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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-26Bitstream added on 2014-06-13T18:41:37Z : No. of bitstreams: 1 benedetti_acep_dr_arafcf.pdf: 555249 bytes, checksum: c34c45268021bed2af4612d36cdf1d73 (MD5) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A descoberta de resíduos agrícolas, como fonte de energia renovável tem colaborado para o desenvolvimento industrial e preservação do meio ambiente. Desta maneira, a degradação da parede celular destes resíduos tem grande importância na fabricação de pães, alimentos, bebidas, têxtil, papel e celulose entre outros produtos. A degradação enzimática destes polímeros esta se tornando uma alternativa mais atraente do que a utilização de substâncias químicas e processos mecânicos. Alguns fungos termófilos participam desta degradação enzimática, como Humicola grisea var. thermoidea, isolado do solo, é conhecido como bom produtor do complexo xilanolítico. Além deste, um fungo termófilo isolado da polpa do fruto cupuaçuzeiro em decomposição foi estudado e produziu xilanase. Esses fungos foram mantidos em meios sólidos contendo ágar e farinha de aveia. O fungo isolado da polpa do fruto cresceu em meio liquido empregando diferentes resíduos agrícolas como fonte de carbono. Dentre os vários resíduos empregados para se otimizar a produção de xilanase, o melhor foi o sabugo de milho. Esse foi utilizado nos experimentos na proporção de 1,0% (m/v), em meio líquido contendo 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 0,1% NH4Cl; 0,5% água de maceração de milho. O pH ótimo foi 5,0 e a temperatura ótima de 60ºC. A xilanase presente no extrato clarificado em caulim apresentou cinética Michaeliana com Km de 10,41 ± 0,282 mgmL-1 e Vmax 3,32 ± 0,053 U (mg protein)-1. Para acompanhar o processo de clarificação da enzima solúvel realizou-se SDS-PAGE verificando a presença de uma banda protéica com atividade xilanolítica de massa molecular de aproximadamente 30kDa e a Cromatografia Sílica Gel P60 para verificar os produtos da hidrólise da xilana em função do tempo e da associação de xilosidase do fungo termófilo Humicola com a xilanase do fungo isolado do fruto... / The researches of agricultural residues as renewable energy sources have been contributing for the industrial development and the environment conservation. Thus, the degradation of these residues’ cell walls has great importance in fabrication of bread, food, drinks, textile, paper, cellulose, and other products. The enzymatic degradation of such polymers is becoming an attractive option when compared to the use of chemical substances and mechanical processes. Some thermophilic fungi take role in this enzymatic degradation, such as Humicola grisea var. thermoidea, isolated from soil, and is known to be a good producer of the xylanolytic complex. Besides it, another thermophilic fungus, isolated from the Theobroma grandiflorum decomposing fruit pulp, was studied and also produced xylanases. These fungi were kept in solid media containing agar and oat bran. The fungus isolated from the fruit pulp grew in liquid media in wich different kinds of agricultural residues were employed as carbon sources. Among the various types of residues that were used to optimize the xylanase production, corn cobs proved to be the best one. It was used in assays in a proportion of 1,0% (m/v), in liquid media containing 0.1% of CaCO3, 0.5% of NaCl, 0.1% of NH4Cl, and 0.5% of corn steep liquor. The pH optima was 5.0 and the temperature optima was 60ºC. The xylanase present in the kaolin clarified extract showed a Km of 10.41 ± 0.282 mg.mL-1, and Vmax 3.32 ± 0.053 U (mg.protein)-1. In order to follow the soluble enzyme clarification process, SDS-PAGE was run, verifying the presence of a proteic band with xylanolytic activity of, approximately, 30kDa of molecular mass. Furthermore, Silica Gel 60 Thin Layer Chromatography (TLC) was used to verify the xylan hydrolysis products in function of time and the association of Humicola sp. thermophylic fungus xylosidase with the xylanase produced by the fruit pulp... (Complete abstract click electronic access below)

Polyphenol oxidases are enzymes that catalyze the oxidation of certain phenolic substrates to quinones in the presence of molecular oxygen. Polyphenol oxidases are widely used in several applications. In food industry, they are used for enhancement of flavor in coffee, tea and cocoa production, and determination of food quality. In medicine, they have several uses in treatments of Parkinson&rsquo / s disease, phenlyketonurea and leukemia. In wastewater treatment, they are used for the removal of phenolic pollutants from wastewaters. In pharmaceutical industry, differentiation of morphine from codeine is possible by means of polyphenol oxidase immobilized electrodes. In this study, a thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus was evaluated in terms of poyphenol oxidase production. The effect of different nutrient sources, inducers and fermentation parameters on enzyme production were investigated and maximum PPO activity of 97 U/ml was observed in bioreactor experiments at 50&deg / C, 400 rpm and pH 8.0 in a fermentation medium containing 1.4% yeast extract, 0.3% MgSO4, 1% KH2PO4, 0.003% CuSO4, 0.032% gallic acid. Type of polyphenol oxidase produced by Thermomyces lanuginosus was determined as laccase. For biochemical characterization studies, the enzyme was enriched by electrophoresis. Temperature and pH optima for the enzyme were determined as 60&deg / C and 8.0, respectively. Enzyme retained 67% activity after 1 h incubation at 80&deg / C and retained 87% of its activity after 1 hour of incubation at pH 9.0 at room temperature. The enzyme obeys Michealis-Menten kinetics with Km and Vmax values being 5 mg /ml catechol and 38 U/ml, respectively. Molecular weight of the enzyme was determined as 29 kDa and isoelectric point of enzyme was found to be approximately 6.0.

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Orientador: Rubens Monti / Banca: Rubens Monti / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Olga Luisa Tavano / Banca: Maristela de Freitas Sanches Peres / Banca: Luis Vitor Silva do Sacramento / Resumo: A descoberta de resíduos agrícolas, como fonte de energia renovável tem colaborado para o desenvolvimento industrial e preservação do meio ambiente. Desta maneira, a degradação da parede celular destes resíduos tem grande importância na fabricação de pães, alimentos, bebidas, têxtil, papel e celulose entre outros produtos. A degradação enzimática destes polímeros esta se tornando uma alternativa mais atraente do que a utilização de substâncias químicas e processos mecânicos. Alguns fungos termófilos participam desta degradação enzimática, como Humicola grisea var. thermoidea, isolado do solo, é conhecido como bom produtor do complexo xilanolítico. Além deste, um fungo termófilo isolado da polpa do fruto cupuaçuzeiro em decomposição foi estudado e produziu xilanase. Esses fungos foram mantidos em meios sólidos contendo ágar e farinha de aveia. O fungo isolado da polpa do fruto cresceu em meio liquido empregando diferentes resíduos agrícolas como fonte de carbono. Dentre os vários resíduos empregados para se otimizar a produção de xilanase, o melhor foi o sabugo de milho. Esse foi utilizado nos experimentos na proporção de 1,0% (m/v), em meio líquido contendo 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 0,1% NH4Cl; 0,5% água de maceração de milho. O pH ótimo foi 5,0 e a temperatura ótima de 60ºC. A xilanase presente no extrato clarificado em caulim apresentou cinética Michaeliana com Km de 10,41 ± 0,282 mgmL-1 e Vmax 3,32 ± 0,053 U (mg protein)-1. Para acompanhar o processo de clarificação da enzima solúvel realizou-se SDS-PAGE verificando a presença de uma banda protéica com atividade xilanolítica de massa molecular de aproximadamente 30kDa e a Cromatografia Sílica Gel P60 para verificar os produtos da hidrólise da xilana em função do tempo e da associação de xilosidase do fungo termófilo Humicola com a xilanase do fungo isolado do fruto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The researches of agricultural residues as renewable energy sources have been contributing for the industrial development and the environment conservation. Thus, the degradation of these residues' cell walls has great importance in fabrication of bread, food, drinks, textile, paper, cellulose, and other products. The enzymatic degradation of such polymers is becoming an attractive option when compared to the use of chemical substances and mechanical processes. Some thermophilic fungi take role in this enzymatic degradation, such as Humicola grisea var. thermoidea, isolated from soil, and is known to be a good producer of the xylanolytic complex. Besides it, another thermophilic fungus, isolated from the Theobroma grandiflorum decomposing fruit pulp, was studied and also produced xylanases. These fungi were kept in solid media containing agar and oat bran. The fungus isolated from the fruit pulp grew in liquid media in wich different kinds of agricultural residues were employed as carbon sources. Among the various types of residues that were used to optimize the xylanase production, corn cobs proved to be the best one. It was used in assays in a proportion of 1,0% (m/v), in liquid media containing 0.1% of CaCO3, 0.5% of NaCl, 0.1% of NH4Cl, and 0.5% of corn steep liquor. The pH optima was 5.0 and the temperature optima was 60ºC. The xylanase present in the kaolin clarified extract showed a Km of 10.41 ± 0.282 mg.mL-1, and Vmax 3.32 ± 0.053 U (mg.protein)-1. In order to follow the soluble enzyme clarification process, SDS-PAGE was run, verifying the presence of a proteic band with xylanolytic activity of, approximately, 30kDa of molecular mass. Furthermore, Silica Gel 60 Thin Layer Chromatography (TLC) was used to verify the xylan hydrolysis products in function of time and the association of Humicola sp. thermophylic fungus xylosidase with the xylanase produced by the fruit pulp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-07-29T12:03:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Cristine_Cysneiros.pdf: 1284054 bytes, checksum: c3e0f947790961725c6b67bf30fac547 (MD5) Previous issue date: 2009-04-03 / The objective of this work was to produce and characterize four multi enzyme complexes from the fungus Humicola grisea var. thermoidea, maintained for 96 hours at 42oC in growth media containing different carbon sources: Marandu grass; soybean seedcoats; Tifton 85 hay; and corn forage. Different amounts of cellulase, xylanase and -glucosidase enzymes were obtained depending on the different carbon sources. Cellulase presented increased activity in temperatures between 40ºC and 50ºC. The observed optimum temperature range for xylanase and β-glycosidase was from 50ºC and 60ºC. Optimum pH for cellulase activity was 6.0 when fungus growth occurred in Tifton hay, corn forage, and soybean seedcoats. When the enzyme was obtained from medium containing Marandu grass, optimum enzyme activity occurred at pH 5.5. Regardless of the carbon source, xylanase activity was higher at pH 6.0. As for β-glucosidase, optimum activity was observed at pH 5.5 for Tifton media as compared to pH 6.5 for corn and soybean containing media. For grass Marandu, the activity of the enzyme was maximum in the range 5.5 to 6.5. Cellulase produced from all growth media were maintained stable after incubation for 60 minutes at 39°C. Xylanase presented thermal stability during 240 minute incubation period at 50°C. Activity stability of β-glycosidase varied according to carbon source and presented 66.7 to 125.75% activity at 50°C for 240 minutes. / Enzimas fibrolíticas exógenas são produzidas por cultura específica de bactérias ou fungos. São essenciais aos animais por estarem envolvidas na hidrólise dos componentes complexos das dietas em moléculas orgânicas mais simples como glicose, celobiose, xilose, aminoácidos, ácidos graxos, que são então usadas pelos microrganismos do rúmen e/ou pelo animal. Melhoras no desempenho dos ruminantes devido ao uso de enzimas fibrolíticas são atribuídas principalmente à maior degradação da fibra no rúmen, o que resulta em aumento da ingestão de energia disponível pelos animais. Os objetivos deste trabalho foram os de produzir e caracterizar quatro soluções enzimáticas, utilizando o fungo Humicola grisea var. thermoidea e avaliar seus efeitos por meio da digestibilidade verdadeira in vitro da matéria seca de quatro substratos: capim Marandu, casquinha de soja, feno de Tifton-85 e forragem de milho. As soluções enzimáticas foram produzidas a partir de quatro meios de culturas diferentes, contendo a fonte de carbono específica, durante 96 horas de cultivo, a 42°C. Foi observado que o fungo produziu as enzimas celulases, xilanase e -glicosidase em diferentes concentrações, o que foi dependente da fonte de carbono. A caracterização bioquímica mostrou que a celulase produzida apresentou maior atividade em temperatura entre 40ºC e 50°C. A temperatura ótima de xilanase e β-glicosidase foi entre 50 e 60°C. O pH ótimo da enzima celulase foi 6,0, quando o fungo cresceu em feno de Tifton, forragem de milho e casquinha de soja. Para o capim Marandu, a enzima apresentou atividade ótima em pH 5,5. Para as quatro fontes de carbono, a xilanase produzida apresentou pH ótimo de 6,0. Em relação a β-glicosidase, a atividade enzimática foi maior em pH 5,5, no meio com feno de Tifton. Para capim Marandu, a atividade da enzima foi máxima na faixa de 5,5 a 6,5. Quanto à forragem de milho e casquinha de soja, a enzima exibiu maior atividade em pH 6,5. A celulase produzida, nas quatro fontes de carbono, permaneceu estável após a incubação por 60 minutos, a 39°C. Xilanase produzida apresentou estabilidade térmica durante 240 minutos de incubação, a 50°C. A β-glicosidase, dependendo da fonte de carbono, manteve de 66,7 a 125,75% de sua atividade, a 50°C, durante 240 minutos. Para avaliar o potencial das soluções enzimáticas sobre a digestibilidade in vitro dos substratos, 2,5; 5,0 e 10 mL de cada solução foram aplicados, por aspersão, em 17 g dos seus respectivos substratos, moídos em peneira com malha de 1 mm de diâmetro. Após aspersão, as enzimas ficaram em contato com os substratos por 2 e 24 h (tempo de reação enzima-substrato), antes de serem incubados no rúmen. A digestibilidade in vitro da MS foi avaliada em líquido ruminal tamponado, durante o período de 12, 24, 48 e 96 h. Para cada substrato, foram incubados 34 sacos (4 níveis de enzimas x 4 períodos de incubação x 2 repetições x 1 branco x 1 testemunha). As soluções enzimáticas, em qualquer nível de enzimas, quando comparados aos tratamentos controle, aumentaram a digestibilidade da MS dos substratos, nos tempos de reação enzima-substrato e período de incubação no rúmen. Este estudo mostrou que enzimas fibrolíticas exógenas produzidas por H. grisea tem potencial para uso como aditivo em dietas de ruminantes