Sucrose synthase (SUS) is a key enzyme in sucrose metabolism. This enzyme catalysis the reversible conversion of sucrose and UDP to UDP-glucose and fructose, which are both used in multiple biochemical pathways. The Arabidopsis genome contains six sucrose synthase genes. A member of this family (SUS2) is strongly and specifically expressed in Arabidopsis seeds during the maturation phase, corresponding to reserve accumulation period. Total SUS activity reached a peak during seed maturation, at about 15 days after flowering (DAF), which corresponds approximately to the middle of this stage. This activity pattern fitted well with SUS2 mRNA abundance, although we cannot exclude the presence of other SUS isoform activities, such as SUS3, in seeds at late maturation. Using specific antibodies we have shown that, SUS2 is localised in the embryo, endosperm and seed coat with differential patterns. During the maturation phase, the SUS2 protein was mainly colocalised with plastids in the embryo. This result is consistent with the hypothesis that SUS2 association with the plastid may play a role in channelling of sucrose metabolism to G-6-P or PEP, both carbon compounds which enter the plastids enabling starch or lipid synthesis. Indeed, the regulation of SUS2 and SUS3 expression was investigated during seed development for wild type (WT) and for seed maturation mutants (i.e. lec2-4, fus3-4 and abi3). The accumulation patterns of SUS mRNA and protein, as well as total activity, were strongly affected in these mutants during seed development. We showed that the expression of the SUS2 promoter was induced in planta by sugar (glucose, sucrose and trehalose) and that the expressions of SUS2 and SUS3 promoters are redundantly regulated by LEC2 and FUS3 during the maturation phase. Last, a functional analysis was carried out in developing seeds, using biochemical characterisation and metabolite profiling of one sus1, two sus2 and two sus3 alleles. The results obtained outlined the importance of these SUS isoforms for sucrose metabolism in developing seeds of Arabidopsis.

La paroi cellulaire des végétaux supérieurs est une structure complexe jouant de nombreux rôles au cours du développement ainsi qu'en réponse aux stress. Les protéines pariétales sont notamment importantes au cours de l'élongation cellulaire. Des hypocotyles étiolés d'Arabidopsis thaliana ont été choisi comme modèle d'élongation cellulaire parce qu'ils subissent une élongation polarisée et rapide en l'absence de division cellulaire. Deux stades de développement ont été comparés grâce à des analyses protéomique et transcriptomique : pendant leur élongation vs après la fin de leur croissance. Pour rendre l'analyse protéomique efficace, une nouvelle méthode de purification de parois et une stratégie de séparation des protéines pariétales ont été établies. Les protéines ont été identifiées par cartographie peptidique massique en utilisant la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Cette étude a permis d'identifier 137 protéines parmi lesquelles 51 n'avaient pas été identifiées auparavant. Plusieurs familles de protéines connues pour être impliquées dans l'elongation cellulaire ou son arrêt ont été trouvées par l'une ou l'autre approche (XTH, PG, expansines, peroxydases, laccases). De nouvelles protéines candidates pour jouer des rôles dans l'élongation cellulaire ont été identifiées, telles des protéases, des protéines liées au métabolisme des lipides ou des protéines de fonction inconnue. La comparaison des résultats de protéomique et de transcriptomique ne montre pas de cohérence systématique, suggérant l'existence de mécanismes de régulation post-transcriptionnels des gènes codant les protéines pariétales.

Chez les espèces végétales soumises à dessiccation, les réserves lipidiques des graines sont stockées sous forme de globules, les oléosomes. Ces oléosomes sont composés d'un cœur de triglycérides (TGs), entouré d'une monocouche de phospholipides (PLs) dans laquelle s'insèrent de petites protéines, majoritairement des oléosines. Ces protéines sont constituées de trois domaines : N- et C-terminaux amphiphiles et un segment central hydrophobe de 72 acides aminés très conservé. Les oléosines sont certainement des protéines de structure et par leur présence, les oléosomes ne coalescent pas, même lors de la re-imbibition de la graine au moment de la germination. Bien que les levures présentent des organites de stockage similaires à ceux des végétaux, leur pool protéique est très différent. Nous avons cloné et exprimé deux isoformes d'oléosines d'A. thaliana dans E. coli et dans Y. lipolytica. Les oléosines exprimées chez la levure sont bien dirigées vers le corps lipidique. Par ailleurs, les oléosines exprimées chez la bactérie ont été purifiées à l'homogénéité en conditions dénaturantes. Par des études in silico et in vitro d'oléosine, nous postulons que le segment hydrophobe est organisé en hélices α. Des études de tension de surface ont montré que les oléosines recombinantes purifiées pouvaient s'insérer à des interfaces eau / huile et qu'elles en abaissaient fortement la tension de surface (ceci mieux que des caséines β). Elles peuvent aussi s'insérer dans des monocouches de PLs situées à l'interface eau / air. Les oléosines des végétaux présentent donc bien des caractéristiques d'émulsifiant huile dans eau.

Chez les espèces végétales soumises à dessiccation, les réserves lipidiques des graines sont stockées sous forme de globules, les oléosomes. Ces oléosomes sont composés d'un cœur de triglycérides (TGs), entouré d'une monocouche de phospholipides (PLs) dans laquelle s'insèrent de petites protéines, majoritairement des oléosines. Ces protéines sont constituées de trois domaines: N- et C-terminaux amphiphiles et un segment central hydrophobe de 72 acides aminés très conservé. Les oléosines sont certainement des protéines de structure et par leur présence, les oléosomes ne coalescent pas, même lors de la re-imbibition de la graine au moment de la germination. Bien que les levures présentent des organites de stockage similaires à ceux des végétaux, leur pool protéique est très différent. Nous avons cloné et exprimé deux isoformes d'oléosines d'A. thaliana dans E. coli et dans Y. lipolytica. Les oléosines exprimées chez la levure sont bien dirigées vers le corps lipidique. Par ailleurs, les oléosines exprimées chez la bactérie ont été purifiées à l'homogénéité en conditions dénaturantes. Par des études in silico et in vitro d'oléosine, nous postulons que le segment hydrophobe est organisé en hélices α. Des études de tension de surface ont montré que les oléosines recombinantes purifiées pouvaient s'insérer à des interfaces eau / huile et qu'elles en abaissaient fortement la tension de surface (ceci mieux que des caséines β). Elles peuvent aussi s'insérer dans des monocouches de PLs situées à l'interface eau / air. Les oléosines des végétaux présentent donc bien des caractéristiques d'émulsifiant huile dans eau.

La division des chloroplastes des cellules végétales fait intervener des protéines d'origine procaryotique et eucaryotique. Parmi les protéines d'origine procaryotique on trouve la protéine FtsZ, l'ancêtre de la tubiline. Alors que les bactéries n'utilisent qu'une protein FtsZ pour se diviser, les chloroplastes de plantes supérieures possedent deux familles de protéines FtsZ: FtsZ1 et FtsZ2. La caractérisation des mutants FtsZ d'Arabidopsis thaliana montre que les protéines FtsZ en plus d'être impliquées dans la division des plastes ont acquis de nouvelles fonctions au cours de l'évolution. La localization des protéines FtsZ avec les thylacoïdes au cours du développement suggère un rôle des protéines FtsZ dans la biogenèse des chloroplastes au cours du développement des feuilles. Le nombre et la taille des grains d'amidon dans les mutants d'Arabidopsis, ainsi que l'expression des protéines FtsZ au cours de la transition proplastes-amyloplastes dans les cellules BY2 de tabac, suggèrent une fonction de ces protéines dans le metabolisme du grain d'amidon.

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr5S, transcrits par l'ARN polymérase III, sont présents à environs 1000 copies regroupées en blocs situés au niveau de l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. Le chromosome 5 porte un locus d'ADNr 5S sur chacun de ses bras. Seuls les loci du chromosome 4 et du bras gauche du chromosome 5 contiennent des gènes d'arn 5S transcrits. La population d'ARNr 5S est hétérogène chez Arabidopsis et se caractérise par la présence d'un ARNr 5S dit "majoritaire", représentant plus de 90% des transcrits 5S de la cellule, et d'ARN 5S "minoritaires" différant du transcrit 5S majoritaire par une ou deux substitutions nucléotidiques. Dans le cadre de l'étude de la régulation génétique de l'expression des gènes d'ARN 5S, nous avons identifié cloné et caractérisé TFIIIA d'Arabidopsis, qui est le facteur de transcription spécifique des gènes d'ARNr 5S. Lors de cette étude, nous avons également identifié un produit d'épissage alternatif du gène TFIIIA, codant une protéine plus courte que TFIIIA dans sa partie N-terminale dénomée TFIIIAbis. L'analyse de lignées RNAi ciblant TFIIIAbis et des expériences de transcription in vitro, ont suggéré que l'TFIIIAbis aurait un effet positif sur le taux global des ARNr 5S, probablement en stabilisant ces ARN. Nous avons aussi mené une étude de la régulation épigénétique de l'expression des gènes d'ARNr 5S. Ainsi, nous avons démontré l'implication de la méthylation de l'ADN dans la répression de la transcription des gènes d'ARNr 5S minoritaires. L'expression de ces gènes est aussi contrôlée par la voie de répression transcriptionnelle indépendante de la méthylation ADN dont MOM1 fait partie. Nous avons identifié un nouveau type de transcrits provenant de gènes d'ARNr 5S, appelés ARNr 5S-210. De la même façon que les ARNr 5S minoritaires, l'expression des ARNr 5S-210 est contrôlée par la méthylation de l'ADN et par la voie de répression contenant MOM1. Enfin, nous montrons que toutes les séquences répétées hétérochromatiques, à l'exception des éléments transposables, sont soumises à ces deux voies de répression

Le sujet de cette thèse est l'étude de la régulation de l'expression du facteur de transcription LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), qui est un, régulateur clé du développement de la graine d'Arabidospsis thaliana. La graine offre un mode de propagation et de protection des espèces végétales à graines, indispensable à leur survie. La graine est l'élément de base de l'agriculture, en tant que semence, et de l'alimentation humaine, aussi bien sous forme brute que sous forme transformée (farines, huiles...). Elle a aussi de très nombreuses applications industrielles dans l'industrie et les biocarburants. Le développement de la graine, comme beaucoup d'étapes nécessaires à la vie de la plante, est controlé par des phénomènes complexes, incluant des facteurs de transcription. LEC2, ainsi que 2 autres facteurs de transcription de type B3 (FUSCA 3 et ABI3) et un facteur à domaine de fixation CAAT (LEAFY COTYLEDON 1), sont les quatre facteurs clés du développement de la graine d'Arabidospsis thaliana, appelés AFLs (ABI3, FUS3, LEC1, 2). Les gènes AFLs s'expriment spécifiquement dans l'embryon et sont fortement réprimés dans les parties végétatives, par de multiples mécanismes impliquant, entre autre, des facteurs de transcription et des acteurs plus généraux modifiant la structure de la chromatine. Bien que la régulation de LEC2 ait déjà été largement étudiée, les mécanismes précis de répression ainsi que l'activation de ce gène, sont encore méconnus.Le travail présenté est basé sur un travail de délétion de promoteurs, qui a révélé l'existence de 3 boîtes de régulation, essentielles à une activité correcte du promoteur de LEC2. Deux boîtes, dont une correspondrait à une boîte de fixation de facteurs MADS et une à une boîte GAGA dans la séquence transcrite non traduite de LEC2, sont essentielles à l'activité du promoteur. La 3ème séquence, d'une longueur de 50pb, est nécessaire à la répression de LEC2 dans les parties végétatives par des mécanismes épigénétiques. La corrélation de la présence de cette boîte avec un enrichissement dans la marque H3K27me3 au locus nous a permis de rapprocher cette séquence de répression d'une PRE (Polycomb response element) de type végétal.

Porteur redox intervenant dans nombre de processus métaboliques, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) est central pour les cellules vivantes. Outre son importance dans le métabolisme oxydoréductif, des données récentes suggèrent fortement d'autres rôles importants pour le NAD dans la signalisation cellulaire. Un système inductible d'enrichissement en NAD en surproduisant la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) d'Escherichia coli chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l'implication du NAD dans les mécanismes spécifiques de défenses qui régissent les interactions plante-pathogène. Par ailleurs, une dérégulation de la synthèse de NAD sur l'étape enzymatique catalysée par la QPT endogène d'Arabidopsis thaliana souligne le rôle critique du NAD dans la balance C/N des plantes, en particulier en bouleversant l'assimilation de l'azote en conditions photorespiratoires. Ces travaux nous ouvrent à une nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation impliquant le NAD dans les grandes fonctions métaboliques des plantes.

<p>Excess excitation energy, mechanical injury and defence against pathogens, each trigger rapid production of reactive oxygen species (ROS) in <i>Arabidopsis thaliana</i> leaves. ROS, such as hydrogen peroxide (H₂O₂), are required for the induction of systemic acquired acclimation and may lead to redox changes in photosynthetic electron transport (PET). On one hand, enhanced ROS production during stress can destroy cells, and on the other, ROS can also act as signals for the activation of stress responsive and defensive pathways.</p><p>In this work, physiological and molecular analyses of <i>Arabidopsis</i> mutants and transgenic lines were applied to investigate the signalling network controlling biotic and abiotic stress responses. A key enzyme of the antioxidant network is encoded by <i>ASCORBATE PEROXIDASE 2 (APX2</i>). Wounded leaves showed low induction of<i> APX2 </i>expression and when exposed to excess light, <i>APX2</i> expression was increased synergistically. Signalling pathways dependent upon jasmonic acid, chitosan and abscisic acid were not involved in the wound-induced expression of <i>APX2</i>, but PET was required, and APX2 induction was preceded by a depressed rate of CO₂fixation.</p><p>Analysis of<i> lsd1</i> (<i>LESION SIMULATING DISEASE 1</i>) strongly suggests that light acclimatory processes and pathogen defences are genetically and functionally linked. It is important to know that LSD1 type of mutants have mainly been studied with regard to pathogenesis. From this work, it reveals that association of LSD1 with hypersensitive response may only be supplementary.</p><p><i>GLUTATHIONE PEROXIDASES</i> <i>(GPXs)</i> are another major family of ROS scavenging enzymes. Analysis of the <i>Arabidopsis </i>genome database revealed a new open-reading frame, thus increasing the total number of <i>AtGPX </i>gene family to eight (<i>AtGPX1-AtGPX8</i>). <i>Arabidopsis thaliana</i> transgenic lines with reduced expression of both putative chloroplastic isoforms (<i>AtGPX1 </i>and <i>AtGPX7</i>) and <i>AtGPX7</i> knock-out mutant (ko-<i>GPX7</i>) were more sensitive to photo-oxidative stress but had a reduced bacterial growth rate when inoculated with virulent strains <i>Pseudomonas syringae</i> pv. <i>tomato</i> DC3000 and<i> P.s.t. maculicola</i> strain ES4326, indicating increased resistance to pathogenesis. This, to our knowledge, is the first functional and genetic analysis of chloroplastic GPXs in plants, and confirms that light and chloroplastic ROS metabolism is important for basal resistance against virulent pathogens.</p><p>The above results confirm that light sensing, light acclimatory processes and photo-produced ROS also govern pathogen defence pathways. This has a great ecological relevance for Darwinian fitness of plants growing in the natural environment, where simultaneous pathogen attack and fluctuations in light, temperature and other environmental factors make rapid acclimation a constant necessity. Molecular, biochemical and physiological analysis of pathogen responses in mutants impaired in light sensing, EEE-dissipatory mechanisms, and similar analysis of light acclimatory processes in mutants impaired in pathogen defences may prove to be seminal.</p>

<p>During photosynthesis, two multi-protein complexes, photosystems (PS) I and II work in tandem to convert the light-energy absorbed by the light-harvesting antennae into chemical energy, which is subsequently used to assimilate atmospheric carbon dioxide into organic carbon compounds. This is the main nutritional basis for life on Earth.</p><p>The photosynthetic antenna of higher plants comprises at least ten different pigment-binding proteins (LHC), which play important roles in photosynthesis. Chlorophyll and carotenoid molecules associated with the LHC proteins are organised into an array, which can be modulated, thereby optimising light-harvesting processes and protection against oxidative damage under conditions of excessive light absorption. All ten LHC proteins have been conserved through eons of evolution, suggesting that there are strong evolutionary pressures to retain all ten proteins, and hence that each protein has a unique function.</p><p>The light-harvesting antenna of higher plant PSI consists of at least four proteins, Lhca1-4, collectively called LHCI. By constructing transgenic Arabidopsis thaliana plants in which each Lhca gene has been individually repressed or knocked-out, a collection of plants with different Lhca protein contents was obtained. The objective was to use these plants to study the structure, function and regulation of the Lhca proteins in vivo. The major findings of this work are as follows.</p><p>Removing single Lhca proteins influenced the stability of the other Lhca proteins, showing that there is a high degree of inter-dependency between the polypeptides in LHCI, and hence that a full set of Lhca proteins is important for maintaining the structural integrity of LHCI. This has provided insight into the organisation of LHCI by revealing clues about the relative positions of each Lhca protein in the antenna complex. The physiological consequences of removing individual Lhca proteins were dependent on the degree of antenna depletion. Plants with relatively small antenna changes could compensate, to some extent, for the loss of LHCI, while larger depletions had profound effects on whole plant resulting in growth reductions.</p><p>The fitness of each Lhca plant was assessed by measuring their seed production in the harsh conditions in the field. We found that all Lhca-deficient plants produced fewer seeds under some conditions, with seed-production compared to wild type varying between 10-80% depending on the extent of LHCI reduction. Therefore, we conclude that each Lhca protein is important for plant fitness, and hence for the survival of the species.</p><p>PSI is characterised by a pool of pigments absorbing light in the red end of the solar visible spectrum, thought to be especially important for plants in dense vegetation systems where the incident light is enriched in wavelengths higher than 690 nm. A majority of these pigments are situated on LHCI and, based on in-vitro studies, were thought to be mainly associated with Lhca4. Using our plants, we have established that red pigments are indeed present on all Lhca proteins and that these pigments become even more red upon association with PSI.</p>