Abstract Oxygen deprivation (hypoxia) is related to many disease conditions, such as anemia, but is also a critical regulatory signal during normal development. Cellular responses to hypoxia are largely mediated through alterations in gene regulation brought about by the transcription factor known as hypoxia inducible facor (HIF). One of the most extensively studied systemic consequences of hypoxia is the induction of red blood cell production, erythropoiesis, which occurs through a HIF-dependent increase in erythropoietin (EPO) gene expression. The amount of HIF in cells is regulated by three HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) while a fourth P4H possessing a transmembrane domain (P4H-TM) is able to act on HIF at least in vitro. The putative role of P4H-TM in regulating erythropoiesis is studied here by administering a HIF-P4H inhibitor, FG-4497, to P4h-tm null and wild-type mice. By comparing the observed effects with those seen in FG-4497 treated hypomorphic Hif-p4h-2 and Hif-p4h-3 null mice, it is demonstrated for the first time that P4H-TM is involved in the regulation of Epo production in the mammalian kidney, but not in the liver. Long bones are formed via endochondral ossification, in which a cartilaginous template, the growth plate, is first laid down and then replaced with bone. The growth plate is rich in extracellular matrix (ECM) and contains a hypoxic central region in which HIF has been shown to regulate chondrocyte function. Importantly, growth plate chondrocytes are highly active in collagen synthesis. Collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs I-III) provide collagen molecules with thermal stability and are thus necessary for the formation of a proper ECM. Through an in vitro approach it is demonstrated that hypoxia increases the amount and activity of C-P4H in primary mouse epiphyseal growth plate chondrocytes in a HIF-1-dependent manner. Lastly, it was set out to characterize mouse lines with complete inactivation of C-P4H-II with or without partial inactivation of C-P4H-I. A significant reduction in the total amount of C-P4H and its activity was found to result in mild chondrodysplasia and altered bone properties. The above mouse models provided new information on the specific in vivo roles of the C-P4H isoenzymes I and II. / Tiivistelmä Kudosten alentunut happipitoisuus (hypoksia) liittyy osana moniin elimistön patologisiin tiloihin, kuten anemiaan. Lisäksi se on tärkeä säätelytekijä normaalin yksilönkehityksen aikana. Jotta solut havaitsisivat hypoksian ja reagoidakseen siihen, on niille kehittynyt säätelyjärjestelmä, jossa hypoksiassa indusoituva transkriptiotekijä, HIF, on tärkeässä asemassa. Yksi merkittävin HIF:n indusoima systeeminen vaikutus elimistössä on punasolujen tuotannon, erytropoieesin, kiihtyminen. Sitä tapahtuu erytropoietiinia koodittavan geenin (EPO) lisääntyneen ilmentymisen kautta. HIF-tekijän määrää soluissa säätelee kolme HIF-prolyyli-4-hydroksylaasientsyymiä (HIF-P4Ht 1-3). Transmembraanisen prolyyli-4-hydroksylaasin (P4H-TM) tiedetään myös vaikuttavan HIF-tekijän määrään soluissa in vitro, mutta sen vaikutusta nisäkkään erytropoieesiin ei ole aiemmin tutkittu. Käyttämällä hyväksi kolmea eri transgeenista hiirilinjaa (P4h-tm-/-, Hif-P4h-2gt/gt, Hif-p4h-3-/-) ja HIF-P4H entsyymeitä inhiboivaa lääkeainetta, FG-4497, tässä työssä osoitettiin ensimmäistä kertaa, että P4H-TM osallistuu nisäkkään Epo-hormonin tuoton säätelyyn. Pitkät luut muodostuvat endokondraalisen luutumisen kautta. Siinä ensin muodostuu rustoinen malli, kasvulevy, joka vähitellen korvaantuu luukudoksella. Kasvulevyn sisin kerros on sen soluille, kondrosyyteille, hypoksinen kasvuympäristö. HIF:illä on todettu olevan tärkeä rooli kondrosyyttien toiminnan säätelijänä. Kasvulevyn soluvälitila sisältää runsaasti kollageeneja. Kollageenin prolyyli-4-hydroksylaasit (C-P4Ht I-III) ovat avainasemassa kollageenien biosynteesissä ja siten niiden toiminta on välttämätöntä kestävän soluvälitilan muodostumiselle. Käyttämällä in vitro menetelmiä, tässä työssä osoitettiin, että hiiren epifyseaalisten kasvulevyjen kondrosyyteissä hypoksia lisää C-P4H:n määrää ja aktiivisuutta HIF-tekijästä riippuvalla mekanismilla. Eri C-P4H-isoentsyymeiden toiminnasta ja merkityksestä in vivo tiedetään vain vähän. Tässä työssä karakterisoitiin hiirilinja, jossa C-P4H-II on täysin inaktiivinen, ja hiirilinja, jossa lisäksi C-P4H-I on osittain inaktiivinen. Merkittävästi alentuneen C-P4H:n aktiivisuuden todettiin aiheuttavan hiirimallissa lievän kondrodysplasian sekä heikentyneet luun ominaisuudet.

Abstract Breast cancer is the most common cancer affecting the female population of the Western world. It is a heterogeneous disease entity that encompasses tumors with remarkably different forms of behaviour, and it is therefore vital to distinguish patients with good and poor prognoses. The classical prognostic and predictive factors for breast cancer serve as tools for clinical oncologists when planning treatment, but the growing awareness of breast cancer biology is bringing about a need for novel prognostic and predictive biomarkers. This thesis examines the prognostic significance of hypoxia response and cell cycle regulators in ductal breast cancer and in triple-negative breast cancer (negative for hormone receptors and human epidermal growth factor receptor 2), concluding that PHD2 and PHD3 are associated with a good prognosis, while the role of PHD1 is controversial, as it is associated with proliferation in ductal breast cancer but with node-negative status in triple-negative breast cancer. In our experiments HIF-1α redeemed its role as a marker of an adverse prognosis, whereas the role of HIF-2α appeared to be the opposite. Our data suggest that PHDs can have other targets than the HIF-αs, and that triple-negative breast tumors express more HIF-1α and less HIF-2α and PHD3 than those with a good prognosis. Furthermore, we identified cyclin D1 as a biomarker with independent prognostic significance in ductal breast cancer, being associated with good prognostic factors and a better outcome, whereas the opposite was seen in triple-negative breast cancer. CDK4 was associated with high proliferation in triple-negative breast cancer. In addition, high levels of p16 correlated with increased survival in breast cancer patients independently of receptor status. / Tiivistelmä Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä läntisessä maailmassa. Rintasyöpä on heterogeeninen tautiryhmä, jossa kasvaimet vaihtelevat biologiselta käyttäytymiseltään huomattavasti. Tästä syystä on tärkeää erottaa hyvä- ja huonoennusteiset potilaat. Syöpälääkärit käyttävät klassisia ennustetekijöitä hoitopäätöksiä tehdessään, mutta lisääntynyt tieto rintasyövän biologiasta on saanut aikaan tarpeen löytää uusia ennustetekijöitä. Tässä väitöskirjatyössä tutkimme hypoksiavasteen ja solusyklin säätelijöiden ennusteellisuutta duktaalisessa rintasyövässä sekä kolmoisnegatiivisessa (ei ilmennä hormonireseptoreita eikä epidermaalikasvutekijäreseptoria) rintasyövässä. PHD2 ja PHD3:n vahva ilmentyminen liittyi parempaan ennusteeseen, mutta PHD1:n esiintymisen vaikutus oli ristiriitainen. PHD1:n ilmentyminen liittyi lisääntyneeseen solujakautumiseen duktaalisessa rintasyövässä, mutta kolmoisnegatiivisessa rintasyövässä sen esiintyminen liittyi vähentyneeseen imusolmukemetastasointiin. Tutkimuksessamme HIF-1α osoittautui huonon ennusteen merkiksi. Sitä vastoin HIF-2α:n ilmentymisen vaikutus näytti liittyvän parempaan ennusteeseen. Tuloksemme osoittavat, että PHD-entsyymeillä on mahdollisesti muitakin kohteita kuin HIF-α:t. Osoitimme myös, että HIF-1α:n ilmentyminen on yleisempää ja HIF-2α:n sekä PHD3:n ilmentyminen vähäisempää kolmoisnegatiivisessa kuin duktaalisessa rintasyövässä. Lisäksi totesimme, että sykliini D1 on itsenäinen ennustetekijä liittyen parempaan ennusteeseen duktaalisessa rintasyövässä. Huomioitavaa on kuitenkin, että kolmoisnegatiivisessa rintasyövän alaryhmässä sykliini D1:n esiintyminen oli huonon ennusteen merkki. CDK4 osoittautui voimakkaan proliferaation merkiksi kolmoisnegatiivisessa rintasyövässä. Lisäksi osoitimme, että p16:n ilmentyminen liittyy parempaan ennusteeseen sekä duktaalisessa rintasyövässä että kolmoisnegatiivisessa rintasyövässä.

Abstract Oxygen homeostasis is critical to all animals, as both excess (hyperoxia) and reduced (hypoxia) levels of oxygen can result in pathological changes and ultimately in the loss of cellular and organismal viability. Complex systems have evolved to sense and adapt to changes in cellular oxygen availability, and the hypoxia-inducible factor HIF plays a pivotal role in this elaborate molecular network. In normoxic conditions the α-subunit of HIF becomes hydroxylated by HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs 1-3), earmarking HIF-α for proteasomal degradation. Additionally, in the presence of oxygen the hydroxylation of an asparagine residue by the HIF asparaginyl hydroxylase FIH inhibits the transactivation of HIF-target genes by blocking the interaction of HIF-α with a transcriptional coactivator. In addition to being a feature of an organism’s normal life, hypoxia is also characteristic of many common diseases such as severe anemia and myocardial infarction, and it notably decreases these hydroxylation reactions, as HIF-P4Hs and FIH have an absolute requirement for oxygen as a cosubstrate. HIF-α thus escapes degradation and translocates into the nucleus, where it dimerizes with HIF-β and recruits transcriptional coactivators to the hypoxia-response elements of target genes, inducing their transcription and triggering the hypoxia response aimed at restoring cellular oxygen homeostasis. In this study we generated a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorphic mouse line that expresses only 8% of the wild-type HIF-P4H-2 mRNA in the heart. We showed that chronic cardiac HIF-P4H-2 deficiency leads to stabilization of HIF-1α and HIF-2α and protects the heart against acute ischemia-reperfusion injury without causing any adverse effects. Furthermore, we identified and cloned a novel human transmembrane prolyl 4-hydroxylase P4H-TM and showed that it regulates HIF-1α protein levels in cellulo and hydroxylates HIF-1α in vitro similarly to the HIF-P4Hs, but may also have other physiological substrates. Using forward genetic tools we showed that lack of P4H-TM during development leads to basement membrane defects and compromised kidney function in zebrafish embryos. Finally, we demonstrated that FIH displays substrate selectivity in terms of hydroxylation and binding of HIF-1α and novel substrates Notch1-3. We showed that FIH has higher affinity for oxygen with Notch1 than with HIF-1α as a substrate, implying that FIH-mediated hydroxylation of Notch can continue in oxygen concentrations where HIF-1α hydroxylation would be markedly reduced. / Tiivistelmä Happitasapainon ylläpito on edellytys elimistön normaalille toiminnalle, koska sekä liian korkea (hyperoksia) että liian matala (hypoksia) happipitoisuus ovat elimistölle stressitiloja ja johtavat pitkittyessään haitallisiin seurauksiin. Happipitoisuuden muutosten havaitsemiseksi ja niihin reagoimiseksi onkin elimistössä kehittynyt monimutkainen säätelyjärjestelmä, jossa avainasemassa on hypoksia-indusoituva tekijä HIF. Solun happipitoisuuden ollessa normaali yksi kolmesta HIF prolyyli 4-hydroksylaasi-isoentsyymistä (HIF-P4Ht 1-3) katalysoi kahden proliinitähteen hydroksylaation HIF-α-alayksikössä. 4-hydroksiproliini toimii signaalina HIF-α:n nopealle proteasomaaliselle hajotukselle. Lisäksi HIF asparaginyyli hydroksylaasi FIH:n katalysoima HIF-α:n asparagiinitähteen hydroksylaatio estää transaktivaatiovaikutuksen. Koska HIF-P4Ht ja FIH tarvitsevat kosubstraatikseen happea, nämä hydroksylaatioreaktiot vähenevät happipitoisuuden laskiessa, jolloin HIF-α stabiloituu ja siirtyy solun tumaan, jossa se muodostaa kompleksin HIF-β-alayksikön kanssa ja houkuttelee paikalle tarvittavat kofaktorit. HIF-kompleksi tehostaa hypoksiavasteessa tarvittavien geenien luentaa sitoutumalla tumassa niiden promoottoreihin ja pyrkii näin palauttamaan solun happipitoisuuden normaaliksi. Tässä työssä luotiin geneettisesti muunneltu HIF-P4H-2 hypomorfi-hiirilinja, jonka sydämissä tuottuu vain 8 % normaalista HIF-P4H-2 lähetti-RNA:n määrästä. HIF-P4H-2:n puutoksen havaittiin johtavan HIF-1α:n ja HIF-2α:n stabiloitumiseen sydämessä ja suojaavan sydäntä kudosvaurioilta iskemian ja reperfuusion aikana aiheuttamatta haitallisia vaikutuksia. Tässä väitöskirjassa karakterisoitiin aiemmin tuntematon ihmisen transmembraaninen prolyyli 4-hydroksylaasi, P4H-TM. Sen osoitettiin säätelevän HIF-1α:n määrää soluissa ja katalysoivan HIF-1α:n kahden proliinitähteen hydroksylaatiota in vitro-olosuhteissa HIF-P4H-entsyymien tavoin. Seeprakalamallin avulla näytettiin, että P4H-TM:n puutos kalan kehityksen aikana aiheuttaa tyvikalvopoikkeavuuksia ja johtaa vakavaan munuaisen toiminnan häiriintymiseen seeprakalan poikasissa. FIH:n katalysoiman hydroksylaatioreaktion kineettisiä ominaisuuksia verrattiin tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa aiemmin tunnetun HIF-α substraatin ja uusien Notch substraattien kesken. Tulokset osoittivat, että substraatin sitomisessa ja hydroksylaatiossa on merkittäviä eroja eri substraattien välillä.

Abstract Oxygen is vital for human survival. To ensure its sufficient supply, the body has an intricate system, which involves the circulatory, respiratory and neuroendocrine systems. When oxygen is lacking, a state of hypoxia occurs, and adaptive changes in gene expression increase oxygen delivery to promote survival. The key regulator of the transcriptional hypoxia response is hypoxia-inducible factor (HIF) which targets over 1000 genes. The HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) govern the stability of HIF in an oxygen-dependent fashion. In our studies we investigated whether activation of the hypoxia response through inhibition of either of two distinct HIF-P4Hs, HIF-P4H-2 or P4H-TM would reduce atherosclerosis in mice. We found that inhibition of HIF-P4H-2 led to reductions in numbers of atherosclerotic plaques, and levels of serum cholesterol and inflammation in white adipose tissue and aortic plaques. In addition, HIF-P4H-2 deficient mice had elevated levels of modified LDL-targeting, atheroprotective circulating autoantibodies. The P4H-TM knockout mice also had reduced numbers of atherosclerotic plaques and increased levels of atheroprotective autoantibodies in their sera, but in contrast to the HIF-P4H-2 deficient mice, they also showed a reduction in serum triglyceride levels. To determine how hypoxia alters maternal glucose and lipid metabolism in pregnancy, we studied pregnant mice that were predisposed to a hypoxic condition (15% ambient O2). We found that they had enhanced glucose metabolism due to reduced insulin resistance and an increased flux of glucose to maternal tissues. The hypoxic dams also failed to gain weight and store adipose tissue in the anabolic phase to the same extent as normoxic control dams. These results implicate HIF-P4H inhibition as a novel therapeutic mechanism for atherosclerosis, and suggest that the small molecule HIF-P4H inhibitors currently in clinical trials for renal anemia may have further possible therapeutic applications. In addition, greater understanding of the changes in maternal metabolism that underly reduced fetal growth in hypoxic conditions, and the development of targeted interventions may allow the preservation of fetal growth in cases of maternal hypoxia. / Tiivistelmä Happi on ihmiselle elintärkeää. Tämän vuoksi meille on kehittynyt pitkälle jalostunut verenkierto-, hengitys- ja neuroendokriininen järjestelmä sekä sellaisten geenien ilmentymisen muutoksia, jotka joko lisäävät hapen kuljetusta tai auttavat selviytymään hypoksisissa oloissa, jotta taataan riittävä hapen saanti. Hapen puutteessa hypoksiavaste, jonka tärkein säätelijä on hypoksiassa indusoituva transkriptiotekijä (HIF), aktivoituu. HIF:lla on yli 1000 kohdegeeniä joiden kautta sen vaikutukset välittyvät. HIF-prolyyli-4-hydroksylaasit (HIF-P4H:t) säätelevät HIF:n stabiilisuutta hapesta riippuvaisesti. Tutkimuksessamme selvitimme, vähentääkö hypoksiavasteen aktivointi HIF-P4H-2:n tai P4H-TM:n inhibition kautta ateroskleroosia hiirillä. Tuloksena oli, että HIF-P4H-2:n inhibitio vähensi ateroskleroottisia plakkeja, seerumin kolesterolia ja inflammaatiota valkoisessa rasvakudoksessa sekä plakeissa. Lisäksi hiirillä, joilta puuttui HIF-P4H-2, oli lisääntynyt määrä ateroskleroosilta suojaavia muokattua LDL:ää sitovia autovasta-aineita seerumissa. P4H-TM-poistogeenisillä hiirillä todettiin vastaavasti vähemmän ateroskleroottisia plakkeja ja lisääntynyt määrä ateroskleroosilta suojaavia autovasta-aineita seerumissa. Poiketen HIF-P4H-2-puutteisista hiiristä, niillä oli matalammat seerumin triglyseridi-tasot. Tutkimme raskaina olevia hiiriä, jotka altistimme hypoksisille olosuhteille (15% O2), jotta pystyisimme määrittämään, kuinka hypoksia vaikuttaa äidin sokeri- ja rasva-aineenvaihduntaan. Hypoksiassa raskaana olevilla hiirillä todettiin tehostunut sokeriaineenvaihdunta, joka oli seurausta alentuneesta insuliiniresistenssistä sekä lisääntyneestä sokerin sisäänotosta äidin kudoksiin. Hypoksiassa eivät raskaana olevien hiirten paino eivätkä rasvavarastot lisääntyneet samassa suhteessa normoksiassa raskaana olevien hiirten kanssa. Nämä tulokset tarjoavat uusia mahdollisuuksia HIF-P4H-inhibition käyttämiseen terapeuttisena vaihtoehtona ateroskleroosin hoidossa ja ehkäisemisessä. Kliinisissä kokeissa munuaisperäisen anemian hoidossa olevat HIF-P4H-estäjät voisivat näin ollen saada lisää indikaatioita. Lisäksi korkean ilmanalan aiheuttaman pienipainoisuuden takana olevien aineenvaihdunnan muutoksien ymmärtäminen voi mahdollistaa sikiön kasvun turvaamisen spesifein interventioin.

Abstract Collagens are subject to extensive post-translational modifications, including the formation of 4-hydroxyproline, 3-hydroxyproline and hydroxylysine. These reactions are catalyzed by collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs), prolyl 3-hydroxylases (P3Hs) and lysine hydroxylases (LHs), which belong to the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase family and require oxygen for their reaction. 4-Hydroxyproline residues have for a long time been known to be required for the stability of the collagen triple helix, but the role of prolyl 3-hydroxylation was revealed only a few years ago when mutations in P3H1 and the consequent loss of a single 3-hydroxyproline in collagen I was shown to cause recessive osteogenesis imperfecta. In this thesis the human P3H isoenzymes were expressed as recombinant enzymes, and analyses of their tissue expression and kinetic properties revealed that P3H2 is located in tissues rich in basement membranes and that it hydroxylates collagen IV, the major basement membrane collagen. The roles of the collagen hydroxylases and collagen IV in basement membrane formation were further studied using Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells as an in vitro model for cell polarization. 4-Hydroxyproline also has a pivotal role in the system of cellular response to reduced oxygen levels (hypoxia). At a normal oxygen concentration, two proline residues in the α subunit of the hypoxia-inducible factor (HIF) are 4-hydroxylated by the HIF-P4Hs, which target HIF-α for proteasomal degradation. In hypoxia, the HIF-P4Hs are inactive, and the α subunit thus escapes degradation, dimerizes with a β subunit and after recruiting transcriptional coactivators induces the transcription of hypoxia-responsive genes in order to adapt the cell to hypoxia. Three human HIF-α subunits have been characterized to date, of which the third is known to be subject to extensive alternative splicing, with one of the splicing variants acting as a negative regulator of the hypoxia responsive system. Four novel splicing variants generated from the human HIF-3α locus are characterized here, and the expression of HIF-3α variants has been shown to be upregulated by hypoxia in a HIF-1 dependent manner. Further studies on the binding partners and transcriptional activity of HIF-3α revealed that this subunit has a more complex role in the adaptation of cells to hypoxia than had been expected. / Tiivistelmä Kollageenit ovat valkuaisaineita, joihin kohdistuu useita synteesin jälkeisiä muokkauksia kuten 4-hydroksiproliinin, 3-hydroksiproliinin ja hydroksilysiinin muodostuminen. Näitä reaktioita katalysoivat kollageeniprolyyli-4-hydroksylaasit (C-P4H:t), prolyyli-3-hydroksylaasit (P3H:t) ja lysyylihydroksylaasit (LH:t), jotka kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaasien entsyymiperheeseen ja tarvitsevat happea reaktioonsa. 4-hydroksiproliinitähteiden on kauan tiedetty stabiloivan kollageeninrakenteen, kun taas 3-hydroksiproliinitähteiden merkitys on selvinnyt vasta viime vuosina. Mutaatiot P3H1-isoentsyymiä koodittavassa geenissä ja sen seurauksena yhden ainoan 3-hydroksiproliinitähteen puuttuminen kollageenissa I johtavat vaikeaan luustosairauteen, osteogenesis imperfectaan. Tässä väitöskirjassa ihmisen P3H:t tuotettiin rekombinanttiproteiineina. Tulokset paljastivat, että P3H2 ilmentyy erityisesti kudoksissa, joissa on paljon tyvikalvorakenteita ja että P3H2 hydroksyloi tehokkaasti kollageeni IV:n kaltaisia synteettisiä peptidejä. Lisäksi koiran munuaisten epiteelisoluihin pohjautuvaa in vitro-mallia käytettiin apuna tutkiessamme kollageeneja hydroksyloivien entsyymien ja kollageenin IV roolia tyvikalvon muodostumisessa sekä solujen polarisaatiossa. Kollageenia stabiloivan tehtävänsä lisäksi 4-hydroksiproliinilla on myös merkittävä rooli solujen vasteessa vähähappisille olosuhteille (hypoksia). Normaalissa happiosapaineessa (normoksia), hypoksiaindusoituvan tekijän (HIF) α-alayksikköön muodostuu HIF-P4H entsyymien katalysoimana kaksi 4-hydroksiproliinitähdettä, jotka kohdistavat α-alayksikön proteasomaaliseen hajotukseen. Hypoksiassa HIF-P4H:t eivät kykene toimimaan, jolloin α-alayksikkö säästyy hajotukselta, muodostaa kompleksin β-alayksikön kanssa ja sitoo transkriptiokofaktoreita. HIF-kompleksi kykenee tällöin lisäämään hypoksiassa tarvittavien geenien luentaa. Tänä päivänä tunnetaan kolme HIF α-alayksikköä, joista HIF-3α:sta tiedetään esiintyvän useita erilaisia silmukointimuotoja ja yhden näistä muodoista tiedetään toimivan negatiivisena säätelijänä hypoksiavasteessa. Tässä väitöskirjatyössä on tunnistettu neljä uutta HIF-3α:n silmukointimuotoa ja osoitettu että HIF-3α:n määrä kasvaa hypoksiassa HIF-1:n säätelemänä. Lisäksi sitoutumis- ja transkriptiokokeet paljastivat, että HIF-3α:n rooli hypoksiavasteessa on monimutkaisempi kuin aikaisemmin kuviteltiin.

Abstract Adequate oxygen supply is necessary for aerobic cell survival. Cellular oxygen deprivation, also known as hypoxia, leads to various responses that aim to increase cellular oxygen delivery and reduce oxygen consumption. Oxygen homeostasis is mainly regulated by the hypoxia-inducible factor (HIF), which regulates the expression of over 300 genes in response to hypoxia. The stability of HIF is regulated by the HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs), enzymes that catalyze the hydroxylation of proline residues in HIFα subunits and target them towards proteasomal degradation. HIF-P4Hs require oxygen as a cosubstrate for the reaction, allowing for hypoxic HIF stabilization and target gene induction at low oxygen concentrations. In this study we investigated the role of HIF-P4H-2 in the regulation of red blood cell production, erythropoiesis. We showed that Tibetans living at high altitude have genetically adapted to their hypoxic environment via mutations in the gene encoding for HIF-P4H-2. The Tibetan HIF-P4H-2 D4E,C127S variant showed enhanced hydroxylation of HIFα at low oxygen concentrations, resulting in reduced HIFα protein stabilization under hypoxia. In other studies we used a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorphic mouse line which expresses a reduced amount of wild-type Hif-p4h-2 mRNA in tissues. We showed that these mice develop mild age-dependent erythrocytosis due to splenic extramedullary erythropoiesis, which is independent of serum erythropoietin concentration. In addition, these mice were protected against inflammation-induced anemia, a condition commonly seen in patients with inflammatory diseases. The HIF-P4H-2 hypomorphic mice also had altered basal metabolism in their skeletal muscles, which, together with an increase in mean capillary area, reduced their infarct size after skeletal muscle ischemia-reperfusion injury. These studies suggest that pharmacological HIF-P4H-2 inhibition may provide a novel treatment for EPO-resistant anemias and peripheral artery disease. / Tiivistelmä Riittävä hapensaanti on välttämätöntä aerobisten solujen selviytymiselle. Solun alentunut hapen määrä, toiselta nimeltään hypoksia, johtaa useisiin vasteisiin joiden tarkoituksena on turvata solun hapensaanti ja vähentää hapenkulutusta. Happitasapainoa säätelee hypoksiassa indusoituva tekijä (HIF), joka aktivoi yli 300 geenin luentaa hypoksisissa oloissa. HIFα:n määrää soluissa säätelevät HIF prolyyli-4-hydroksylaasientsyymit (HIF-P4H:t), jotka hydroksyloivat proliini-aminohappotähteitä HIFα-alayksiköissä ja ohjaavat ne proteasomaaliseen hajotukseen. HIF-P4H:t tarvitsevat reaktiossa happea mahdollistaen HIF:n stabilisaation ja kohdegeenien lisääntyneen luennan matalassa hapen osapaineessa. Tässä tutkimuksessa selvitimme HIF-P4H-2-entsyymin roolia punasolujen muodostuksen eli erytropoieesin säätelyssä. Osoitimme, että korkealla vuoristossa asuvat tiibetiläiset ovat geneettisesti sopeutuneet hypoksiseen elinympäristöönsä johtuen HIF-P4H-2-entsyymiä tuottavan geenin mutaatiosta. Tiibetiläisiltä löytynyt HIF-P4H-2D4E,C127S variantti hydroksyloi tehokkaammin HIFα-alayksiköitä matalassa hapen osapaineessa johtaen vähäisempään HIFα-alayksiköiden stabiloitumiseen hypoksiassa. Muissa tutkimuksissamme käytimme geneettisesti muunneltua HIF-P4H-2-hiirikantaa, joka tuottaa alentunutta määrää villityypin Hif-p4h-2 lähetti-RNA:ta kudoksissaan. Näille hiirille kehittyi ikäriippuvaisesti lievä punasoluylimäärä eli erytrosytoosi johtuen pernan kiihtyneestä punasolutuotannosta riippumatta seerumin erytropoietiinikonsentraatiosta. Lisäksi nämä hiiret olivat suojassa tulehduksen aiheuttamalta anemialta, joka on yleinen ilmiö tulehduksellisista sairauksista kärsivillä potilailla. HIF-P4H-2-muuntogeenisten hiirten lihasten energia-aineenvaihdunta oli muuttunut siten, että se yhdessä suurentuneen keskimääräisen kapillaaripinta-alan kanssa pienensi vaurioituneen kudoksen pinta-alaa alaraajaiskemia-altistuksen jälkeen. Nämä tutkimukset osoittavat, että lääkkeellinen HIF-P4H-2-entsyymin estäminen on mahdollinen uusi hoitomuoto erytropoietiinille resistenteissä anemioissa sekä alaraajojen valtimoahtaumataudissa.

Abstract Erythropoiesis is the process of red blood cell production. The main regulator is the erythropoietin (EPO) hormone, which is strongly upregulated in low oxygen concentration (hypoxia) in cells via the hypoxia-inducible transcription factor HIF. The stability of HIF is regulated in an oxygen-dependent manner by three HIF prolyl 4-hydroxylases, all of which are known to participate in the regulation of erythropoiesis. A role in erythropoiesis of a fourth prolyl 4-hydroxylase, P4H-TM, which possesses a transmembrane domain, is not known, but it is able to hydroxylate HIF at least in vitro and in cellulo. The role of P4H-TM in erythropoiesis was studied by administering a HIF-P4H inhibitor, FG-4497, to P4h-tm null, Hif-p4h-3 null, and Hif-p4h-2 hypomorph mouse lines. The current study suggests that P4H-TM is involved in the regulation of EPO production, hepcidin expression and erythropoiesis. P4H-TM can thus be a new target for inhibition when designing novel pharmacological treatment strategies for anemia. LOX is required for crosslink formation between lysine residues in fibrillar collagens and elastin. These crosslinks enhance the tensile strength of collagen fibers and provide elasticity to elastic fibers and thus generate important structural support for tissues. LOX is required for normal embryonic development of the cardiovascular and pulmonary systems, and its depletion leads to a generalized elastinopathy and collagenolysis leading to perinatal death of Lox null mice. The development of muscles is a delicate process, which requires coordinated signaling and a homeostatic balance between the muscle and muscle connective tissue. Based on the drastic defects that were found in the present study in the skeletal muscle of Lox null mice, lack of LOX clearly disturbs this balance and increases transforming growth factor β (TGF-β) signaling, which leads to defects in the skeletal muscles. The impaired balance can cause muscle disorders, such as Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). Despite the clinical significance, very little is known about the mechanisms controlling this homeostatic balance. The discovery of LOX as a regulating factor during skeletal muscle development will help to clarify the role of extracellular matrix (ECM) in muscle development and in muscle related congenital diseases. / Tiivistelmä Erytropoieesi on fysiologinen prosessi, jossa tuotetaan veren punasoluja ja jonka pääsäätelijänä toimii erytropoietiini (EPO) hormoni. EPO:n geeni ilmentyy voimakkaasti alhaisessa happipitoisuudessa (hypoksia) hypoksia-indusoituvan transkriptiotekijän (HIF) toimesta. HIF-tekijän stabiilisuutta säätelee kolme HIF-prolyyli-4-hydroksylaasientsyymiä (HIF-P4H) hapesta riippuvaisesti, ja niiden tiedetään siten osallistuvan myös erytropoieesin säätelyyn, HIF-P4H-2:n toimiessa pääsäätelijänä. Neljännen transmembraanisen prolyyli-4-hydroksylaasin (P4H-TM) roolia erytropoieesissa ei vielä tiedetä, mutta sen tiedetään säätelevän HIF-tekijää. Työssä käytettiin Hif-p4h-2, Hif-p4h-3 ja P4h-tm muuntogeenisiä hiirilinjoja, joiden entsymaattinen aktiivisuus on alentunut tai poistettu. P4H-TM:n osallisuutta erytropoieesin säätelyyn tutkittiin antamalla hiirilinjoille HIF-P4H-entsyymejä inhiboivaa lääkettä. Tutkimuksen tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa P4H-TM:n säätelevän EPO-geenin ilmentymistä ja siten erytropoieesia. Ennestään tiedettyjen HIF-P4H entsyymien inhiboinnin lisäksi P4H-TM:n inhibointia voidaan pitää uutena kohteena uusien farmakologisten hoitokeinojen kehityksessä. Lysyylioksidaasi (LOX) katalysoi säikeisten kollageenien välisten sekä elastisten säikeiden välisten poikkisidosten muodostumista. Pokkisidokset antavat vetolujuutta kollageeneille ja joustavuutta elastisille säikeille ja ovat siten tärkeitä kudoksen rakenteelle. LOX:ia tarvitaan sikiön kehityksen aikana mm. hengitys-, sydän- ja verisuonielimistöjen kehityksessä. LOX:in puutos hiirillä aiheuttaa viallisia elastisia- ja kollageenisäikeitä, johtaen poikasten kuolemaan synnytyksen yhteydessä. Lihasten kehitys on tarkoin säädelty prosessi, jossa lihas ja lihaksen sidekudos säätelevät toisiansa. LOX:n suhteen poistogeenisissä Lox-/- sikiöissä löydettiin selviä ongelmia luurankolihasten kehityksessä. LOX:n puutoksen osoitettiin lisäävän transformoivan kasvutekijä beetan (TGF-β) määrää, joka estää luustolihaksia kehittymästä normaalisti. LOX kykenee sitoutumaan TGF-β:aan ja inhiboimaan sen aktiivisuutta ja LOX:n puuttuessa inhibointia ei tapahdu. Tutkimus osoittaa LOX:n olevan keskeinen tekijä lihaksen kehityksessä ja siten auttaa ymmärtämään sidekudoksen merkitystä luurankolihasten kehityksessä ja siihen liittyvissä sairauksissa.

Abstract Oxygen is essential for aerobic organisms, as shortage of oxygen (hypoxia) can induce cellular dysfunctions and even cell death, leading to tissue damage and decreased viability of the organism. Oxygen homeostasis is regulated delicately by several mechanisms, the major one being the hypoxia-inducible factor (HIF) pathway that is evolutionarily conserved. HIFα subunits are regulated in an oxygen-dependent manner via three HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs). In the presence of oxygen HIF-P4Hs modify HIFα, which leads to its degradation, whereas in hypoxia the HIF-P4H enzymes cannot function and HIFα is stabilized. HIF regulates more than 300 genes that enhance oxygen delivery from the lungs to tissues and reduce oxygen consumption in tissues, such as those for erythropoietin and vascular endothelial growth factor. When a tissue suffers from hypoxia caused by a circulatory restriction, the situation is called ischemia. In this study we used a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorph mouse line that expresses 8% of the wild-type Hif-p4h-2 mRNA in the heart and 19% in skeletal muscle, and has HIFα stabilization in both tissues. We showed that chronic HIF-P4H-2 deficiency leads to protection against acute ischemic injury both in the heart and in skeletal muscle. The protection was mainly due to enlarged capillaries and better perfusion in both tissues. Hypoxia is known to decrease body weight. The observation of the HIF-P4H-2 deficient mice being leaner than their wild-type littermates led us to study their body constitution, metabolism and adipose tissue in detail. We discovered that chronic HIF-P4H-2 deficiency protects against obesity and several metabolic dysfunctions including diabetes and metabolic syndrome. These beneficial outcomes were mimicked when a pharmacological pan-HIF-P4H inhibitor was administered to wild-type mice. In these studies we showed that pharmacological HIF-P4H-2 inhibition may provide a novel treatment for diseases such as acute myocardial infarction, peripheral artery disease and metabolic disorders. / Tiivistelmä Happi on edellytys aerobisen eliön, kuten ihmisen, elämälle; hapen niukkuus (hypoksia) voi johtaa monenlaisiin solun toimintahäiriöihin, jotka voivat edelleen aiheuttaa solun kuoleman, kyseisen kudoksen vaurion, ja lopulta eliön elinkyvyn heikkenemisen. Happitasapainoa säädellään monilla menetelmillä, joista merkittävin on hypoksiassa indusoituvasta tekijästä (HIF) riippuvainen reitti, joka on evoluutiossa säilynyt. HIFα alayksiköitä säätelee hapesta riippuvaisesti kolme HIF prolyyli 4-hydroksylaasia (HIF-P4Ht). Hapen läsnä ollessa HIF-P4H on aktiivinen ja johtaa HIFα:n hajottamiseen, kun taas hypoksiassa HIF-P4H entsyymit eivät voi toimia ja siten HIFα stabiloituu. HIF säätelee yli 300 geeniä, jotka edistävät hapen kuljetusta ja pääsyä keuhkoista kudoksiin sekä vähentävät hapenkulutusta. Näitä geenejä ovat mm. erytropoietiini sekä vaskulaarinen endoteelikasvutekijä. Kudoksen heikentyneestä verenkierrosta johtuvaa hapenpuutetta kutsutaan iskemiaksi. Tässä tutkimuksessa käytimme geneettisesti muunneltua HIF-P4H-2 hypomorfi-hiirikantaa, joka tuottaa Hif-p4h-2 lähetti-RNA:ta sydämessä vain 8 % ja luurankolihaksessa 19 % villityypin määrästä, ja jolla on HIFα stabiloituneena molemmissa kudoksissa. Osoitimme, että krooninen HIF-P4H-2:n puute suojaa sekä sydäntä että luurankolihasta akuutissa iskemiassa. Vaikutus johtui pääasiassa suuremmista kapillaareista ja paremmasta perfuusiosta molemmissa kudoksissa. Aikaisempien tutkimusten perusteella tiedetään, että hypoksia alentaa painoa. Huomio siitä, että HIF-P4H-2 puutteiset hiiret ovat hoikempia kuin villityypin sisaruksensa, johti meidät tutkimaan hiirten kehon koostumusta, aineenvaihduntaa ja rasvakudosta tarkemmin. Tutkimuksissamme selvisi, että krooninen HIF-P4H-2:n puute suojaa lihavuudelta ja monelta aineenvaihdunnan häiriöltä kuten sokeritaudilta ja metaboliselta oireyhtymältä. Nämä edulliset vaikutukset toistuivat, kun annoimme villityypin hiirille pan-HIF-P4H inhibiittoria. Kaiken kaikkiaan, näissä tutkimuksissa osoitimme, että lääkkeellinen HIF-P4H-2:n estäminen voi tarjota uuden keinon sydäninfarktin, luurankolihasiskemian ja aineenvaihdunnan häiriöiden hoitoon.

Abstract Mediators of epithelial permeability, angiogenesis and invasion may serve as prognostic indicators and targets for therapies in esophageal cancer (EC). The expressions of claudins, hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor-A (VEGF), nitric oxide synthases (iNOS, eNOS, nNOS) and toll-like receptor 9 (TLR9) were evaluated by immunohistochemistry in EC. The results were compared with clinicopathological variables, tumor proliferation and apoptosis. All of the claudins were expressed in most of the cancers. Esophageal adenocarcinomas (EAC) displayed more often increased claudin 3 and 5 expression than esophageal squamous cell carcinomas (ESCC). Loss of claudin 3 expression associated with distant metastases in EC and a tendency in this direction was also observed for claudin 4. Cancers with stronger claudin 4 expression showed increased apoptosis in both EAC and ESCC. HIF-1α was present in most of the ECs and like iNOS more often in ESCC than in EAC. Strong HIF-1α expression tended to associate with positive VEGF immunostaining. In ESCC, both strong HIF-1α expression and VEGF positivity tended to associate with increased microvessel density (MVD). In EAC, tumors showing VEGF positivity associated with increased MVD outside the tumor. Patients with strong HIF-1α expression had more often distant metastases than other patients in EC. There was no VEGF expression in normal esophageal mucosa and T3-4 tumors tended to be more often VEGF positive than T1-2 tumors. The expression of TLR9 was more intensive in dysplasia than in normal epithelium and ESCC and abundant TLR9 expression could serve as a marker of squamous cell high grade dysplasia. Intensive TLR9 expression was associated with higher grade tumors and the presence of nodal and distant metastases in ESCC. EC and its progression may be related to increased angiogenesis regulated by VEGF and HIF-1α. In EC, claudin expression varies along with the histology of the tumor. Claudin expression may be associated with apoptosis or proliferation and contribute to tumor behavior. An association was detected between moderate to strong expression of claudin 3 and a high TLR9 histoscore in ESCC. Altered expression of claudin 3 may result to upregulation of endosomal TLR9. TLR9 may serve as a marker for squamous cell dysplasia and ESCC progression. / Tiivistelmä Solukerrosten läpäisevyyttä, verisuonten uudismuodostusta ja kasvainsolujen liikkuvuutta säätelevät tekijät voivat toimia ruokatorvisyövän ennustetekijöinä ja hoidon kohteina. Tässä tutkimuksessa selvitettiin klaudiinien, hypoksia-indusoituvan tekijän 1α (HIF-1α), verisuonen endoteelin kasvutekijän A (VEGF), kolmen typpioksidisyntaasin (iNOS, eNOS ja nNOS) sekä tollin kaltaisen reseptorin 9 (TLR9) ilmentymistä ja merkitystä ruokatorvisyövässä immunohistokemiallisin menetelmin. Tuloksia arvioitiin suhteessa proliferaatioon ja apoptoosiin. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät jokaista tutkittua klaudiinia. Ruokatorven rauhassyövässä ilmeni levyepiteelisyöpää useammin klaudiineja 3 ja 5. Klaudiinin 3 vähäinen ilmentyminen oli yhteydessä etäpesäkkeiseen tautiin. Sama suuntaus näkyi klaudiinin 4 kohdalla. Apoptoosia todettiin enemmän kasvaimissa, jotka ilmensivät muita enemmän klaudiini 4:ä. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät HIF-1α:a. Sekä iNOS että HIF-1α ilmentyivät runsaammin levyepiteeli- kuin rauhassyövässä. Tutkimus viittasi yhteyteen voimakkaan HIF-1α:n ilmentymisen ja VEGF:n ilmentymisen välillä. Voimakas HIF-1α:n ilmentyminen ja VEGF:n ilmentyminen vaikuttivat liittyvän ruokatorven levyepiteelisyövän uudissuonituksen lisääntymiseen. Rauhassyövän lisääntynyt uudissuonitus kasvaimen ulkopuolella saattaa liittyä VEGF:n ilmentymiseen. Potilailla, joiden kasvaimissa HIF-1α:n ilmentyminen oli voimakasta, todettiin etäpesäkkeitä muita useammin. VEGF:a ei todettu normaalissa limakalvossa, ja sen ilmentyminen vaikutti olevan yleisempää syvälle kasvavissa kuin pinnallisissa syövissä. TLR9 ilmentyi voimakkaammin levyepiteelin dysplasiassa kuin normaalissa tai kasvainepiteelissä. Huonosti erilaistuvissa ja levinneissä kasvaimissa TLR9 ilmentyi voimakkaammin kuin muissa kasvaimissa. Ruokatorvisyövän synty ja eteneminen voivat liittyä HIF:n ja VEGF:n säätelemään verisuonten uudismuodostukseen. Klaudiinit saattavat vaikuttaa syövän käyttäytymiseen myös apoptoosin ja proliferaation kautta. Tutkimuksessa todettiin yhteys lisääntyneen klaudiinin 3 ilmentymisen ja voimakkaasti ilmentyvän TLR9:n välillä. Muutos klaudiinin 3 ilmentymisessä saattaa lisätä levyepiteelin läpäisevyyttä johtaen TLR9:n aktivoitumiseen. TLR9 voi vaikuttaa ruokatorven levyepiteelin dysplasian ja syövän syntyyn sekä toimia vaikean dysplasian ja aggressiivisen levyepiteelisyövän merkkiaineena.