Streptococcus pyogenes is an important human pathogen. One of the most prominent virulence factors produced by S. pyogenes is SfbI, a surface adhesin composed of three domains: thioester domain (TED), proline-rich repeat domain (PRR) and fibronectin-binding repeat domain (FnBD). The structures and functions of TED and PRR and their contributions to the pathogenesis of streptococcal diseases are unknown. The interaction between PRR and its putative target, the intracellular actin cytoskeleton regulator Arp2/3, was investigated by both in vitro and in vivo studies. PRR was shown to inhibit Arp2/3-dependent actin polymerisation. The expression of PRR in HeLa cells caused disruption to the cytoskeleton of the cells. All data point towards a role of PRR in inhibiting the Arp2/3 complex but more evidence is needed to support this. The N-terminal domain of SfbI (TED) and four homologous domains from S. pyogenes, group G streptococci and Streptococcus pneumoniae were characterised by mass spectrometry, NMR spectroscopy and biochemical assays. All were shown to possess intramolecular thioester bonds, spontaneously formed between sides chains of Cys and Gln residues. Fibrinogen (Fg) was identified as the first binding target of bacterial TEDs with direct evidence that the thioester bond was involved in the interaction with Fg. A pull-down experiment using human plasma showed Fg is a specific binding partner of SfbI-TED. The binding sites were narrowed down to the thioester-forming Gln of SfbI-TED and Lys residues in the Fg-Aα chain, and binding potentially occurred via covalent isopeptide linkage. The data presented here suggest two new roles for SfbI, previously unknown in bacterial pathogenesis. The PRR may be the first bacterial inhibitor of the actin cytoskeleton acting by inhibiting the Arp2/3 complex. Thioester domains appear to be a shared common feature of surface proteins of many Gram-positive pathogens. They may form covalent crosslinks between bacteria and host tissue.

Les peptides et les protéines jouent un rôle central dans les processus biologiques. Les méthodes de production de ces molécules se sont fortement développées dans le but de déterminer leur structure, comprendre leurs fonctions et développer de nouvelles thérapies. En particulier, la synthèse chimique des protéines s’est fortement développée dans les années 1960 avec l’introduction de la chimie peptidique en phase solide (SPPS) par B. Merrifield. Depuis les années 1990, la combinaison de méthodes de ligation chimique natives et de stratégies d’assemblage séquentielles et convergentes ont permis la synthèse de nombreuses protéines. Cependant, la synthèse de protéines de haut poids moléculaires reste un défi synthétique. Il est donc important de développer de nouveaux systèmes de ligation chimique et des stratégies d’assemblage plus performantes. Une nouvelle méthode de ligation native, la ligation SEA, repose sur la capacité des segments bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) à réagir en milieu aqueux avec des cystéinyl peptides. Différents outils chimiques basés sur l’utilisation du groupement SEA ont été développés dans cette thèse. La première partie de ce manuscrit présente une méthode d’assemblage séquentiel de segments peptidiques en solution s’effectuant du N-terminal vers le C-terminal. Cette méthode a permis la synthèse du domaine N-terminal du facteur de croissance des hépatocytes (HGF). Afin de surmonter les limitations de l’assemblage en solution, la seconde partie de cette thèse porte sur le développement d’un procédé de synthèse de protéines par ligation native séquentielle en phase solide du N-terminal vers le C-terminal. Enfin, une dernière partie exploite la réactivité des segments bis(2-selanylethyl)amido (SeEA) et leur potentiel pour la synthèse de nouveaux échafaudages peptidiques. / Peptides and proteins play a crucial role in all fundamental biological processes. Chemical methods have been developed for the production of peptide and proteins which allows understanding their structures, functions and the development of novel therapies. In particular, the introduction of the Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) by Merrifield in the 60s, followed by the emergence of peptide ligation methods in the 90s have opened the way to the preparation of synthetic proteins. Recently, the developments of sequential and convergent assembly methods give access to large synthetic proteins. However, the synthesis of high molecular weight proteins remains a challenging task. Therefore, it is necessary to develop novel peptide ligation methods and assembly scheme strategies. Central to this PhD work is the recently developed bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA) native peptide ligation method. The first part of this manuscript describes an efficient sequential assembly method in the N-to-C direction for protein synthesis in solution which was used for producing a functional N domain of Hepatocyte Growth Factor‎ (HGF). We next examined also a solid phase method for the sequential native ligation of unprotected peptide segments in the N-to-C direction to overcome the limitations in solution. The last part of the manuscript reports the chemicals properties of bis(2-selanylethyl)amido (SeEA) peptide segments and their usefulness for building novel peptide scaffolds.

>Magister Scientiae - MSc / Tsetse flies (Glossina spp) are vectors of African trypanosome (Trypanosoma spp) parasites, causative agents of Human African trypanosomiasis (sleeping sickness) and Nagana in livestock. Research suggests that tsetse fly immunity factors are key determinants in the success and failure of infection and the maturation process of parasites. An analysis of tsetse fly immunity factors is limited by the paucity of genomic data for Glossina spp. Nevertheless, completely sequenced and assembled genomes of Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae and Aedes aegypti provide an opportunity to characterize protein families in species such as Glossina by using a comparative genomics approach. In this study we characterize thioester-containing proteins (TEPs), a sub-family of immunity-related proteins, in Glossina by leveraging the EST data for G.morsitans and the genomic resources of D. melanogaster, A. gambiae as well as A.aegypti.A total of 17 TEPs corresponding to Drosophila (four TEPs), Anopheles (eleven TEPs) and Aedes aegypti (two TEPs) were collected from published data supplemented with Genbank searches. In the absence of genome data for G. morsitans, 124 000 G.morsitans ESTs were clustered and assembled into 18 413 transcripts (contigs and singletons). Five Glossina contigs (Gmcn1115, Gmcn1116, Gmcn2398, Gmcn2281 and Gmcn4297) were identified as putative TEPs by BLAST searches. Phylogenetic analyses were conducted to determine the relationship of collected TEP proteins.Gmcn1115 clustered with DmtepI and DmtepII while Gmcn2398 is placed in a separate branch, suggesting that it is specific to G. morsitans.The TEPs are highly conserved within D. melanogaster as reflected in the conservation of the thioester domain, while only two and one TEPs in A. gambiae and A. aegypti thioester domain show conservation of the thioester domain suggesting that these proteins are subjected to high levels of selection. Despite the absence of a sequenced genome for G. morsitans, at least two putative TEPs where identified from EST data.

Les peptides vecteurs ou CPP sont de petits peptides, en général de taille inférieure à 30 acides aminés. Parmi les nombreux CPP décrits dans la littérature, les peptides riches en arginine ont fait l'objet d'une attention particulière. Plusieurs modifications chimiques du squelette peptidique conduisant à une distribution spatiale différente des groupes fonctionnels, ou encore l'introduction de chaînes aliphatiques ont été effectuées pour accroitre la capacité du peptide à traverser la membrane de la cellule. L'objectif de ce travail a été le développement de nouveaux peptides vecteurs cycliques contenant un domaine cationique minimal et pouvant être acylés par une chaîne aliphatique. Quinze nouveaux transporteurs cycliques, dont les peptides vecteurs classiques Pénétratine et R6W3ont été synthétisés. La cyclisation tête-queue par ligation chimique native a été rendue possible par l'introduction d'un résidu cystéine et d'une fonction thioester (ou précurseur) respectivement aux extrémités N et C-terminales des différentes séquences de CPP. Leur aptitude à transporter le peptide bioactif PKCi dans des cellules CHO a été évaluée par quantification de la cargaison internalisée en utilisant la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les résultats indiquent une meilleure internalisation essentiellement par voie d'endocytose dépendante des glycosaminoglycanes, suite à la cyclisation des CPP comparés à leur version linéaire. De toute la série des lipopeptides testés dans ce projet, deux séquences se distinguent par leur capacité remarquable à franchir les membranes cellulaire : les CPP [C12-R4] et [C12-R7]. / Cell-penetrating peptides (CPPs) are short, cationic or amphipatic peptides, usually containing less than 30 amino acids, which are able to deliver various bioactive cargoes inside cells. Among the many CPPs described in the literature, the arginine-rich peptides have attracted particular attention. Several chemical modifications of the peptide backbone leading to different spatial distributions of the CPP functional groups, or the introduction of aliphatic chains have been made to enhance their internalization efficiency. The aim of this work was the synthesis of new cyclic CPPs containing a minimal cationic domain and their functionalisation with an aliphatic chain. We have synthesised a small library of fifteen new cyclic carriers including the classical CPPs Penetratin and R6W3 using native chemical ligation (NCL) in solution. The introduction of an N-terminal Cys residue and of a C-terminal thioester (or precursor) in the initial linear peptide sequence allowed the head-to-tail cyclisation. The efficiency of cargo delivery in CHO cells was measured by MALDI-TOF mass spectrometry. We found that cyclisation of CPPs improved their internalisation efficiency mostly by glycosaminoglycan-dependent endocytosis. Among the whole series of lipopeptides tested in this project, two sequences are distinguished by their remarkable ability to cross cellular membranes: the peptides [C12-R4] and [C12-R7].

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La dynamique co-évolutive qui joue dans les systèmes hôte-parasite conduit à une véritable course aux armements entre les deux protagonistes qui se traduit, dans certaines interactions comme celle qui est traitée dans cette thèse, par un polymorphisme de compatibilité dont les bases moléculaires sont méconnues. L'objectif de cette thèse était de progresser dans la connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents à ce polymorphisme de compatibilité dans l'interaction Biomphalaria glabrata/Schistosoma mansoni. Une approche protéomique comparative entre des souches de parasites compatibles et incompatibles nous a permis d'identifier des déterminants moléculaires clés de l'interaction exprimés par le parasite. Il s'agit d'une part de mucines hautement polymorphes potentiellement antigéniques, les "Schistosoma mansoni Polymorphic Mucin" (SmPoMucs), et d'autre part de molécules anti-oxydantes ("ROS scavengers"). Afin d'aborder la question de la course aux armements de manière complète, nous avons également recherché la "contre-partie moléculaire" exprimée par le mollusque et susceptible d'exprimer ce polymorphisme de compatibilité. Dans ce but, des approches de co-précipitation ont été menées. Elles ont permis de montrer que les SmPoMucs interagissaient avec des récepteurs immunitaires diversifiés du mollusque, les Fibrinogen-related Proteins (FREPs). Nous montrons ainsi pour la première fois dans une interaction parasite/hôte invertébré l'intervention d'un "système de type antigène-anticorps" impliquant un répertoire individuel polymorphe d'antigènes potentiels du parasite (les SmPoMucs) et un répertoire individuel diversifié de récepteurs immunitaires de son hôte (les FREPs). Nous avons également montré que le complexe immun formé par les deux dernières molécules citées incluait un troisième partenaire, une thioester-containing protein (TEP) qui appartient à une classe de molécules connue pour son rôle dans la fagocytose ou l'encapsulation. La présence de ce troisième partenaire au sein d'un même complexe renforce le rôle potentiellement immunitaire de ce complexe dans la reconnaissance et l'élimination du parasite. Au travers de cette thèse, nous nous sommes également intéressés à la course aux armements jouant sur les mécanismes effecteurs de l'immunité du mollusque. Dans notre modèle, les effecteurs responsables de la destruction du parasite sont principalement des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Dans ce cas aussi, nous avons montré qu'il existe une concordance phénotypique entre la production de ROS par l'hôte et le niveau de "ROS scavengers" produits par le parasite pour contrecarrer la réaction de l'hôte. Ainsi, les mécanismes moléculaires responsables du polymorphisme de compatibilité dans l'interaction B. glabrata/S. mansoni s'appuieraient au moins sur deux facteurs d'une part sur la confrontation de répertoires de molécules polymorphes et/ou diversifiées en ce qui concerne les mécanismes de reconnaissance immunitaire, et d'autre part sur une adaptation réciproque quantitative en ce qui concerne certains mécanismes effecteurs de l'immunité.