline. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by extracellular amyloid deposits and intraneuronal neurofibrillary tangles, made of aggregated and abnormally hyperphosphorylated Tau proteins. Other components are also involved in AD pathophysiology, including chronic neuroinflammation and central insulinoresistance that would contribute both to the development of Alzheimer lesions as well as associated synaptic and memory impairments.Neuroinflammation observed in AD is characterized by glial cell activation, lymphocyte infiltration, and the release of soluble inflammatory mediators including chemokines. CCL3 is a highly upregulated chemokine in the brain of AD patients. In our lab, we have shown, in a mouse model of Tau pathology, that hippocampal CCL3 was largely upregulated and, thus, we made the assumptions that such increase could play a key-role in the memory dysfunctions associated with Tau pathology. To address to this question, we precisely evaluated the impact of CCL3 upon hippocampal synaptic activity and memory function. Our data show that CCL3 application on hippocampal slices induces a significant decrease of basal synaptic activity and long term potentiation (LTP) impairment without affecting presynaptic activity and long term depression (LTD). Further, intracerebral elevation of CCL3 by sub-chronical intracerebroventricular injections was also found to impact hippocampal basal synaptic activity and LTP but also short term spatial memory and long term memory. Reversion of these alterations by Maraviroc finally suggests that CCL3 deleterious effects are CCR5 dependent. Overall, these studies show the important role of CCL3 towards plasticity and memory as well as in AD physiopathology.Besides chronic inflammation, insulinoresistance observed in AD brain is suggested to favor the development of amyloid and Tau lesions but also to participate to synaptic impairments underlying memory loss. However, origins of the brain insulinoresistance described in AD are unclear. Previous studies ascribed central insulin-resistance to Aβ oligomers, type II diabetes or even neuroinflammation. So far, no relationship has been established with Tau protein. The aim of the second part of the present thesis was evaluate the potential role of Tau protein towards the regulation of central insulin sensitivity. Various experiments performed in vitro and in vivo show that Tau favors the neuronal response to insulin, whereas Tau deletion favors insulin-resistance. This regulation seems to be related to an interaction between Tau and PTEN, a phospholipase inhibiting insulin signaling, which results in a reduced PTEN activity, itself favoring insulin pathway activation. Regulation of brain insulin signaling is known to modulate energy homeostasis, food intake and weight gain. In line with the idea that Tau protein modulates insulin signaling, we found that Tau deletion induces weight gain, hyperinsulinemia and glucointolerance. Together, these data provide a new function for Tau in the control of neuronal signaling and peripheral metabolism. These data also highlight that the loss of Tau function in AD might explain at last in part the central insulinoresistance described as “type 3 diabetes”.In conclusion, our data highlight two mechanisms linking Tau pathology and memory deficits, one through the detrimental effect of the chemokine CCL3 and the other involving neuronal insulin resistance.

La mobilité est une fonction clé de la qualité fécondante et de sélection des spermatozoïdes des techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP). Nous manquons cependant d'information des mécanismes moléculaires contrôlant cette mobilité. Ce travail de thèse est articulé autour de 2 protéines d’intérêts impliquées dans la mobilité spermatique: la protéine Tau (Tubule-associated unit) associée à la polymérisation des microtubules dans le neurone, et la protéine d’ancrage aux kinases A4 (AKAP4), protéine majeure de la gaine fibreuse du flagelle spermatique, connue pour son implication dans la mobilité spermatique.Très peu d’études traitent de la protéine Tau dans l’appareil génital masculin, et aucune chez l’homme. Dans une première partie de ce travail, nous avons analysé l’expression de la protéine Tau dans le spermatozoïde et le testicule humain par une approche immuno-histo-chimique (article 1). La protéine Tau est localisée dans la pièce intermédiaire du flagelle du spermatozoïde, et dans le spermatocyte et la spermatide dans le testicule. Les rôles potentiels de la protéine Tau durant la spermatogenèse sont discutés dans une revue de la littérature (article 2).Les avancées dans le domaine de la protéomique permettent aujourd’hui d’étudier le protéome du spermatozoïde et de ses compartiments cellulaires de façon hautement résolutive. Le protéome global du spermatozoïde a été étudié chez des hommes consultant le centre de procréation assistée du CHRU de Lille. Il a permis de définir un groupe de spermatozoïdes présentant majoritairement des protéines de haut poids moléculaire et un groupe présentant une protéolyse aux dépends des protéines de haut poids moléculaire. L’AKAP4 a été identifiée parmi les protéines de hauts poids moléculaire. Nous avons étudié, quantifié le profil d’expression de l’AKAP4 en Western Blot dans le sperme d’hommes venant effectuer un spermogramme et corrélé les données biochimiques du protéome et de l’AKAP4 au spermogramme (article en soumission 3). Le rôle de l’AKAP4 comme marqueur prédictif en AMP est ensuite abordé. Les données clinico-biologiques (logiciel INFOFIV) des tentatives d’AMP au CHRU de Lille ont été confrontées aux données quantitatives du protéome global et de l’AKAP4 (article en préparation 4).Les protéines Tau et AKAP4 sont des protéines d’intérêts dans la prise en charge de l’homme infertile. L’AKAP4 pourrait être proposée comme biomarqueur dans la prise en charge en AMP. / Motility is a key function of the fertilizing quality and the selection of sperm for assisted reproductive technology (ART). However, we lack information on molecular mechanisms controlling this mobility. This thesis is structured around 2 proteins of interest involved in sperm mobility: Tau (tubule-associated unit) associated with microtubule polymerization in the neuron, and the A-kinase anchoring protein 4 (AKAP4), the main protein of the fibrous sheath of the sperm’s flagellum, known for its involvement in sperm motility.Very few studies focus on the Tau protein in the male reproductive system, and none in humans. In the first part of this work, we analysed the expression of the Tau protein in the sperm and human testis through an immuno-histo-chemical approach (Article 1). The Tau protein is localized in the intermediate part of the sperm flagellum and in the spermatocyte and spermatid in the testis. The potential roles of the Tau protein during spermatogenesis are discussed in a review of the literature (Article 2).Advances in the field of proteomics now allow the study the proteome of sperm and its cellular compartments in a highly-resolutive way. The global sperm proteome was studied in men visiting the assisted reproduction center of Lille University Hospital. This has led to a group of sperm with predominantly high molecular weight proteins being identified as well as a group having proteolysis at the expense of high molecular weight proteins. The AKAP4 was identified among the high molecular weight proteins. We studied, quantified the profile of AKAP4 expression by Western Blot in the sperm of men undergoing a semen analysis and correlated the biochemical data of the proteome and AKAP4 to the semen analysis (article 3 in submission). The role of AKAP4 as a predictive marker of ART success is then discussed. Clinical and biological data (INFOFIV software) of ART attempts at the Lille University Hospital were compared with quantitative data of the global proteome and AKAP4 (Article 4 in preparation).Tau protein and AKAP4 are proteins of interest in the management of infertile men. The AKAP4 could be proposed as a biomarker in ART treatments.

Les tauopathies, dont la maladie d’Alzheimer (MA) est l’exemple le plus connu, sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une agrégation intra-neuronale progressive de protéine Tau hyperphosphorylée conduisant inéluctablement à la mort du neurone. De nombreuses études convergent vers une implication du stress oxydant comme l’un des mécanismes précoces à l’origine de la MA. En effet, une accumulation de dommages oxydatifs aux acides nucléiques est observée aux stades précoces de la MA. Cependant, les mécanismes impliqués dans cette altération de l’intégrité des acides nucléiques au cours de la MA restent obscurs. Outre son rôle connu dans la stabilisation des microtubules, Tau est un acteur essentiel de la protection de l’intégrité des acides nucléiques neuronaux. En effet, au sein du laboratoire, il a été récemment montré in vivo que Tau protège l’ADN et l’ARN en condition physiologique ainsi qu’au cours d’un stress hyperthermique. L’hyperthermie est un outil inducteur de stress oxydant. Aucune étude n’a été menée pour examiner l’effet de la pathologie Tau sur la fonction protectrice de Tau vis-à-vis des acides nucléiques (AN).Cette problématique constitue le premier objectif de ma thèse. Pour cela, nous avons utilisé un modèle murin qui développe une agrégation et une hyperphosphorylation progressive de la protéine Tau : les souris THY-Tau22. Nous avons démontré, dans ce modèle, que l’hyperthermie induit des dommages aux AN uniquement dans les neurones présentant une pathologie précoce, à des stades qui précèdent la formation d’agrégats insolubles de Tau. Au sein de ces neurones, ces dommages aux AN induits par l’hyperthermie sont strictement corrélés à la formation d’oligomères de protéines Tau, formes précoces de l’agrégation de Tau. Une association similaire entre la présence d’oligomères de Tau et des dommages oxydatifs a également été mis en évidence dans des cerveaux de patients atteints de la MA. Le pré-traitement de ces souris avec du bleu de méthylène, un inhibiteur de l’agrégation de Tau, prévient la formation de ces oligomères ainsi que les dommages aux acides nucléiques. Ces résultats suggèrent que l’oligomérisation de Tau prévient la fonction protectrice de Tau vis-à-vis des acides nucléiques. Ce travail met également en lumière l’existence d’une fenêtre critique de vulnérabilité de l’ADN et l’ARN au cours de la progression de la pathologie.Dans le deuxième volet de ce manuscrit, nous nous sommes concentrés sur la relation entre la protéine Tau et l’ARN. Bien que l’interaction de Tau avec l’ARN soit connue depuis une vingtaine d’années, la fonction de cette interaction reste obscure. Notre hypothèse est que Tau pourrait être impliquée dans le métabolisme des ARN. Par stratégie TAP-tag, des partenaires protéiques de Tau ont été purifiés. Parmi eux, la protéine DEAD box protein 6 (DDX6), un acteur du métabolisme des ARN, a été identifiée comme un nouveau partenaire de Tau. DDX6 est une hélicase à ARN impliquée notamment dans la voie de régulation de l’expression génique par les microARN. Ce second projet vise à caractériser, comprendre la fonction de ce complexe ainsi que son impact dans la pathogénèse des tauopathies. Nous avons confirmé l’interaction entre Tau et DDX6 puis identifié les séquences de Tau impliquées dans ce complexe. Nos résultats suggèrent que l’interaction de Tau avec DDX6 stimule l’activité du microARN Let-7a. De manière particulièrement intéressante, des mutations de Tau responsables de formes familiales de tauopathies altèrent l’interaction Tau/DDX6 et abolissent l’effet de Tau sur l’activité du microARN Let-7a. L’ensemble de ces résultats met en évidence un rôle atypique de Tau, non décrit à ce jour, dans la voie de régulation du microARN Let-7a. Cette nouvelle fonction ouvre des perspectives sur le rôle de Tau dans le métabolisme des ARN et suggère un impact de la pathologie Tau sur la régulation de la voie des microARN. / Tauopathies are neurodegenerative disorders characterized by a progressive intraneuronal accumulation of hyperphosphorylated Tau leading to neuronal death. The most well-known tauopathy is Alzheimer Disease (AD). Numerous studies suggest that oxidative stress is one of the early mechanisms involved in AD. An increase in oxidative DNA and RNA damage occurs at early stages of AD. The mechanisms underlying the alteration of nucleic acid integrity during the course of AD are unclear. In addition to its well-described role in microtubule stabilization, Tau is an essential player in the protection of neuronal nucleic acid integrity. Indeed, we recently reported that Tau protect DNA and RNA integrity in vivo under physiological and hyperthermic conditions, which is known to be a strong inducer of oxidative stress. However, no study has been conducted to test the effects of Tau pathology on the protective function of Tau. This is the first objective of my thesis.To do that, we used a transgenic Tau pathology mouse model. With age, these mice develop a progressive Tau hyperphosphorylation and aggregation. We demonstrate, in this model, that hyperthermia selectively induces nucleic acid damage in neurons that display early Tau pathology without Tau fibrils. In these neurons, nucleic acid damage is strictly correlated with prefibrillar Tau oligomers. A similar association between prefibrillar Tau oligomers and nucleic acid oxidative damage was observed in AD brains. Pretreatment with Methylene Blue (MB), a Tau aggregation inhibitor reduced hyperthermia-induced Tau oligomerization as well as nucleic acid damage. These results suggest that Tau oligomerization triggers the loss of the nucleic acid protective function of Tau. This study highlights the existence of a critical window of DNA and RNA vulnerability during the progression of Tau pathology.In the second part of this manuscript, we have focused on the relationship between Tau and RNA. It has been reported that Tau bind to RNA. Although this interaction has been known for 20 years, the function of this interaction is still unclear. Based on this observation, we hypothesize that Tau is involved in RNA metabolism. Proteins interacting with Tau have been purified using the tandem affinity purification methodology. Thus, the DEAD box protein 6 (DDX6), known to be an actor of RNA metabolism, has been identified as a new Tau partner. DDX6 is a RNA helicase implicated in miRNA gene silencing mechanism. This project aims to understand Tau-DDX6 complex function in physiological conditions and its impact on tauopathies. We validate the interaction between Tau and DDX6, and identify Tau sequences involved in the interaction. Our results suggest that Tau-DDX6 complex enhance Let-7a activity. Interestingly, Tau mutations involved in inherited tauopathies impair Tau-DDX6 interaction and abolish the effect of Tau on Let-7a activity. All these results highlight a new and atypical function of Tau in microRNA pathway. This undescribed function offers promising prospects for the role of Tau in RNA metabolism and suggest a potential impact of Tau pathology on regulation of microRNA pathway.

Les maladies dites ''conformationnelles'' sont caractérisées par un mauvais repliement des protéines qui, de ce fait, ne peuvent plus assurer leur fonction biologique. C'est le cas des amyloses, ces pathologies impliquent des protéines ayant la capacité de s'agréger pour former des structures spécifiques appelées « fibres amyloïdes ». Aujourd'hui, une trentaine de protéines humaines sont connues pour former ce type de fibres et notamment la protéine tau. Celle-ci est associée à plusieurs maladies neurodégénératives, regroupées sous le terme de « tauopathies », incluant la maladie d'Alzheimer. En conditions physiologiques, tau est associée aux microtubules et régule leur polymérisation. Dans les tauopathies, elle devient hyperphosphorylée et s'agrège dans les neurones sous forme de neurodégénérescences fibrillaires (NFTs) toxiques. Les protéines chaperons et particulièrement la protéine de choc thermique de 90 kDa, Hsp90, régule l'homéostasie de la protéine tau. L'interaction entre tau et Hsp90 implique différentes régions de la protéine tau dont celle contenant un hexapeptide de séquence VQIVYK. Ce court fragment est nécessaire et suffisant pour induire la fibrillation de la protéine tau entière in vivo. Cet hexapeptide est également capable, à lui seul, de former des fibres amyloïdes, in vitro, comparables à celles retrouvées in vivo. Nous avons donc choisi d'utiliser l'hexapeptide VQIVYK comme modèle d'étude de la fibrillation, in vitro, et testé l'effet de Hsp90 sur les processus agrégatifs du peptide. Nous avons démontré que Hsp90 interagit spécifiquement avec les structures amyloïdes formées par le peptide et qu'elle est capable d'inhiber à la fois la polymérisation et la dépolymérisation des fibres. Ce rôle antagoniste joué par Hsp90 permet la stabilisation d'espèces amyloïdes intermédiaires supposées moins neurotoxiques. Ces résultats confirment l'implication de Hsp90 dans les processus agrégatifs de la protéine tau et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques contre les pathologies neurodégénératives. De plus, cette étude apporte des éléments de réponse sur le fonctionnement des chaperons moléculaires vis-à-vis de leur protéine cliente. / Conformational diseases are characterized by protein misfolding which causes a loss of biological activity. Amyloidosis is one of these diseases, and it involves the ability of proteins to self-aggregate into specific structures called “amyloid fibers”. At least thirty human proteins, including tau, are known to form amyloid fibers. The tau protein is linked to several neurodegenerative diseases called tauopathies, including Alzheimer’s disease. Tau is in physiological conditions associated with microtubules and regulates their polymerization. In tauopathies, tau becomes hyper-phosphorylated and aggregates into neurotoxic neurofibrillary tangles (NFTs). Molecular chaperones, and particularly the 90-kDa heat shock protein (Hsp90), regulate tau homeostasis. The interaction between tau and Hsp90 involves several tau regions including the sequence VQIVYK. This short fragment is necessary and sufficient on its own to induce aggregation of the full tau protein in vivo. In vitro this hexapeptide is also able to form amyloid fibers similar to those found in vivo. We therefore used this hexapeptide as an in vitro model to study the process of amyloid fibrillation and to test Hsp90’s effects on it. We demonstrated that Hsp90 interacts specifically with peptide fibrillar structures and that Hsp90 is able to inhibit both the polymerization and depolymerization processes. This antagonistic role for Hsp90 allows the stabilization of intermediate amyloid species that may display a lower neurotoxicity. These results confirm that Hsp90 is involved in tau’s aggregation process and paves the way for new therapeutic perspectives in neurodegenerative diseases. Our study also provides clues to the understanding of how molecular chaperones assist in the folding of their client proteins.

Alzheimer’s disease (AD) is characterised by two major histological hallmarks; neurofibrillary tangles (NFT) and neuritic plaques. But, unlike plaques, the degree of NFT deposition in the brain correlates to the severity of clinical symptoms of neuronal dysfunction. The major constituent of NFT is hyperphosphorylated tau protein. The involvement of neuropsychological testing, neuroimaging techniques and biochemical measurement of cerebrospinal fluid markers (amyloid beta and tau proteins) have improved the sensitivity and specificity of AD diagnosis. But these diagnostic methods are challenged by individual’s education level, high cost and its invasiveness, hence the need for an alternative analysis platform that overcome these challenges. Peripheral blood fulfils the criteria as a suitable medium to evaluate AD diagnostic markers. Since NFT deposition correlates with neuronal dysfunction severity and the NFT is constituted mainly of hyperphosphorylated tau protein then, the evaluation of tau in peripheral blood could provide useful information about AD progression. As tau protein in blood is susceptible to thrombin degradation, tau may be enwrapped in a vesicle such as extracellular vesicles (ECVs). The ECVs are formed when a multivesicular body fuses with the plasma membrane and release its contents into the extracellular milieu. The formation and release of these ECVs are ubiquitous and cell type specific. Besides, ECVs contain several cargo molecules such as proteins, and it can cross the blood brain barrier into peripheral blood. Therefore, blood-based neuron derived extracellular vesicles (ndECVs) could be a dependable source to measure AD-like tau protein. At present, the significance of tau protein in blood-based ndECVs for the diagnosis of AD remains largely unclear. Hence, this study aimed to quantify tau protein in peripheral blood ndECVs using flow cytometry technique and evaluate the significance of this measured proteins in the diagnosis of AD. This study set the following objectives: (1) Establish a protocol for the isolation and characterization of ECVs and ndECVs using western blot and flow cytometry techniques, (2). Use the flow cytometry platform to quantify tau protein in the ndECVs of clinical patients who had already undergone clinical diagnostic (such as CSF tau, CSF p-tau, CSF β-amyloid or MMSE evaluation). (3).Evaluate the significance of tau protein in the ndECVs as a potential biomarker for AD. Using the bead-assisted technique ECVs and ndECVs were isolated from serum and analysed. This study made attempt to measure tau protein in peripheral blood ndECVs using flow cytometry technique. While quantification of tau protein by flow cytometry platform posed a challenge, ELISA technique was used as alternative to measure the proteins in the ECVs. Tau protein was measured in some of the ndECVs, but study did not observe any significant correlation between measured tau protein in ndECVs and the validated diagnostic markers (CSF tau, CSF p-tau, CSF β-amyloid or MMSE evaluation). Of interest was the trend for a negative correlation between serum tau protein and CSF β-amyloid. Peripheral blood is a relevant source for tau protein measurement and therefore more studies are needed to evaluate the significance of blood serum tau content as a diagnostic biomarker for AD.:TABLE OF CONTENT LIST OF ABBREVIATION III LIST OF FIGURES V 1. INTRODUCTION 1 1.1. ALZHEIMER’S DISEASE 1 1.1.1. The neuritic plaque 2 1.1.2. The neurofibrillary tangles 2 1.1.3. Pathophysiology of NFT 3 1.2. EPIDEMIOLOGY AND SOCIO-ECONOMIC BURDEN OF ALZHEIMER’S DISEASE 4 1.3. CLINICAL DIAGNOSIS OF ALZHEIMER’S DISEASE 5 1.4. CHALLENGES ASSOCIATED WITH THE CURRENT DIAGNOSIS OF AD 7 1.5. EXTRACELLULAR VESICLES 8 1.5.1. Formation of ECVs (ectosomes and exosomes) 9 1.5.2. Size, density and composition of ECVs 9 1.5.3. Functions of central nervous system ECVs 10 1.6. TAU PROTEIN, ECVS AND PERIPHERAL BLOOD 11 1.7. AIM OF THE STUDY 13 1.8. OBJECTIVES 13 2. METHODOLOGY 15 2.1. STUDY DESIGN 15 2.2. ETHICAL ISSUES 15 2.3. MATERIALS 15 2.4. METHODS 21 2.4.1. Blood sampling 21 2.4.2. SH-SY5Y Cell culture processing 21 2.4.3. Isolation of ECVs 22 2.4.4. Detection, characterization and quantification of ECVs and the cargo tau protein 26 2.5. STATISTICAL ANALYSIS 31 3. RESULTS 32 3.1. ESTABLISHMENT OF PROTOCOL FOR THE ISOLATION AND CHARACTERISATION OF ECVS 32 3.1.1. Precipitation versus ultracentrifugation techniques of isolating ECVs 32 3.1.2. Purification of ECVs using iodixanol or sucrose density gradient 33 3.1.3. Demonstration of other marker proteins of ECVs 34 3.1.4. Analysis of reproducibility 36 3.1.5. ECVs’ density determination 37 3.1.6. Comparing serum and plasma as ideal starting material 41 3.1.7. Optimal minimum starting volume of serum 43 3.1.8. Isolation of ndECVs from ultracentrifuge or pre-cleaned serum 44 3.2. DETECTION AND QUANTIFICATION OF ECVS’ CARGO PROTEINS, HSP70 AND TAU 45 3.2.1. western blot technique 46 3.2.2. Flow cytometry 47 3.2.3. ELISA as an alternative approach to quantify of tau protein in ndECVs 49 4. DISCUSSION 56 4.1. BASIS FOR CONSIDERING BLOOD-BASED MARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF AD 56 4.2. BASIS FOR TARGETING TAU PROTEIN IN PERIPHERAL BLOOD 57 4.3. POTENTIAL ROLE OF NDECVS IN THE TRANSPORTATION OF TAU PROTEIN 58 4.4. ESTABLISHMENT OF PROTOCOL FOR ISOLATION AND CHARACTERISATION OF ECVS 59 4.4.1. Precipitation versus ultracentrifugation 60 4.4.2. Purification of ECVs by density gradient technique 61 4.4.3. Detection of ECVs’ cargo protein using western blot technique 63 4.4.4. ECVs isolation using the Bead-assisted technique 64 4.4.5. Isolation of cell type specific ECVs (ndECVs) 65 4.4.6. Comparison of plasma and serum as a source of ndECVs 66 4.5. DETECTION AND QUANTIFICATION OF ECVS’ CARGO PROTEINS (HSP70 & TAU) 67 4.5.1. Flow cytometry analysis 67 4.5.2. ELISA analysis 68 4.5.3. Tau protein in the ECVs of hibernating animals 71 5. CONCLUSION 73 6. REFERENCES 74 7. APPENDICES 100 7.1. CURRICULUM VITAE 100 7.2. PUBLICATIONS 101 7.3. DECLARATION OF THE INDEPENDENT WRITING OF THIS THESIS 103 7.4. ACKNOWLEDGEMENT 104

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Neuronal alterations resulting from exposure to Parkinsonian-inducing 1-methyl-4- phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) in an in vitro model SH-SYSY human neuroblastoma cells were explored using cytotoxic effects, neurochemical changes and pathological injury as endpoints. The results suggested that: MPTP entered the SH-SYS5Y human neuroblastoma cells through a non-dopamine transport mechanism, and was metabolized to 1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridium (MPDP⁺) and 1-methyl-4-phenylpyridium (MPP⁺) by monoamine oxidase (MAO). MPP⁺, the neurotoxic analog of MPTP, was taken up into cells through a dopamine (DA) uptake mechanism. MPTP, via its metabolite MPP⁺, inhibited NADH dehydrogenase activity. The MPTP-induced alterations of morphology included formation of blebs, attenuated neutrites, abnormal mitochondria with electron-density of matrix and disorganization of cristae, and abnormal aggregation of filamentous material of the cytoskeleton. MPTP was neurotoxic to the dopaminergic system, inhibiting monoamine oxidase (MAO) activity, and decreasing levels of dopamine (DA) and other catecholamines. In addition, MPTP enhanced ³H-DA release from cells, and its metabolite MPP⁺ inhibited ³H-DA uptake. MPTP was found to directly act on the cholinergic system in SH-SY5Y cells, causing dose-related decreases in the binding at muscarinic and nicotinic receptors. MPTP also inhibited acetylcholinesterase (AChE) activity and increased choline levels. The MPTP-induced increase in DA release and the decreases in catecholamines in SH-SYSY cells were blocked by pretreatment with acetylcholine receptor antagonists atropine and d-tubocurarine. MPTP caused increases in tau proteins, and also caused an increased expression of the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) product after treatment for 2 to 5 days at 10⁻³ to 10⁻⁴ M. The results, for the first time, demonstrated that MPTP affected cytoskeletal associated tau protein and altered its mRNA. These results demonstrated that the human neuroblastoma cell line, SH-SYSY, can be used as an in vitro model for the study of the neurotoxicity of MPTP, including the mechanisms associated with exposure to this neurotoxicitant. / Ph. D.

Les protéines qui ne possèdent pas de structure unique dans leur forme fonctionnelle constituent la classe des protéines intrinsèquement dépliées (IDPs). Ces dernières sont ubiquitaires dans une cellule et sont connues pour former des agrégats impliqués dans une large variété de maladies. Malgré leurs conformations étendues qui résultent en une large interface avec l'eau environnante, très peu d'informations sont connues sur l'interaction des IDPs avec l'eau. L'eau est parfois appelée la matrice de la vie car elle est indispensable à la plupart des processus biologiques, tels que le repliement, la stabilité ou l'activité des protéines. La protéine tau est une IDP qui régule la dynamique de croissance des microtubules dans les neurones, et dont la fibrillation en fibres de type amyloïde est l'une des marques caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Ce projet de thèse se propose d'explorer l'importance biologique de la dynamique de l'eau autour des IDPs. Nous combinons des méthodes expérimentales et computationnelles, incluant la diffusion incohérente de neutrons, la spectroscopie terahertz, la diffusion de rayons X aux petits angles, et les simulations de dynamique moléculaire, dans le but d'étudier la dynamique de l'eau d'hydratation de la protéine tau, dans ses formes native et fibrillaire. Pour les IDPs comme pour les protéines globulaires, il est montré que la diffusion translationnelle de l'eau d'hydratation permet l'existence des mouvements de larges amplitudes de la protéine, indispensables à la fonction biologique de cette dernière. En comparant avec la forme native, nous mettons aussi en évidence une augmentation de la mobilité de l'eau d'hydratation de la forme fibrillaire de tau. Nous proposons que cette augmentation joue un rôle dans la formation des fibres. De plus, l'étude de la dynamique collective de l'eau d'hydratation montre que la protéine tau influence un volume d'eau deux fois moindre qu'une protéine globulaire équivalente, ce qui pourrait être impliqué dans son mécanisme de liaison avec un partenaire. En conclusion, en étudiant les propriétés dynamiques de l'eau autour des IDPs, ces travaux de thèse suggèrent que la dynamique de l'eau d'hydratation pourrait jouer un rôle fondamental dans les mécanismes de liaison et de fibrillation des IDPs. / Proteins that do not have a well-defined structure in their functional state are referred to as intrinsically disordered proteins (IDPs). IDPs are ubiquitous in biological cells and their aggregation is involved in many diseases. The extended conformations of IDPs result in a large water interface, yet, interactions between IDPs and water are only scarcely documented. Water has been termed the matrix of life because it is essential for a variety of molecular processes, including protein folding, stability, and activity. The IDP tau regulates microtubule activity in neurons and is known to form amyloid fibers that are one of the hallmarks of Alzheimer disease. In this PhD thesis, the biological relevance of water dynamics around IDPs is addressed. We combine computational and experimental approaches, including all-atom MD simulations, incoherent neutron scattering, terahertz spectroscopy and small angle X-ray scattering, to study the hydration water dynamics of the tau protein in its native and fibrillated states. Firstly, a translational diffusion of hydration water molecules is found to be essential for biologically relevant dynamics of both IDPs and globular proteins. Secondly, compared to monomers, we find an enhancement of hydration water mobility around tau amyloid fibers that is suggested to play a role in fiber formation. Finally, the investigation of collective water dynamics reveals that the tau protein influences about two times less water molecules than a globular protein, which might be involved in tau's binding mechanisms. In conclusion, this piece of work investigated the dynamical properties of water around IDPs and suggests that the hydration water dynamics might play fundamental roles in binding and aggregation of IDPs.

Le terme dégénérescence lobaire frontotemporale ou FTLD définit un groupe hétérogène de maladies neurodégénératives caractérisé par des troubles du langage, du comportement et/ou moteurs qui résultent principalement d’une dégénérescence du cortex frontal et temporal. Cette hétérogénéité tant au niveau clinique, génétique que neuropathologique rend cette pathologie très complexe et il existe aujourd’hui un véritable problème de diagnostic différentiel des FTLD. Le diagnostic final des FTLD repose ainsi sur l’examen neuropathologique, la nature des lésions observées et leurs constituants moléculaires. La caractérisation de ces lésions a permis d’établir une classification des FTLD qui ne cesse d’évoluer avec la découverte de nouveaux acteurs moléculaires. À l’instar de nombreuses maladies neurodégénératives, les FTLD sont caractérisées par la présence de protéines agrégées dans les régions cérébrales affectées. Cependant, contrairement à la maladie d’Alzheimer (MA), ces agrégats ne sont pas toujours constitués des mêmes protéines. Ainsi, approximativement 40% des cas de FTLD présentent des agrégats composés de protéines Tau hyper et anormalement phosphorylées, et forment le groupe FTLD-Tau. Lorsqu’aucune pathologie Tau n’est détectée, les patients présentent généralement des inclusions neuronales cytoplasmiques ou intranucléaires immunoréactives pour la protéine TDP-43 (transactive response DNA binding protein 43), et constituent la sous-classe FTLD-TDP. Plus rarement, la protéine FUS (Fused in Sarcoma, FTLD-FUS) ou des protéines liées au système ubiquitine protéasome peuvent également s’agréger (FTLD-UPS). La génétique représente également une composante majeure des FTLD avec 10 à 15% des cas correspondant à des formes héréditaires dominantes. Les premières mutations furent découvertes sur le gène MAPT. Le gène de la progranuline (GRN) fut ensuite identifié comme fréquemment associé aux FTLD. Plus récemment, une répétition anormale d’héxanucléotides GGGGCC au sein du gène C9ORF72 (chromosome 9 open reading frame 72) a été montrée comme étant responsable d’un grand nombre de cas familiaux de FTLD. De manière moins fréquente, d’autres gènes tels que VCP (valosin containing protein) ou CHMP2B (charged multivesicular body protein 2B) peuvent aussi être associés à des cas familiaux de FTLD. Des années avant la découverte des principaux acteurs moléculaires des FTLD, des études ont décrit une perte partielle ou totale des protéines Tau physiologiques dans le tissu cérébral. A l’origine, ce phénomène fut observé dans un groupe de démences appelées DLDH pour démences sans signe histopathologique distinctif (plus tard appelé FTLD-ni pour no inclusion). En 2006, la majorité de ces cas a été reclassée en tant que FTLD-U (présence de lésions immunoréactives pour l’ubiquitine). En revanche, aucune étude ne s’est intéressée à cette perte de Tau depuis celle de Zhukareva et collègues en 2003. Au regard des récentes avancées sur la compréhension de la base moléculaire et génétique des FTLD, la pertinence de cette perte de Tau reste ainsi encore à déterminer. Dans ce contexte, ce travail de recherche a pour principal objectif d’étudier l’expression des protéines Tau au sein du tissu cérébral d’individus sains ou atteints de différents troubles neurodégénératifs (MA, FTLD-Tau, FTLD-TDP-GRN, FTLD-TDP-C9ORF72, FTLD-TDP et FTLD-FUS sporadiques) en utilisant la technique d’immunoempreinte. De manière remarquable, nous avons mis en évidence une réduction significative de Tau, et ce, spécifiquement chez les patients FTLD-TDP-GRN. Ainsi, nos résultats démontrent que ces cas, appelés FTLD-TDP-GRNltau (pour low Tau protein level), caractérisés par une altération synaptique et une astrogliose très importante, pourraient constituer un groupe distinct dans la classification des FTLD [...] / FTLD is a clinical syndrome mainly characterized by progressive deterioration in behavior, personality and/or language resulting from progressive frontal and temporal degeneration. In addition, movement disorder can also be frequently observed. Given this phenotype variability, FTLD clinical diagnosis remains difficult and uneasy to establish with certainty.The final diagnosis relies on neuropathological examination of the brain, the characteristics of these brain lesions and their molecular basis. Indeed, as many neurodegenerative diseases, FTLD are characterized by the presence of protein aggregates in the affected brain regions. However, in contrast to the well-characterized nature of protein inclusions in Alzheimer’s disease (AD), proteinaceous aggregates in FTLD can be composed of different proteins. Thus, approximatively 40% of FTLD cases display aggregates made of abnormally and hyperphosphorylated Tau proteins and constitute the FTLD-Tau subclass. However, most of FTLD brains are negative for Tau inclusions and exhibit neuronal cytoplasmic and/or nuclear inclusions immunoreactive for transactive response DNA binding protein 43 (TDP-43) and constitute the FTLD-TDP subclass). To a lesser extent, another protein called FUS (Fused in Sarcoma protein) is found in aggregates that are Tau and TDP-43 negative. This subclass is thus named FTLD-FUS. Finally, inclusions negative for Tau, TDP-43 or FUS are observed in rare cases of FTLD and associated with ubiquitin-proteasome system related proteins (FTLD-UPS).Gene mutations also play an important role in FTLD with 30 to 50% of patients reporting a positive family history of FTD and 10 to 15% of patients corresponding to dominantly inherited form. Firstly described are the MAPT mutations. Mutations in the progranulin gene GRN were then found to be the most frequent mutations associated with FTLD. More recently, two studies demonstrated that expanded hexanucleotide GGGGCC repeats in a noncoding region of the chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) gene was responsible for a large proportion of FTLD. Less frequently mutations in the valosin containing protein (VCP) gene or charged multivesicular body protein 2B (CHMP2B) gene are also found associated with FTLD.Prior to the discovery of the main molecular actors of FTLD, studies described a partial or total loss of soluble or physiological Tau protein expression in both grey and white matter. This loss of Tau was originally found in a subset of dementia called DLDH for Dementia Lacking Distinctive Histopathology (renamed later FTLD-ni for FTLD with no inclusion). In 2006, most of these cases were reclassified as FTLD-U (presenting with ubiquitin positive inclusions). However, additional investigation with specific regards to this loss of Tau expression has not been reported since Zhukareva et al. in 2003. With the progress in genetics and neuropathology of FTLD, the question of whether this reduction of Tau expression is seldom remains ill-defined.This work takes place in this context whose primary goal was to investigate human brain Tau protein expression in Control, AD, FTLD-Tau, FTLD-TDP-GRN, FTLD-TDP-C9ORF72, sporadic FTLD-TDP and sporadic FTLD-FUS brains using western blot analysis. Remarkably, we demonstrated a huge reduction of all six human brain Tau isoforms only in a subset of FTLD-TDP brains with mutation on the GRN gene. Thus, our data clearly suggest that these specific cases, referred to as FTLD-TDP-GRNltau (for low levels of Tau protein), could be part of the current classification as a distinct entity with more severe synaptic dysfunction and astrogliosis. Beside this, we also performed a comparative proteomic study between the different FTLD sub-classes in order to find common physiopathological mechanisms.