Im Zeitraum von Juni 2010 bis November 2020 wurden 44 Patienten (17 weiblich, 27 männlich; Durchschnittsalter: 62,5 Jahre) aufgrund einer intrakraniellen duralen arteriovenösen Fistel am Institut für Neuroradiologie des Universitätsklinikums Leipzig endovaskulär und kombiniert endovaskulär-chirurgisch behandelt. Diese seltene vaskuläre Malformation, bei der es sich um einen pathologischen Shunt zwischen duralen Arterien und duralen Sinus oder leptomeningealen Venen handelt, wurde über unterschiedliche endovaskuläre Zugangswege (transarteriell, transvenös oder kombiniert transarteriell und transvenös) insbesondere mit Flüssigembolisaten und Coils embolisiert; wenige DAVF wurden mittels Polyvinyl-Alkoholpartikel, Amplatzer Vascular Plugs oder Stents behandelt. Durch die am Ende einer Intervention durchgeführte DSA wurde das Behandlungsergebnis (vollständiger vs. teilweiser Verschluss der Fistel) erfasst. In weiteren Verlaufskontrollen (2 - 42 Monate postinterventionell, Median: 6 Monate), die eine DSA, CTA und MRA einschlossen, wurde die behandelte DAVF erneut untersucht, um den Langzeitverlauf zu beurteilen. Das klinische Outcome wurde im Zeitraum zwischen der letzten Intervention und der Entlassung der Patienten ermittelt. Folgende Fragestellung sollte in dieser Arbeit beantwortet werden: Welcher endovaskuläre Zugangsweg führt zu einem vollständigen Verschluss einer DAVF? Nach Untersuchung der erzielten Verschlussrate der bei 44 Patienten durchgeführten DAVF-Embolisationen soll ein Behandlungsschema abgeleitet werden, das sich an der jeweiligen Anatomie und dem Drainagemuster der DAVF orientiert und im klinischen Alltag eine Hilfestellung für die Wahl des Zugangsweges bieten soll. Eine TVE erfolgte bei 12 Patienten (27%), eine TAE bei 23 Patienten (52%) und ein kombinierter transarterieller-transvenöser Zugangsweg bei 8 Patienten (18%). In einem Fall erfolgte nach primärer TAE die Versorgung der DAVF mittels Clipping. Damit der Fistelpunkt erreicht werden konnte, wurde bei einer CCF Typ Barrow A und zwei CCF Typ Barrow D die drainierende V. ophthalmica superior operativ freigelegt. Im Rahmen der Behandlung einer DAVF Typ Cognard IIa+b, Typ III und Typ V erfolgte die Präparation des isolierten Sinus transversus. Eine TAE führte bei 14 Patienten (61%), eine TVE bei 11 Patienten (92%) und eine kombinierte TAE/TVE bei allen 8 Patienten direkt postinterventionell zu einem vollständigen Verschluss der Fistel. In den bei 25 Patienten erfolgten bildgebenden Verlaufskontrollen zeigt sich in keiner der initial vollständig verschlossenen DAVF ein Rezidiv oder einer Verschlechterung einer teilweise verschlossenen Fistel. Eine vollständige Symptomregredienz konnte bei 75% der Patienten, die mittels einer TVE, bei 39% mittels TAE und bei 25% mittels einer kombinierten TAE/TVE erzielt werden. Für den vollständigen Fistelverschluss war nur eine Intervention bei 91% der TVE, 79% der TAE und 13% der kombinierten TAE/TVE notwendig. Im Fall einer initial teilweise verschlossenen DAVF Cognard IV konnte diese in einem weiteren Eingriff mittels Clipping vollständig behandelt werden. In der nach sechs Monaten durchgeführten DSA war die DAVF weiterhin verschlossen. Bei einem Patienten wurde im Rahmen einer TAE aufgrund einer Migration von Histoacryl in die A. stylomastoidea eine Fazialisparese hervorgerufen, die sich jedoch wieder vollständig zurückbildete. Darüber hinaus zeigten sich keine weiteren Komplikationen während der Interventionen. Auch die sechs Eingriffe mit zusätzlicher operativer Freilegung der Venen und der duralen Sinus konnten komplikationslos durchgeführt werden. Nach Auswertung insbesondere des bildgebenden Behandlungsergebnisses nach Embolisation unterschiedlich konfigurierter und lokalisierter DAVF zeigen ein rein transvenöser und kombiniert transarterieller-transvenöser Zugangsweg im Vergleich zur TAE eine höhere Verschlussrate. Darüber hinaus war mittels TVE ein vollständiger Fistelverschluss häufiger in nur einer Intervention möglich. Als wichtige Komplikation während der TAE ist eine Ischämie zu nennen, die infolge einer Verteilung des Flüssigembolisates in Gefäße, die das Hirnparenchym sowie die Vasa nervorum versorgen, auftreten kann. Sind nur wenige, gut sondierbare Feeder nachweisbar, kann eine TAE in Erwägung gezogen werden. Hierbei muss die Anatomie der Zuflüsse genau nachvollzogen und der Katheter distal des Abgangs der potentiellen Vasa nervorum platziert werden. Eine TAE ist von Vorteil, wenn eine komplexe DAVF behandelt werden soll. Durch die Flussreduktion kann eine Symptomregredienz erzielt werden und die Anatomie der DAVF wird besser abgrenzbar, was die weitere Behandlungsplanung erleichtern kann. Zeigt sich eine Drainage in ein venöses Kompartiment oder handelt es sich um einen nichtfunktionalen Sinus, kann ein selektiver transvenöser Verschluss dieses Kompartiments bzw. Segments mittels Coiling erfolgen. Ist eine transvenöse Sondierung aufgrund einer Thrombose oder Stenose der Zielstruktur transfemoral oder transjugulär nicht möglich, ist die operative Freilegung des Sinus/der Vene eine effektive und sichere Methode, was auch in dieser Arbeit gezeigt werden konnte. In Zusammenschau dieser Ergebnisse sollte daher zum Verschluss einer DAVF, wenn dies technisch möglich ist, eine TVE oder kombiniert transarteriell-transvenöse Embolisation gegenüber einer alleinigen TAE bevorzugt werden. Folgende Limitationen der vorliegenden Arbeit sollten berücksichtigt werden: Es handelt sich um eine retrospektive, monozentrische Studie mit einer relativ geringen Patientenzahl. Es wurde eine heterogene Gruppe von DAVF behandelt. Da die bildgebenden Verlaufskontrollen teilweise in nur kurzen Intervallen vorliegen, können eine darüber hinausgehende Verschlusspersistenz sowie der klinische Verlauf der Patienten nicht beurteilt werden.

Die fokale Therapie mit hochintensivem fokussierten Ultraschall (HIFU) ist eine Option für die Behandlung von Prostatakrebs und wird häufig durch MRT nachuntersucht. Die bildgebende Beurteilung des postinterventionellen Status erfordert jedoch genaue Kenntnisse über typische verfahrensbedingte Veränderungen in der MRT der Prostata, die bisher nur spärlich vorhanden sind, insbesondere bei unilateraler HIFU-Behandlung und später Nachuntersuchung (nach ≥6 Monaten). Ziel dieser Arbeit war es, die Art und Häufigkeit solcher MRT-Befunde bei Patienten ohne Rezidiv 12 Monate nach einer HIFU-Hemiablation der Prostata zusammenzustellen.:I. Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1. Einleitung 1.2. Das Funktionsprinzip von HIFU 1.3. Die Entwicklung der klinischen Anwendungen von HIFU 1.4. Die Auswirkungen von HIFU auf histologischer Ebene 1.5. HIFU – die Charakteristika der postinterventionellen MR-Bildgebung 1.6. Diese Studie – Grundlagen und Entwicklung 2. Originalpublikation 3. Zusammenfassung der Arbeit 4. Abbildungen 4.1. Häufigkeit des Prostatakarzinoms 4.2. HIFU-Anwendungsformen 4.3. Inzidenzrate der häufigsten Tumorentitäten des Mannes 4.4. Rezidivfreies Überleben nach Prostatektomie in Abhängigkeit vom Gleason-Score 4.5. Funktionsprinzip der HIFU-Ablation 4.6. Intraprostatische Kavität nach HIFU am Tiermodell 4.7. Zeitliche Entwicklung des Prostatavolumens nach HIFU 4.8. Individuelle Volumenänderungen des therapierten und kontralateralen Prostatalappens 4.9. Volumenänderung des therapierten Prostatalappens 4.10. Typische Konfiguration der Flüssigkeitsansammlung 5. Tabellen 5.1. Formular für radiologische Befundung 5.2. Beispielergebnis für seitengetrennte Prostatavolumetrie 5.3. Patientencharakteristika 6. Literaturverzeichnis 7. Darstellung des eigenen Beitrags 8. Selbstständigkeitserklärung 9. Lebenslauf 10. Publikationen

Background Despite advances in the understanding of the disease and new treatment strategies, stage IV GC remains a relevant health issue worldwide. So far, treatment in stage IV GC has been limited to platinum-based chemotherapy. Furthermore, in the case of HER2 expression, the HER2-directed monoclonal antibody trastuzumab is an approved targeted drug for first line treatment. According to the pivotal randomized-controlled phase III registration study, trastuzumab is improving overall survival from 11.1 to 13.8 months. Unfortunately not all patients respond and almost all initial responders eventually develop resistance and experience tumor progression. The prospective multicenter VARIANZ study aimed to identify resistance biomarkers for HER2-targeted treatment in advanced gastric and esophagogastric junction cancer. More than 500 patients receiving medical treatment for stage IV GC were recruited in 35 German sites and followed for up to 48 months. HER2 status was assessed centrally by immunohistochemistry (IHC) and chromogenic-in-situ-hybridization (ISH). Within the study a HER2 test deviation rate (22.3%) between central and local test was associated with negative impact on patient survival. Patients who received trastuzumab with centrally confirmed HER2+ status (central HER2+/local HER2+) lived significantly longer compared to patients who received trastuzumab for local HER2+ but central HER2 stage IV GC (20.5 months vs. 10.9 months, 95% CI [8.2, 14.4], p<0.001) [1]. In the present analysis, we investigated methodological and biological variables that may promote deviating HER2 test results. Methods We analyzed HER2 testing procedures and participation in quality assurance programs of 105 participating local pathology laboratories. Furthermore, tumor localization, histological subtypes and tested tumor material (for local and central test) were compared between patients with centrally confirmed (central HER2+/local HER2+, n=68) and unconfirmed HER2 status (central HER2-/local HER2+, n=68). Results Central confirmation of the local HER2 IHC scores were seen for the majority of locally HER2- IHC 0/1 (172/178; 96.6%), but less frequently for locally IHC3+ (57/124; 46.0%) cases. Neither use of specific IHC methods nor participation in round robin tests varied between cohorts with confirmed (central HER2+/local HER2+, n=68) or deviating (central HER2-/local HER2+, n=68) HER2 test results. We found seven IHC antibodies (HercepTest, 4B5, SP3, CB11, UMAB36, A0485, EP3) in routine use in Germany, with HercepTest and 4B5 being the most commonly used. 46 (43.8%) local pathology laboratories participated in quality assurance programs for HER2 testing in GC. The distribution of the tested tumor material (primary tumor biopsy, surgical specimen, or biopsy from metastasis), related to both local and central HER2 testing, was comparable between the cohorts studied. Regarding tumor characteristics, deviating test results were more frequently found in GC vs. EGJC (69.1% vs. 39.7%; p=0.001). Within the Laurén histological classification deviating status (central HER2-/local HER2+) was more often found in diffuse type GC (23.5% vs. 5.9% for confirmed HER2+, p=0.004). Conclusion and Interpretation VARIANZ study has shown that GC patients with deviating HER2 test results had poor trastuzumab benefit [1], so we dedicated this work to the important question of the underlying causes of HER2 test deviations in GC. Our analysis demonstrates that neither the antibody platform used for IHC nor participation in round robin tests of local pathology institutes correlated with the deviation rate for HER2 test results. In contrast, we found that tumor characteristics such as primary tumor location and histological phenotype had an impact on test deviations: more HER2 test deviations were seen in distal GC compared to EGJC as well as in the diffuse versus intestinal subtype according to Laurén’s classification. One main limitation of our study is the so far barely used IHC HER2-antibody CB11 for central testing. However, in our study its highly specific properties [2–4] enabled it to identify patients who benefited from trastuzumab. In contrast to breast cancer HER2 is very heterogeneously expressed in GC [5, 6]. Due to this different expression, the HER2 testing scheme was adapted for GC [7]. Nevertheless, the success of HER2-targeted therapy in GC lags significantly behind breast cancer therapy [5]. HER2 heterogeneity is a known issue in GC, even in early stages [8]. Although much has been published [6, 9–11] , there is no generally agreed definition for HER2 heterogeneity or diagnostic procedure to identify HER2 heterogeneity. There are different approaches, for example using the relative number of HER2+ stained tumor cells [10, 12] or the deviation in HER2 status in a set of primary biopsies [13]. HER2 heterogeneity has already been associated with limited trastuzumab benefit and decreased overall survival in trastuzumab treated patients [1, 13, 14]. We conclude that the central confirmation of the HER2 status is a correlate of lower HER2 heterogeneity and may serve as an indicator for better treatment efficacy of trastuzumab. Further we assume that for distal GC location and for the diffuse subtype where HER2 positivity in general is less common [2, 15–18] weak HER2 expression and intratumoral heterogeneity account for more deviating test results. In our view, HER2 diagnostic scheme for GC should be adapted. Adaption of HER2 thresholds to identify patients benefiting from trastuzumab treatment has been already postulated [1, 17]. Our data suggests that only patients with low HER2 heterogeneity may benefit from trastuzumab treatment. For the selection of patients with low HER2 heterogeneity, the above tumor characteristics, such as tumor localization and histological subtype, should be reported. EGJC and the intestinal subtype are positive indicators of the presence of low HER2 heterogeneity. The use of highly specific IHC antibodies should be preferred. Furthermore, a positive result in IHC should always be confirmed by the examination of a paired specimen and the percentage of positive stained tumor cells should be reported. This might improve survival outcomes with targeted treatment, prevent overtreatment and associated side effects and costs and may enable successful studies of other promising HER2 targeting drugs.

Die photodynamische Therapie (PDT) ist eine minimalinvasive, zielgerichtete Therapie solider Tumore, die mit geringen Nebenwirkungen einhergeht. Unter dieser Behandlung zeigen sich ablative Effekte, Gefäßokklusionen und eine Immunstimulationen. Das Wirkprinzip besteht in der Photoaktivierung von nicht-toxischen, lichtreaktiven Photosensibilisatoren (PS), die durch Energieabgabe zur Bildung von Singulettsauerstoff führen, welcher reaktive Sauerstoffspezies bildet. Diese Produkte schädigen die Tumorzellen durch schnelle Inaktivierung lokal und lösen dadurch Apoptose- und Nekroseprozesse aus, wodurch Damage associated molecular patterns freigesetzt werden können. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Effekten der untersuchten PDT auf die Immunzellpopulationen im Harnblasenkarzinom. In der Therapie maligner Hanblasentumore ist kein Standardverfahren der PDT etabliert. Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat (THPTS) als PS mit seinem Absorbtionsmaximum im nahen Infrarotbereich (760nm) ermöglicht eine Gewebepenetration von bis zu 15mm und damit die Therapie muskelinvasiver Tumore. Sicherheit und Effektivität durch eine signifikante Reduktion der Tumormasse sind an einem orthotopen Rattenharnblasenmodell, welches der vorliegenden Arbeit als Untersuchungsmaterial dient, nachgewiesen. Der Wirkpfeiler der Immunreaktion wurde im Vorfeld lichtmikroskopisch eruiert. Ziele der Arbeit Die vorgestellte Promotion soll eine Charakterisierung der primären lokalen adaptiven Immunreaktion durch die THPTS-PDT im Harnblasenkarzinom eines orthotopen Rattenmodells vornehmen. Methodik Die Harnblasengewebeschnitte stammen aus den Vorarbeiten der Forschungsgruppe. Als Versuchstiere wurden weibliche F344 Fischerratten verwendet, die einer Inzuchtlinie entstammen und sich als ein immunkompetentes orthotopes Harnblasenmodell eignen. Zur Bildung des Harnblasenkarzinoms wurden AY-27 Urothelkarzinomzellen verwendet. Zur Tumorinokulation wurden die Urothelkarzinomzellen transurethral in die Harnblase der Fischerratten instilliert. So bildeten sich innerhalb von zehn Tagen multifokale Harnblasenkarzinome unterschiedlicher Invasionstiefe. Am zehnten Tag erfolgte die THPTS-PDT. Die lokal behandelte Gruppe (LAG) erhielt den Wirkstoff transurethral. Bei der systemisch behandelten Gruppe (SAG) wurde der Wirkstoff i.v. verabreicht. Die Kontrollgruppe (COG) erhielt Phosphat-gepufferte Saline transurethral. Daraufhin wurden die Gruppen mithilfe einer Glasfaser mit einem 760nm-Laser bestrahlt. Nach 14d wurden die Tiere getötet und die Harnblasen entnommen. Es konnten Schnitte von insgesamt n=26 Ratten untersucht werden: nicht-bestrahlte Kontrollgruppe (COG, n=9), lokale Applikation von THPTS (LAG, n=8), systemische Applikation von THPTS (n=4). Das Gewebe wurde immunhistochemisch für die Fluoreszenzmikrokopie nach einem standardisierten Protokoll gefärbt. Dazu erfolgte das Entparaffinieren und die Antigendemaskierung mittels basischen Puffers im Dampfgarer und Dimethylsulfoxid-Triton X-100-Tris-buffered-Saline. Es wurde mit bovinem Serumalbumin und Ziegen-Normalserum für 2h geblockt und mit den Primärantikörpern zur Doppelmarkierung über Nacht inkubiert. Die genutzten Primärantikörperkombinationen sind CD45/CD3, CD3/CD8, CD3/CD4 und CD19. Danach wurden fluoreszierende oder biotinylierte Sekundärantikörper genutzt, wobei letztere wiederum mit fluoreszierendem Streptavidin gekoppelt wurden. Schließlich erfolgte die Kernmarkierung mittels Diamino-Phenylindol (DAPI). Zu jeder Färbung wurde eine Negativkontrolle angefertigt. Die Antikörper wurden in Gewebe mit erhöhter Expression der Zielepitope etabliert und daraufhin auf das Rattenharnblasengewebe übertragen sowie für die Doppelimmunfluoreszenz kombiniert. Die Bildaufnahmen erfolgten mithilfe des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops mit einem Plan- Apochromat 40x/0.95 Luft-Objektiv. Jede Aufnahme besteht aus vier Kanälen entsprechend der genutzten Laser: 405nm für die Kerne, 488nm für die Mausantikörper, 561nm für die Kaninchenantikörper und eine Durchlichtaufnahme zur Strukturdarstellung. Jeweils neun Bilder bilden eine quadratische Feldaufnahme mit Ausnahme der Lymphzellcluster, bei denen sich die zusammengefügten Bilder nach der Größe richten. Pro Bereich wurden abhängig von der Ausdehnung maximal fünf Feldaufnahmen angerfertigt. Die Bereiche sind Tumorzentrum, Tumorrand, tumorfreier Bereich und Lymphzellcluster. Letztere sind als Lymphzellansammlungen im Harnblasengewebe unabhängig vom Tumor definiert. Zu analysierende Bereiche (ROI, regions of interest) wurden manuell definiert und mithilfe der Software Fiji (ImageJ2) und einem eigens programmierten Macro die Fläche und die positiv markierten Zellen ermittelt. Die statistische Analyse erfolgte mittels der Software Graph Pad Prism 9.3.1 mit einem Signifikanzniveau von p<0,05%. Ergebnisse Der Datensatz besteht aus insgesamt 1732 Feldaufnahmen, die sich wiederum aus über 14500 High- Powerfield-Bildern zusammensetzen und analysiert wurden. Für die Färbungen ergeben sich pro Tumorareal aufgeschlüsselt auf die Harnblasenbereiche folgende Anzahl an Mittelwerten zur statistischen Analyse: Tumorzentrum COG 24, LAG 15-17, SAG 9-10; Tumorrand COG 23-24, LAG 16-17, SAG 9-10; Tumorfreier Bereich COG 18-19, LAG 12-14, SAG 8; Lymphzellcluster COG 10-15, LAG 16-21, SAG 3-5 Folgende Immunfluoreszenzmarkierungen konnten etabliert werden: CD45-Antikörper zur Darstellung der gesamten Leukozytenpopulation, CD3-Antikörper für die T-Zellen, CD8-Antikörper für den Subtyp der zytotoxischen T-Zellen (CTL), der CD4-Antikörper für den Subtyp der T-Helferzellen (TH) und der CD19-Antikörper für die B-Zellen. Kreuzreaktionen bzw. Hintergrundfluoreszenz traten vor allem im Tumorstroma und dem Endothel bei CD45-, CD19- und CD4-Antikörper auf. Das Signal-Rausch- Verhältnis war jedoch in den meisten Fällen aufgrund der intensiveren Markierung der Lymphozyten- Zellmembranen für die quantitative Analyse ausreichend. Lediglich die Markierung der T-Helferzellen mit dem CD4-Antikörper bereitete durch stärkere Kreuzreaktivitäten Probleme. In der quantitativen Analyse zeigen sich folgende signifikante Ergebnisse: - Reduzierte T-Zelldichte (CD3) der SAG gegenüber der COG im tumorfreien Bereich - Erhöhte T-Zelldichte (CD45/CD3) der SAG gegenüber der LAG im Tumorrand - Reduzierte cytotoxische T-Zelldichte (CD3/CD8) der SAG gegenüber der COG im tumorfreien Bereich - Reduzierte T-Helferzellen (CD3/CD4) der LAG gegenüber der COG im Tumorrand Zieht man die nicht signifikanten Tendenzen der einzelnen Gruppen mit in Betracht, besteht eine verstärkte Immunzelldichte im Tumorzentrum der LAG, wohingegen eine Abnahme dieser im Tumorrand auffällt. Die SAG weist punktuell Reduktionen in der Peripherie, nämlich den tumorfreien Bereichen und Lymphzellclustern auf. Veränderungen im gesamten Tumorbereich, zusammengefasst aus -center und -rand, sind in keiner Immunzellmarkierung vorhanden. Diskussion Die Auswahl der Antikörper erfolgte gemäß aktueller Literatur. Die Spezifität der Immunzellmarkierungen wurde durch die Verwendung von Doppelmarkierungen erhöht. Die Auswahl der untersuchten Bereiche (Tumorzentrum, Tumorrand, tumorfreie Region und Lymphzellcluster) ergeben ein Gesamtbild der Aktivierung des Immunsystems in der Harnblase und erreichen durch die Zahl von insgesamt 1272 Feldaufnahmen des Tumorbereichs eine hohe Repräsentativität. In der Literatur wird die zentrale Stellung der Immunreaktion durch verschiedene PDTs für die Metastasen- und Rezidivkontrolle beschrieben. Dieser Effekt konnte anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht untersucht werden. Bei Betrachtung des gesamten Tumorbereichs zeigen sich in keiner Immunzellmarkierung signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen, was eine zusätzliche primäre Tumorkontrolle unwahrscheinlich werden lässt. Hinweise auf Einflüsse auf die Ausbildung einer differenzierten Anti-Tumor-Immunität lassen sich in einer Reduktion der Immunzelldichte im Tumorrand der LAG bei T- und T-Helferzellen und ebenfalls eine Verringerung bei T- und T-Killerzellen in der Peripherie der SAG sehen. Diese Ergebnisse könnten auf eine Migration bei der LAG ins Tumorzentrum und bei der SAG zum Tumorrand verweisen, die sich auch in der tendenziell erhöhten Immunzelldichte des Tumorzentrums der LAG widerspiegelt. Systemische Anti-Tumor-Effekte bleiben so weiterhin vorstellbar. In der vorliegenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf die Erfassung der Dichte von Immunzellen in den relevanten Bereichen gelegt. Eine Analyse der Aktivität z.B. der CTL erfolgte nicht. Der Einfluss von Immunzellen auf die Prognose des Harnblasenkarzinoms wird kontrovers diskutiert und ist nicht eindeutig einzuordnen. Kombinationstherapien mit ionisierender Strahlung, Checkpointinhibitoren oder Low-Dose Cyclophosphamid könnten verbesserte Resultate in zukünftigen Arbeiten ermöglichen. Weiterhin sollte ein Augenmerk auf den Zeitrahmen zur Detektion von immunogenen Effekten gelegt werden, vor allem, um akute (48 Stunden) und langfristige (bis zu 90 Tagen) zu detektieren. Subtypenanalyse von T-Helfer- und zytotoxischen T-Zellen sollten erfolgen, um die Anti-Tumor- Immunität differenzierter beurteilen zu können.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Einleitung 2.1 Urothelkarzinom 2.1.1 Epidemiologie und Ätiologie des Urothelkarzinoms 2.1.2 Aktuelle Therapieoptionen des muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms 2.2 Anti-Tumor-Immunität 2.2.1 Ausgewählte Prozesse des Immunsystems zum Verständnis der Anti-Tumor-Immunität 2.2.2 Tumormicroenvironment 2.2.3 Übersicht über die Hauptformen des Zelltods und immunmodulatorische Effekte 2.2.4 Damage associated molecular patterns 2.2.5 Tumorantigene 2.3 Photodynamische Therapie 2.3.1Wirkprinzip 2.3.2 Photosensibilisatoren 2.3.3 Einfluss der PDT auf das Immunsystem 2.3.4 Die PDT des Harnblasenkarzinoms 2.3.5 Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat: Ein neuer Photosensibilisator zur Therapie des MIBC 3 Ziele der Arbeit 4 Material und Methoden 4.1 Materialien 4.1.1 Asservierte Harnblasengewebeschnitte 4.1.2 Liste der Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Software und Geräte 4.2 Methoden 4.2.1 Vorarbeiten der Forschungsgruppe 4.2.2 Färbeprotokoll Immunfluoreszenz 4.2.3 Etablierung der Antikörper 4.2.4 Aufnahmetechnik 4.2.5 Datenerhebung 4.2.6 Statistik 5 Ergebnisse 5.1 Versuchstiere 5.2 Charakterisierung desDatensatzes 5.3 Qualitative Auswertung 5.4 Quantitative Auswertung 5.4.1 Vergleich der Immunzelldichte in Abhängigkeit von der Behandlung 5.4.1.1 CD45 5.4.1.2 CD3 5.4.1.3 CD8 5.4.1.4 CD4 5.4.1.5 CD19 5.4.1.6 CD45/CD3 5.4.1.7 CD3/CD8 5.4.1.8 CD3/CD4 5.4.1.9 Deskriptive und analytische Daten der Statistik 5.4.1.10 Zusammenfassung des Vergleichs der Immunzelldichten 6 Diskussion 6.1 Methodendiskussion 6.1.1 Auswahl der Antikörper 6.1.2 Beurteilung der CD3-Antikörper 6.1.3 ROI-Auswahl und Beurteilung des Datensatzes 6.2 Ergebnisdiskussion 6.2.1 Beurteilung der Immunreaktion der THPTS-PDT im Kontext anderer PDTs 6.3 Beurteilung der Immunreaktionen beim Harnblasenkarzinom 6.4 Aussichtsreiche Kombinationstherapien 6.5 Umgang mit Schwierigkeiten 7 Schlussbemerkung 8 Zusammenfassung 9 Darstellungsverzeichnis 9.1 Abbildungen 9.2 Tabellen 10 Literaturverzeichnis 11 Anlagen 11.1 Färbeprotokolle 11.1.1 Immunfluoreszenz Doppelmarkierung CD45/CD3 11.1.2 Immunfluoreszenz Doppelmarkierung CD3/CD4 11.1.3 Immunfluoreszenz Doppelmarkierung CD3/CD8 11.1.4 Immunfluoreszenz Einfachmarkierung CD19 11.1.5 Lichtmikroskopie Standardprotokoll in der Etablierungsphase 12 Selbstständigkeitserklärung 13 Lebenslauf 14 Publikationen 15 Danksagung

Trotz einer multimodalen Standardtherapie des Glioblastoma multiforme bestehend aus Resektion, Bestrahlung (IR) und Chemotherapie gehört der WHO Grad IV Tumor mit einer medianen Überlebensrate von nur 14 bis maximal 48 Monaten zu den unheilbaren Tumorentitäten. Die Erweiterung des Therapiestandards um eine Immuntherapie und Photodynamische Therapie könnte die Prognose der Patienten in Zukunft verbessern. Ziel dieser Arbeit war es, eine effektive murine dendritische Zellvakzine zu generieren. Durch die Vorbehandlung der Tumorzellen mit THPTS-PDT und/oder Bestrahlung sollte eine optimale tumorspezifische Aktivierung von Immunzellen induziert werden.

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Die vergangenen Jahre haben eindrucksvoll gezeigt, dass CD19 und BCMA chimäre Antigen-Rezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien nicht nur das Potential haben, die progres¬si-ons¬freie Überlebenszeit von Patienten mit hämatologischen Neoplasien zu verlängern, sondern auch diese erkrankten Menschen in einigen Fällen dauerhaft zu heilen. Trotz der noch immer bestehenden großen Herausforderung CAR-T-Zell-Therapien für mehr Tumorentitäten verfügbar zu machen, insbesondere was die Bekämpfung solider Tumore betrifft, haben die Entdeckung neuer Tumorantigene und Checkpoint-Inhibitoren in den letzten Jahren dazu beigetragen, dass sich immuntherapeutische Ansätze, insbesondere die der adoptiven Immunzelltherapie stetig weiterentwickeln konnten. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene maligne Bluterkrankung mit schlechten Überlebens¬prognosen und die am häufigsten auftretende Leukämieform bei Erwachsenen. AML ist somit eine der hämatologischen Krebserkrankungen, die noch immer dringend medizini¬sche Innovation benötigt. CAR-T-Zell-Therapien gelten als attraktive neue Strategie, um AML zu bekämpfen, da die leukämischen Blasten empfindlich für T-Zell-vermittelte Lyse sind. In dieser Studie stellen wir Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec) 6 als neues Zielmolekül für CAR-T-Zell-Therapien in AML vor. Wir entwickelten einen Siglec 6-spezifischen CAR mit einer vom humanen monoklonalen Antikörper JML 1 abgeleiteten Antigen-bindenden Domäne. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Siglec 6 auf AML-Zelllinien als auch primären AML-Blasten sowie leukämischen Stamm¬zellen (LSCs) detektierbar ist. Die Behandlung mit Siglec 6 CAR-T-Zellen vermittelte eine anti-leukämische Reaktivität, die mit der Siglec 6-Expressionsstärke in präklinischen Modellen korrelierte. So bewirkten Siglec 6 CAR-T-Zellen eine komplette Remission in einem Xenograft-AML-Modell mit immundefizienten Mäusen und Tumorzellen mit hoher Siglec 6-Expression (NSG/U937). Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass Siglec 6 nicht auf gesunden hämatopoetischen Stamm(vor)läuferzellen (HSC/Ps) exprimiert wird. Unsere Daten legen damit nahe, dass die Siglec 6 CAR-T-Zell-Therapie zur AML-Behandlung eingesetzt werden kann, ohne dass eine nachfolgende hämatopoetische Stammzelltransplantation notwendig wird. In gesunden Blutzellen detektierten wir Siglec 6 auf einer Fraktion naiver B-Zellen und B-Gedächtniszellen sowie basophiler Gra¬nulozyten, sodass insgesamt mit einer limitierten On-Target Off-Tumor-Reaktivität ge¬rechnet werden kann. Die fehlende Siglec 6-Expression auf gesunden HSC/Ps ist ein sig¬nifikantes Unterscheidungsmerkmal zur Expression anderer zuvor untersuchter AML-CAR-Antigene wie CD33 oder CD123. Auch CD70 wird von HSC/Ps nicht exprimiert und wurde in dieser Studie als möglicher Kombinationspartner für duales Targeting in AML evaluiert. Dabei konnten wir feststellen, dass mehrheitlich mindestens eines der beiden CAR-Antigene, Siglec 6 oder CD70, von AML-Zelllinien und primären AML-Zellen expri¬miert wird. Ebenso ließ sich experimentell bestätigen, dass Siglec 6 CAR-T-Zellen mit JML 1-single chain variable fragment (scFv) und jeweils optimierten CAR-Spacersequen¬zen, keine signifikanten Funktionalitätsunter¬schiede aufweisen. Die Vorbehandlung von AML-Zellen mit Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren konnte die zytolytische Aktivität der Siglec 6 CAR-T-Zellen durch Steigerung der Siglec 6-Oberflächenexpression auf den Targetzellen erhöhen. Sowohl Siglec 6 als auch CD70 CAR-T-Zellen konnten erfolgreich mit virusfreiem Gentransfer hergestellt werden, wobei die getesteten CD70 CAR-Kon¬strukte aufgrund der CD70-Expression aktivierter T-Zellen zu Fratricide führten und die CAR-Antigen-abhängige als auch unabhängige Proliferation der CD70 CAR-T-Zellen limitierte. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass sowohl Siglec 6 als auch CD70 hilf¬reiche Targetantigene zur CAR-T-Zellbehandlung der AML sein können und dass eine klinische Überprüfung, insbesondere von Siglec 6 CAR-T-Zellprodukten, gewährleistet ist. / In recent years, it could be impressively demonstrated that CD19 and BCMA chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies not only have the potential of prolonging progression-free and overall survival of patients with hematological malignancies, but in many cases are even able to cure them. Despite major challenges still hampering the broad applicability of CAR T-cells therapies, especially in the combat against solid tumors, the discoveries of novel tumor antigens and checkpoint inhibitors in past years have contributed to the steady development of immunotherapeutic approaches particularly those of adoptive immune cell therapy. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous malignant blood disorder with poor survival prognosis that accounts for the most common form of leukemia in adults. Hence, AML is still one of the hematologic cancers with high unmet medical need. CAR T-cell therapies are considered an attractive new strategy to tackle AML as leukemic blasts are susceptible to T-cell-mediated lysis. In this study, we introduce sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec)-6 as a novel target for CAR T-cell treatment in AML. We developed a Siglec-6-specific CAR with an antigen-binding domain derived from the human monoclonal antibody JML-1. Our studies revealed that Siglec-6 is detectable on AML cell lines as well as primary AML blasts and leukemic stem cells (LSCs). Siglec-6 CAR T-cell treatment conferred anti-leukemic reactivity that correlated with Siglec-6 expression levels in preclinical models. Thus, Siglec-6 CAR T-cells induced complete remission in a xenograft AML model with immunodeficient mice and engrafted tumor cells with high Siglec-6 expression (NSG/U937). Furthermore, we observed that Siglec-6 is not expressed on healthy hematopoietic stem/precursor cells (HSC/Ps). Our data suggest that Siglec-6 CAR T-cell therapy can be effectively used for AML treatment without the need for subsequent hematopoietic stem cell transplantation. In healthy blood cells, we detected Siglec-6 on a fraction of naïve and memory B cells as well as on basophilic granulocytes, therefore overall on-target off-tumor reactivity may be expected to be limited. The lack of Siglec-6 expression on healthy HSC/Ps is a significant distinctive feature from the expression of other previously studied AML CAR antigens e.g. CD33 or CD123. Also, CD70 is not expressed by HSC/Ps and was evaluated in this study as potential combination partner for dual targeting in AML. We found that the majority of AML cell lines and primary AML cells are expressing at least one of the two antigens, either Siglec-6 or CD70. We also confirmed that Siglec-6 CAR T-cells with JML-1-single chain variable fragment (scFv) and two optimized CAR spacer sequences did not show significant differences in function. Pretreatment of AML cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors could augment cytolytic activity of Siglec-6 CAR T-cells by increasing Siglec-6 surface expression on AML target cells. Both, Siglec-6 and CD70 CAR T-cells were successfully manufactured via non-viral gene transfer, whereby tested CD70 CAR constructs induced fratricide due to CD70 expression of activated T-cells resulting in limited CAR antigen-dependent as well as antigen-independent proliferation of CD70 CAR T-cells. In summary, this study suggests that Siglec-6 as well as CD70 may be useful target antigens for CAR T-cell treatment of AML and warrants clinical investigation of Siglec-6 CAR T-cells in particular.

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During recent years, significant advances have been made in the field of molecular therapy in urologic oncology, mainly for advanced renal cell carcinoma. In this hitherto largely treatment-refractory disease, several agents have been developed targeting the von Hippel-Lindau metabolic pathway which is involved in carcinogenesis and progression of the majority of renal cell carcinomas. Although cure may not be expected, new drugs, such as the multikinase inhibitors sorafenib and sunitinib and the mammalian target of rapamycine inhibitor temsirolimus, frequently stabilize the disease course and may improve survival. Fewer data are available supporting molecular therapies in prostate, bladder, and testicular cancers. Preliminary data suggest a potential role of high-dose calcitriol and thalidomide in hormone-refractory prostate cancer, whereas targeted therapies in bladder and testicular cancers are still more or less limited to single-case experiences. The great theoretical potential and the multitude of possible targets and drug combinations, however, support further research into this exciting field of medical treatment of urologic malignancies. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.