L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire qui se caractérise par un remodelage des artères pulmonaires distales (APD). Cela conduit à une élévation de la pression sanguine ainsi qu'une résistance au niveau des artères pulmonaires entraînant une insuffisance cardiaque droite et la mort du patient. Aujourd'hui, il est reconnu que les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP) sont des acteurs clés dans les changements histopathologiques de l'HTAP. Comme dans les cellules cancéreuses, les CMLAP présentent un phénotype pro-prolifératif et anti-apoptotique, soutenu par un important changement métabolique connu sous le nom d'effet Warburg. Les Aurora kinases sont une famille de sérine/thréonine kinase composée d'Aurora A (AURKA), Aurora B (AURKB) et Aurora C (AURKC). Toutes sont fortement impliquées dans la prolifération cellulaire, l'apoptose et le métabolisme en contrôlant l'activation du cycle cellulaire. Des recherches antérieures ont montré qu'AURKB est surexprimée dans divers cancers humains et que son inhibition réprime la progression tumorale à la fois in vivo et in vitro, suggérant qu'elle pourrait être une nouvelle cible thérapeutique dans l'HTAP. Nous avons donc émis l'hypothèse que AURKB est régulée à la hausse en HTAP et contribue à la prolifération et à la survie des CMLAP, dont l'inhibition pourrait inverser le phénotype de l'HTAP et le remodelage des artères pulmonaires (AP). Par une approche multidisciplinaire, nous avons tout d'abord démontré dans cette étude qu'AURKB est surexprimée en HTAP dans les CMLAP isolées de patients atteints par la maladie ainsi que dans les modèles animaux mimant la pathologie; monocrotaline (MCT) et sugen-hypoxie (Sg-Hx). Il a également été démontré que la surexpression d'AURKB était dépendante de FOXM1 dans ces mêmes cellules comparées aux contrôles. In vitro, l'inhibition pharmacologie de AURKB via l'utilisation du Barasertib (AZD1152-HQPA) a montré une diminution significative de la prolifération (incorporation d'EdU, marquage Ki67) et de la survie cellulaire des CMLAP-HTAP (test Annexin V). Parallèlement, des protéines impliquées dans la survie et la prolifération cellulaire (Survivin, PLK1) voient leur expression diminuée à la suite de l'inhibition de AURKB. À l'inverse, des protéines impliquées dans l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose (P21, P27, P53) voient leur expression augmentée suite au traitement des cellules avec le Barasertib. Tel que suspecté, l'inhibition d'AURKB dans les CMLAP-HTAP est associée à une diminution dose-dépendante de l'expression de la forme phosphorylée de l'histone H3 (pH3). En collaboration avec le Docteur David Marsolais et son étudiant Olivier Courtemanche, il nous a été possible de réaliser de la cytométrie en flux. Cette analyse a permis d'observer que le Barasertib engendre un arrêt du cycle cellulaire, les cellules étant bloquées en phase G2/M. Nous avons également pu constater que le Barasertib provoque de la polyploïdie, un effet secondaire déjà observé en cancérologie. Enfin, un premier test in vivo a été réalisé sur des rats mâles ayant une HTAP induite par la MCT afin de déterminer si l'inhibition pharmacologique de AURKB améliore ou non les paramètres hémodynamiques et le remodelage des AP. Après deux semaines de traitement et afin de s'assurer de l'efficacité de celui-ci l'expression de pH3 a été évaluée par immunobuvardage de type western. Ainsi, après sacrifice et extraction des protéines présentent au niveau des poumons des rongeurs, nous avons pu observer que l'inhibition de AURKB via le Barasertib avait bel et bien fonctionné, l'expression de pH3 étant diminuée chez le groupe de rats traités comparativement aux véhicules. Finalement, ce premier protocole à petite échelle nous a permis de constater une amélioration de certains paramètres hémodynamiques chez les rats ayant reçu la thérapie, les résultats ayant été obtenus par échocardiographie. L'utilisation du Barasertib in vivo est donc très prometteuse, mais des protocoles à plus grandes échelles doivent être réalisés afin de confirmer le potentiel thérapeutique de l'inhibition de AURKB en HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a vascular disease characterized by remodeling of the distal pulmonary arteries (DPA). This leads to increased blood pressure and resistance in the pulmonary arteries resulting in right heart failure and death. Today, it is recognized that pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) are key players in the histopathological changes of PAH. As in cancer cells, PASMCs exhibit a pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype, supported by an important metabolic change known as the Warburg effect. Aurora kinases are a family of serine/threonine kinase composed of Aurora A (AURKA), Aurora B (AURKB) and Aurora C (AURKC). All are strongly involved in cell proliferation, apoptosis, and metabolism by controlling cell cycle activation. Previous research has shown that AURKB is overexpressed in various human cancers and its inhibition repressed tumor progression both in vivo and in vitro, suggesting that it may be a novel therapeutic target in PAH. We therefore hypothesized that AURKB is upregulated in PAH and contributes to the proliferation and survival of PASMCs-HTAP. The inhibition of AURKB would then reverse PAH phenotype and pulmonary artery (PA) remodeling. Using a multidisciplinary approach, we first demonstrated that AURKB is increased in PASMCs isolated from patients with PAH as well as in animal models mimicking the pathology; monocrotaline (MCT) and sugen-hypoxia (Sg-Hx). AURKB overexpression was also shown to be FOXM1 dependent in these cells compared to controls. In vitro, pharmacological inhibition of AURKB via the use of Barasertib (AZD1152-HQPA) showed a significant decrease in PAH-PASMCs proliferation (EdU incorporation, Ki67 labeling) and survival (Annexin V assay). At the same time, proteins involved in cell survival and proliferation (Survin, PLK1) were decreased following AURKB inhibition. On the other hand, proteins involved in cell cycle arrest and apoptosis (P21, P27, P53) were increased following treatment of cells with Barasertib. As suspected, AURKB inhibition in PAH-PASMCs is associated with a dose-dependent decrease in the expression of the phosphorylated form of H3 (pH3). In collaboration with Dr. David Marsolais and his student Olivier Courtemanche, it was possible to perform flow cytometry. This analysis allowed us to observe that Barasertib causes the cell cycle arrest, the cells being blocked in G2/M phase. We were also able to confirm that Barasertib causes polyploidy, a side effect already observed in cancerology. Finally, a first in vivo test was performed on male MCT rats to determine whether pharmacological inhibition of AURKB improves hemodynamic parameters and PA remodeling. After 2 weeks of treatment and to ensure its efficacy, the expression of pH3 was evaluated by western blot (WB). Thus, after sacrifice and extraction of proteins present in the lungs of rodents, we were able to observe that the inhibition of AURKB via Barasertib had indeed worked, the expression of pH3 being decreased in the treated rats compared to vehicles. Finally, this first small-scale protocol allowed us to observe an improvement in all hemodynamic parameters in rats that received the therapy, the results having been obtained by echocardiography. The use of Barasertib in vivo is therefore very promising, but larger-scale protocols must be performed to confirm the therapeutic potential of AURKB inhibition in PAH.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire qui se caractérise par un remodelage des artères pulmonaires distales (APD). Cela conduit à une élévation de la pression sanguine ainsi qu'une résistance au niveau des artères pulmonaires entraînant une insuffisance cardiaque droite et la mort du patient. Aujourd'hui, il est reconnu que les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP) sont des acteurs clés dans les changements histopathologiques de l'HTAP. Comme dans les cellules cancéreuses, les CMLAP présentent un phénotype pro-prolifératif et anti-apoptotique, soutenu par un important changement métabolique connu sous le nom d'effet Warburg. Les Aurora kinases sont une famille de sérine/thréonine kinase composée d'Aurora A (AURKA), Aurora B (AURKB) et Aurora C (AURKC). Toutes sont fortement impliquées dans la prolifération cellulaire, l'apoptose et le métabolisme en contrôlant l'activation du cycle cellulaire. Des recherches antérieures ont montré qu'AURKB est surexprimée dans divers cancers humains et que son inhibition réprime la progression tumorale à la fois in vivo et in vitro, suggérant qu'elle pourrait être une nouvelle cible thérapeutique dans l'HTAP. Nous avons donc émis l'hypothèse que AURKB est régulée à la hausse en HTAP et contribue à la prolifération et à la survie des CMLAP, dont l'inhibition pourrait inverser le phénotype de l'HTAP et le remodelage des artères pulmonaires (AP). Par une approche multidisciplinaire, nous avons tout d'abord démontré dans cette étude qu'AURKB est surexprimée en HTAP dans les CMLAP isolées de patients atteints par la maladie ainsi que dans les modèles animaux mimant la pathologie; monocrotaline (MCT) et sugen-hypoxie (Sg-Hx). Il a également été démontré que la surexpression d'AURKB était dépendante de FOXM1 dans ces mêmes cellules comparées aux contrôles. In vitro, l'inhibition pharmacologie de AURKB via l'utilisation du Barasertib (AZD1152-HQPA) a montré une diminution significative de la prolifération (incorporation d'EdU, marquage Ki67) et de la survie cellulaire des CMLAP-HTAP (test Annexin V). Parallèlement, des protéines impliquées dans la survie et la prolifération cellulaire (Survivin, PLK1) voient leur expression diminuée à la suite de l'inhibition de AURKB. À l'inverse, des protéines impliquées dans l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose (P21, P27, P53) voient leur expression augmentée suite au traitement des cellules avec le Barasertib. Tel que suspecté, l'inhibition d'AURKB dans les CMLAP-HTAP est associée à une diminution dose-dépendante de l'expression de la forme phosphorylée de l'histone H3 (pH3). En collaboration avec le Docteur David Marsolais et son étudiant Olivier Courtemanche, il nous a été possible de réaliser de la cytométrie en flux. Cette analyse a permis d'observer que le Barasertib engendre un arrêt du cycle cellulaire, les cellules étant bloquées en phase G2/M. Nous avons également pu constater que le Barasertib provoque de la polyploïdie, un effet secondaire déjà observé en cancérologie. Enfin, un premier test in vivo a été réalisé sur des rats mâles ayant une HTAP induite par la MCT afin de déterminer si l'inhibition pharmacologique de AURKB améliore ou non les paramètres hémodynamiques et le remodelage des AP. Après deux semaines de traitement et afin de s'assurer de l'efficacité de celui-ci l'expression de pH3 a été évaluée par immunobuvardage de type western. Ainsi, après sacrifice et extraction des protéines présentent au niveau des poumons des rongeurs, nous avons pu observer que l'inhibition de AURKB via le Barasertib avait bel et bien fonctionné, l'expression de pH3 étant diminuée chez le groupe de rats traités comparativement aux véhicules. Finalement, ce premier protocole à petite échelle nous a permis de constater une amélioration de certains paramètres hémodynamiques chez les rats ayant reçu la thérapie, les résultats ayant été obtenus par échocardiographie. L'utilisation du Barasertib in vivo est donc très prometteuse, mais des protocoles à plus grandes échelles doivent être réalisés afin de confirmer le potentiel thérapeutique de l'inhibition de AURKB en HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a vascular disease characterized by remodeling of the distal pulmonary arteries (DPA). This leads to increased blood pressure and resistance in the pulmonary arteries resulting in right heart failure and death. Today, it is recognized that pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) are key players in the histopathological changes of PAH. As in cancer cells, PASMCs exhibit a pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype, supported by an important metabolic change known as the Warburg effect. Aurora kinases are a family of serine/threonine kinase composed of Aurora A (AURKA), Aurora B (AURKB) and Aurora C (AURKC). All are strongly involved in cell proliferation, apoptosis, and metabolism by controlling cell cycle activation. Previous research has shown that AURKB is overexpressed in various human cancers and its inhibition repressed tumor progression both in vivo and in vitro, suggesting that it may be a novel therapeutic target in PAH. We therefore hypothesized that AURKB is upregulated in PAH and contributes to the proliferation and survival of PASMCs-HTAP. The inhibition of AURKB would then reverse PAH phenotype and pulmonary artery (PA) remodeling. Using a multidisciplinary approach, we first demonstrated that AURKB is increased in PASMCs isolated from patients with PAH as well as in animal models mimicking the pathology; monocrotaline (MCT) and sugen-hypoxia (Sg-Hx). AURKB overexpression was also shown to be FOXM1 dependent in these cells compared to controls. In vitro, pharmacological inhibition of AURKB via the use of Barasertib (AZD1152-HQPA) showed a significant decrease in PAH-PASMCs proliferation (EdU incorporation, Ki67 labeling) and survival (Annexin V assay). At the same time, proteins involved in cell survival and proliferation (Survin, PLK1) were decreased following AURKB inhibition. On the other hand, proteins involved in cell cycle arrest and apoptosis (P21, P27, P53) were increased following treatment of cells with Barasertib. As suspected, AURKB inhibition in PAH-PASMCs is associated with a dose-dependent decrease in the expression of the phosphorylated form of H3 (pH3). In collaboration with Dr. David Marsolais and his student Olivier Courtemanche, it was possible to perform flow cytometry. This analysis allowed us to observe that Barasertib causes the cell cycle arrest, the cells being blocked in G2/M phase. We were also able to confirm that Barasertib causes polyploidy, a side effect already observed in cancerology. Finally, a first in vivo test was performed on male MCT rats to determine whether pharmacological inhibition of AURKB improves hemodynamic parameters and PA remodeling. After 2 weeks of treatment and to ensure its efficacy, the expression of pH3 was evaluated by western blot (WB). Thus, after sacrifice and extraction of proteins present in the lungs of rodents, we were able to observe that the inhibition of AURKB via Barasertib had indeed worked, the expression of pH3 being decreased in the treated rats compared to vehicles. Finally, this first small-scale protocol allowed us to observe an improvement in all hemodynamic parameters in rats that received the therapy, the results having been obtained by echocardiography. The use of Barasertib in vivo is therefore very promising, but larger-scale protocols must be performed to confirm the therapeutic potential of AURKB inhibition in PAH.

Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

Lorsqu'une cellule se divise, elle donne une copie de son génome à chacune de ses cellules filles. Cependant, quand un problème de ségrégation survient, les cellules filles peuvent recevoir un nombre anormal de chromatides sœurs, résultant en une aneuploïdie. Plusieurs pathologies sont liées à l'aneuploïdie, notamment la trisomie 21 et des formes de cancer. Une des kinases recrutées pour corriger la ségrégation des chromatides sœurs est Haspin. Son activité est nécessaire pour l'enrichissement du « Chromosomal Passenger Complex » (CPC) aux centromères. Selon le modèle actuel, Haspin phosphoryle l'histone H3 sur la thréonine 3 (H3 T3) pour recruter le CPC. Or, une comparaison des séquences des acides aminés des histones H2B et H3 montre une forte similarité entre H3 T3 et les sites T19 et T119 de H2B. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle Haspin phosphorylerait les sites T19 et T119 de H2B. Mon projet a pour but d'utiliser des approches in vitro utilisant des histones et des nucléosomes recombinants pour découvrir de nouveaux substrats de Haspin. Afin de déceler et de quantifier la phosphorylation de H2B par Haspin, nous avons réalisé des essais kinases avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation de H2B sur ces deux sites. De plus, nous avons utilisé des approches in cellulo afin de déterminer si H2B est phosphorylé par Haspin au niveau cellulaire. Nos résultats démontrent que Haspin phosphoryle l'histone H2B sur T19 et T119 in vitro. Haspin phosphoryle l'histone libre ainsi que sa forme repliée en nucléosome. D'autre part, les analyses d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique à H2BpT119 ont démontré que H2B est phosphorylée par Haspin dans la cellule. En conclusion, nous avons montré que H2B est phosphorylé par Haspin autant in vitro que in cellulo. La caractérisation de ce nouveau substrat pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes de division cellulaire. / During cell division, the cell gives a copy of its genome to each of its daughter cells. However, when a segregation problem arises, daughter cells can receive an abnormal number of sister chromatids, resulting in aneuploidy. Several pathologies are linked to aneuploidy, including Down Syndrome and forms of cancer. One of the first kinases recruited to correct sister chromatid missegregation is the Haspin kinase. Its activity is necessary for the enrichment of the Chromosomal Passenger Complex (CPC) at the centromeres. According to the current model, Haspin phosphorylates histone H3 on threonine 3 (H3 T3) to recruit the CPC. However, a comparison of the amino acid sequences of histones H2B and H3 shows a strong similarity between H3 T3 and the T 9 and T119 sites of histone H2B. We hypothesised that Haspin is able to phosphorylate the sites T19 and T119 of H2B. My project aims to use in vitro approaches using recombinant histones and nucleosomes to discover new substrates of Haspin. In order to detect and quantify Haspin phosphorylation of the histones, we performed kinase assays that we analysed using an antibody specific to H2B phosphorylation of its two sites. In addition, we performed in cellulo analyses to determine if H2B is phosphorylated by Haspin at the cellular level. Our results demonstrate that Haspin phosphorylates histone H2B on T19 and T119 in vitro. Haspin phosphorylates the free histone and its folded form in nucleosomes. Additionally, immunofluorescence analyzes with an antibody specific to H2BpT119 showed that H2B is phosphorylated by Haspin in the cell. In conclusion, we have shown that H2B is phosphorylated by Haspin both in vitro and in cellulo. The characterization of this new substrate could allow a better understanding of the mechanisms supporting cell division.

BubR1 est une protéine importante dans le point de contrôle de la mitose pour la stabilisation des interactions entre kinétochores et microtubules (KT-MT). Ces fonctions protègent de la ségrégation anormale des chromosomes et de l’instabilité du génome. BubR1 possède des sites de phosphorylation mitotique hautement conservés dans le domaine régulant l’attachement des kinétochores (KARD), où S676 et S670 sont phosphorylées respectivement par la kinase polo-like 1 (Plk1) et par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1). Ces sites de phosphorylation sont essentiels pour le recrutement de la phosphatase PP2A-B56, qui stabilise les interactions KT-MT. Nos résultats montrent que la délétion entière ou des mutations qui déstabilisent le domaine pseudokinase de BubR1, causent la perte de phosphorylation des résidus S676 et S670 en mitose. Notre hypothèse est que le domaine pseudokinase de BubR1 peut jouer un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation du KARD et donc dans la stabilisation des interactions KT-MT. / The mitotic protein BubR1 functions in the spindle assembly checkpoint (SAC) by stabilizing kinetochore-microtubule (KT-MT) interactions. These functions protect the cell from abnormal chromosome segregation and genome instability. BubR1 has highly conserved mitotic phosphorylation sites in the kinetochore-attachment regulatory domain (KARD); the residue S676 is phosphorylated by polo-like kinase-1 (Plk1) and S670 is phosphorylated by cyclin-dependent kinase-1 (Cdk1). These phosphorylation sites are essential for KARD recruitment of protein phosphatase PP2A-B56, which stabilizes KT-MT interactions. Our results show that mutations that cause pseudokinase domain instability and a highly stable truncation mutant of BubR1 were found to cause loss of mitotic S676 and S670 phosphorylation. We hypothesize that the pseudokinase domain of BubR1 may play an important role in the regulation of KARD phosphorylation and thus the stabilization of KT-MT interactions.

La formation de plaques amyloïdes par l'accumulation des protéines Aβ issues du clivage amyloïdogénique de la protéine précurseur d'amyloïde (APP) et les enchevêtrements neurofibrillaires issus de l'accumulation de la protéine Tau hyperphosphorylée sont les caractéristiques neuropathologiques majeures de la maladie d'Alzheimer (MA) qui est la principale cause de démence chez les personnes âgées. La régulation d'APP et Tau dans les cellules est assurée par plusieurs modifications post-traductionnelles, dont la phosphorylation. Des observations montrent que la phosphorylation anormale d'APP et Tau amène à la MA. Différentes études ont montré que la kinase polo-like 2 (PLK2), une kinase à Sérine/Thréonine, est surexprimée dans le cerveau de patients atteints de la MA et qu'elle interagit directement avec l'APP. La dérégulation de l'activité kinase de la PLK2 pourrait augmenter la phosphorylation d'APP et Tau et aggraverait l'accumulation de l'Aβ et de Tau hyperphosphorylée, contribuant ainsi au développement de la pathologie. Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet de la surexpression de la PLK2 et l'inhibition de son activité kinase sur APP et Tau co-exprimées dans des cellules HEK-293T. Parmi toutes les PLKs, la PLK2 est celle qui réduit d'avantage les niveaux d'expression protéique d'APP et Tau, et son inhibition pharmacologique les restaurent partiellement. Puis nous avons cherché à comprendre par quelles voies de clivage et/ou de dégradation l'APP s'engageait lorsqu'elle était co-exprimée avec la PLK2 dans ces mêmes cellules. Ni la voie de clivage amyloïdogénique, ni les voies de dégradation ne participent à la diminution des niveaux d'expression protéique de l'APP co-exprimée avec la PLK2. Enfin, nous voulions déterminer l'impact de l'inhibiteur de la PLK2 dans le modèle murin transgénique 3xTg-AD. Le traitement a un impact sexe-dépendant et qui diffère selon la caractéristique neuropathologique observée. En conclusion, notre étude a permis d'approfondir les connaissances actuelles tout en apportant de nouvelles pistes de recherche. / The formation of amyloid plaques by the accumulation of Aβ proteins from amyloidogenic cleavage of amyloid precursor protein (APP) and neurofibrillary tangles from the accumulation of hyperphosphorylated Tau protein are the major neuropathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), which is the leading cause of dementia in the elderly. APP and Tau are regulated in cells by several post-translational modifications, including phosphorylation. There is evidence that abnormal phosphorylation of APP and Tau leads to AD. Various studies have shown that polo-like kinase 2 (PLK2), a serine/threonine kinase, is over expressed in the brains of AD patients and interacts directly with APP. Dysregulation of PLK2 kinase activity could increase the phosphorylation of APP and Tau and aggravate the accumulation of Aβ and hyperphosphorylated Tau, thus contributing to the development of the pathology. First, we studied the effect of over expression of PLK2 and inhibition of its kinase activity on APP and Tau co-expressed in HEK-293T cells. Among all the PLKs, PLK2 is the one that most reduces the protein expression levels of APP and Tau, and its pharmacological inhibition partially restores them. We then sought to understand which cleavage and/or degradation pathways APP engaged in when co-expressed with PLK2 in these same cells. Neither the amyloidogenic cleavage pathway nor the degradation pathways are involved in decreasing the protein expression levels of APP co-expressed with PLK2. Finally, we wanted to determine the impact of the PLK2 inhibitor in the 3xTg-AD transgenic mouse model. The impact of the treatment is sex-dependent and differs according to the neuropathological hallmark observed. In conclusion, our study has allowed us to deepen the current knowledge while providing new avenues for research.

Cette thèse de doctorat porte sur la régulation du cotransporteur K+-Cl- de type 4 (KCC4) par la « WNK lysine deficient protein kinase 4 » (WNK4), une sérine-thréonine kinase qui a été découverte en 2001. Le cotransporteur KCC4 fait partie de la famille des cotransporteurs cation-Cl- (CCC) qui compte neuf membres. Le cotransporteur KCC4, et les autres isoformes de type KCC, sont des protéines de surface qui couplent l’efflux du Cl- à celui du K+ de manière électroneutre. Ce faisant, ils régulent le Cl- intracellulaire (Cl-i), le volume cellulaire (Vi) et la réabsorption basolatérale du Cl- dans les épithélia. Bien qu’ils soient activés par une augmentation du Cl-i et du Vi, les intermédiaires signalétiques impliqués demeurent mal caractérisés à ce jour. À cet effet, WNK4 pourrait correspondre à l’un de ces intermédiaires puisqu’elle régule plusieurs systèmes de transport, dont les KCC. Les objectifs de cette thèse étaient donc de déterminer si WNK4 régule l’activité de KCC4 suite à des changements de Vi et de Cl-i, et si c’est le cas, par quels mécanismes. Pour répondre à ces objectifs, nous avons adopté une approche structure-fonction par laquelle des mutations ont été introduites dans les protéines KCC4 ou WNK4. L’effet de ces mutations a été analysé dans le système d’expression hétérologue des ovocytes de Xenopus laevis grâce à des études fonctionnelles, d’expression de surface, d’immunofluorescence et de phosphorylation. Nos travaux ont permis de montrer pour la première fois que WNK4 et PP1 sont bel et bien impliquées dans la régulation de KCC4 suite à une augmentation du Vi, mais que contrairement à des hypothèses avancées antérieurement, PP1 agirait en aval plutôt qu’en amont de WNK4, et qu’elle agirait aussi sur KCC4 par l’intermédiaire d’autres intervenants signalétiques. Nous avons aussi identifié deux résidus dans le domaine C-terminal de KCC4 qui soutiennent l’effet de WNK4 et de PP1. En somme, ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la régulation de KCC4 par WNK4 et PP1 et, par conséquent, d’offrir d’autres cibles thérapeutiques pour traiter des désordres électrolytiques. / This Ph.D. thesis focuses on the regulation of K+-Cl- cotransporter type 4 (KCC4) by WNK lysine deficient protein kinase 4 (WNK4), a serine threonine kinase that was discovered in 2001. The cotransporter KCC4 belongs to the cation-Cl- cotransporter (CCC) family that includes nine members. This transporter, along with the three other KCC isoforms, corresponds to cell surface proteins that couple elctroneutral efflux of Cl- with that of K+. In doing so, KCC family members regulate intracellular Cl- (Cl-i), cell volume (Vi) and basolateral reabsorption of Cl- across a variety of epithelia. Although they are activated by an increase in Cl-i and Vi, the signaling intermediates involved remain largely unknown to date. In this regard, WNK4 could correspond to one such intermediate given that it regulates several transport systems including KCC. On the basis of these premises, the main objectives of this thesis were to determine whether WNK4 regulates KCC4 activity during changes in Cl-i and Vi and if so, through which mechanisms. To address these objectives, I exploited a structure-function approach in which mutations were introduced in both KCC4 or WNK4 and in which the effect of such mutations were analyzed in the Xenopus laevis expression system through functional, expression, immunofluorescence studies and phosphorylation. My studies allowed to show for the first time that WNK4 et PP1 are indeed involved in KCC4 regulation during an increase in Vi, but that in contrast to previous assumptions, PP1 would act downstream instead of upstream of WNK4, and that it would also act on KCC4 through additional signaling intermediates. Lastly, we have identified two residues in the C-terminus of KCC4 that mediate the effect of WNK4 and PP1. Taken together, these results could help identifying new signaling pathways of KCC4 regulation by WNK4 and PP1, and thus offer other therapeutic targets to treat electrolyte disorders.

Le point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique (SAC) est un système de surveillance conservé chez les eucaryotes permettant un attachement précis entre les kinétochores et les microtubules. Le SAC empêche la progression mitotique jusqu'à ce que soit généré un attachement et une tension correcte entre les kinétochores et les microtubules. La dérégulation du SAC a des conséquences graves avec de l'aneuploïdie retrouvé dans la plupart des tumeurs solides. BUB1 est une kinase sérine/thréonine requise pour le fonctionnement du SAC. Elle possède à la fois des rôles dépendants et indépendants de sa fonction kinase. Ce projet définit plusieurs fonctions associées à BUB1 lors de la mitose. L'utilisation d’outils in vivo et in vitro ont permis d’identifier plusieurs sites d'autophosphorylation sur Bub1. Nous avons testé et confirmé le site T589 de BUB1 comme un site d'autophosphorylation. Un mutant de ce site (BUB1-T589A) a été exprimé de manière stable et un anticorps phosphospécifique a été généré pour étudier ce site. Le rôle structural des domaines de BUB1 a été rapporté précédemment. Nous montrons que quand le domaine d'extension du domaine kinase (aa 724-780) située en N-terminal du domaine kinase est nécessaire pour l’autophosphorylation de BUB1-T589 et l'activité de la kinase BUB1, le TPR à l’extrémité N-terminale est localisée normalement kinétochores et n’est pas requis pour l'activité kinase. BUB1-T589A a modifié le taux de renouvellement au kinétochores. Cela conduit à la propagation des signaux de SGO1 et de H2ApT120 au niveau des bras des chromosomes. Enfin, l’autophosphorylation en T589 régule le congression des chromosomes mais pas la fonction de BUB1 pour le SAC. De plus nous montrons que l'inhibition de PLK1, une autre kinase sérine/thréonine, augmente la localisation de BUB1 aux kinétochores après la suppression BUB3 dans les cellules humaines. Ainsi, PLK1 peut réguler la localisation de BUB1 aux kinétochores. Nous montrons également que cette régulation se produit à travers KNL1, une protéine d'échafaudage du SAC. PLK1 pourrait réglementer BUB1 kinétochore localisation pour influencer la progression mitotique. Des futures études se concentreront sur l’élucidation de mécanismes derrière ces interactions. / The Spindle assembly checkpoint (SAC) is a monitoring system conserved in eukaryotes for accurate attachments between kinetochores and microtubules. The SAC precludes mitotic progression until correct attachments and tension between kinetochores and microtubules is generated. Deregulation of the SAC has the severe consequence of aneuploidy found in most solid tumors. BUB1 is a serine/threonine kinase required for the SAC function. It has both kinase-dependent and kinase-independent roles. This project defines several BUB1 associated functions during mitosis. Using in vivo and in vitro tools several autophosphorylation sites on BUB1 were identified. We tested and confirmed BUB1 T589 as an autophosphorylation site. A mutant of this site (BUB1-T589A) was stably expressed in cells and a phosphospecific antibody was generated to study this site. The role of structural domains of BUB1 has been studied earlier. We show that while the kinase extension domain (aa 724-780) located N-terminal to the kinase domain is required for BUB1-T589 autophosphorylation and BUB1 kinase activity, the TPR at the N-terminus localizes normally to kinetochores and is not required for kinase activity. BUB1-T589A has altered turnover at kinetochores. This leads to the spread of SGO1 and H2ApT120 signal to chromosome arms. Finally, autophosphorylation at T589 regulates chromosome congression but not the SAC function of BUB1. We further show that inhibition of PLK1, another serine/threonine kinase, increases BUB1 kinetochore localization after BUB3 depletion in human cells. Thus, PLK1 can regulate BUB1 kinetochore localization. We also show that this regulation occurs through KNL1, a scaffold protein of the SAC. It is possible that PLK1 could regulate BUB1 kinetochore localization to influence mitotic progression. Future studies will focus on elucidation of mechanism behind these interactions.

La protéine Haspine est une sérine / thréonine kinase mitotique conservée, connue pour fonctionner par la phosphorylation de l'histone H3 (H3pT3). Bien que H3T3 soit le seul substrat bien connu de Haspine, il se peut que H3pT3 ne suffise pas à expliquer toutes les fonctions de Haspine au cours de la mitose. Fait intéressant, l’homologie de la portion N-terminale de H3 avec la portion Cterminale de H2B suggère que la thréonine 119 de H2B (H2BT119) est un candidat potentiel fort pour être un substrat majeur de Haspine. Ainsi, l’objectif de ce projet était d’étudier la phosphorylation de H2BT119 dépendante de Haspine pendant la mitose. La phosphorylation de H2B recombinant sur la position T119 par Haspine a été confirmée par un dosage de kinase en utilisant la radioactivité. En outre, le signal H2BpT119 sur la protéine recombinante H2B a été détecté par un anticorps anti-H2BpT119, confirmant la phosphorylation de H2B dépendante de Haspine sur ce site dans le test de kinase in vitro. En outre, une augmentation de la taille moléculaire de H2B a été observée après le dosage de la kinase. Les résultats des expériences in vivo, incluant l'analyse par Western-blot d'extrait d'histones mitotiques et la microscopie à fluorescence avec l'anti-H2BpT119, suggèrent une phosphorylation de H2B au site T119, qui s'est également avérée dépendant de l'activité de Haspine. Cependant, en raison de la potentielle réactivité croisée de l’anti-H2BpT119 avec H3pT3, une forme marquée de H2B a été utilisée lors de l’étude du signal H2BpT119 au cours de la mitose. Le marquage augmente la taille moléculaire de H2B et aide à reconnaître H2BpT119 loin de H3pT3. Plusieurs systèmes de marquage ont été utilisés, mais toutes les tentatives ont échoué, en raison du faible niveau de H2B exogène. Cependant, les résultats de ce projet suggèrent que le signal H2BpT119 pendant la mitose pourrait révéler un nouveau mécanisme dépendant de Haspine pour la régulation de la ségrégation des chromosomes. Par conséquent, il reste important d'étudier cette marque d'histone au cours de la mitose. / Haspin is a conserved mitotic serine/threonine kinase that is known to function through histone H3 phosphorylation (H3pT3). Despite this, H3T3 is the only well-known substrate for Haspin, H3pT3 may not be enough to explain all Haspin functions during mitosis. Interestingly, homology of H3 N-terminus with H2B C-terminus suggests that H2BT119 is a strong potential candidate to be a major substrate of Haspin. Thus, the aim was to investigate Haspin-dependent phosphorylation of H2BT119 during mitosis. Phosphorylation of recombinant H2B at T119 by Haspin was confirmed by a radioactivity-based kinase assay. Also, H2BpT119 signal on recombinant H2B was detected by an anti-H2BpT119 antibody, confirming Haspin-dependent phosphorylation of H2B at this site in the in vitro kinase assay. Also, an upshift of H2B was observed following the kinase assay. Results from in vivo experiments, including Western blot analysis of mitotic histone extract and immunofluorescence microscopy with the anti-H2BpT119, support phosphorylation of T119 in H2B, which also was found to depend on Haspin activity. However, due to the potential anti-H2BpT119 cross-reactivity with H3pT3, while exploring H2BpT119 signal during mitosis, tagged H2B was used. The tag increases H2B molecular size and helps to distinguish H2BpT119 from H3pT3. Several tagging systems was used, but all attempts failed, because of the low level of the exogenous tagged H2B. However, the results of this project suggest H2BpT119 signal during mitosis that may reveal a novel Haspindependent mechanism for chromosome segregation regulation. Therefore, it remains important to study this histone mark during mitosis.

Le complexe 1 de la Ser/Thr kinase mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) (mTORC1), son médiateur en aval, S6K1, (p70 S6 kinase) et RSK (p90 ribosomal S6 kinase) sont des régulateurs clés de la signalisation de l’insuline et du métabolisme énergétique. La voie mTORC1/S6K contrôle la prolifération, la croissance cellulaire, la synthèse protéique, la lipogenèse, la biogenèse mitochondriale et inhibe l’autophagie. L’une des particularités importantes de cette voie de signalisation est l’intégration de différents signaux tels les facteurs de croissance, le statut énergétique, l’oxygène et les nutriments. Ainsi, la voie mTORC1/S6K1 est suractivée par l’excès de nutriments et ses kinases sont bien connues pour être suractivées dans l'obésité. De plus, RSK est une kinase en aval de la voie des MAPK (mitogen-activated protein kinase) et est connue pour réguler la prolifération, la croissance cellulaire et activer la voie mTORC1. Parmi les activateurs de RSK, on retrouve l’insuline et l’hyperglycémie. Ainsi, mTORC1/S6K1 et RSK sont impliquées dans le développement de la résistance à l’insuline, de l’obésité et du diabète de type 2. Dans une première étude publiée dans la revue Diabetologia, nous avons évalué l’impact de l’inhibition pharmacologique de S6K1 par le PF-4708671 sur la résistance à l’insuline et le métabolisme énergétique. Pour ce faire, nous avons utilisé des myotubes (L6) et des hépatocytes (FAO) en culture et montrés que l’inhibition de S6K1 augmente le captage de glucose musculaire et diminue la production hépatique de glucose. Par la suite, nous avons utilisé un modèle de souris obèse induit par une diète riche en gras afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition pharmacologique de S6K1. Ces études nous ont permis de montrer que l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de S6K1 améliore la tolérance au glucose et la phosphorylation d’Akt. Mécanistiquement, nous avons démontré dans un 2ième temps que le PF inhibe non seulement l’activité de S6K1, mais inhibe aussi l’activité du complexe I mitochondrial causant une augmentation de l’activité de l’AMPK (AMP activated protein kinase) et une inhibition de l’ACC (acetyl-CoA carboxylase). Parallèlement, nous avons montré dans une 3e étude, publiée dans J. Biol. Chem., que l'inhibition de RSK1 par l’inhibiteur pharmacologique (BI-D1870) ou d’un mutant RSK1 dominant négatif (DN-RSK1), diminue la phosphorylation d’IRS-1 sur la S1101. Par ailleurs, l’expression du DN-RSK1 augmente l’action de l’insuline sur le transport du glucose musculaire et la production de glucose hépatique. Ainsi, nous avons montré que RSK1 est un nouveau régulateur de la signalisation de l’insuline en phosphorylant la S1101 d’IRS-1. Nous proposons ainsi que l’inhibition de S6K1 et de RSK1 sont des approches thérapeutiques potentielles afin de traiter la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Mots clés : mTORC1, S6K1, RSK, MAPK, résistance à l’insuline, obésité, PF-4708671 / The Ser/Thr kinase mTOR complex 1 (mammalian Target Of Rapamycin) (mTORC1), his downstream effectors S6K1 (p70 ribosomal S6 kinase) and RSK (p90 ribosomal S6 kinase) are key regulators of insulin signaling and energy metabolism. The mTORC1/S6K1 pathway regulates cellular proliferation, growth, protein synthesis, lipogenesis, mitochondrial biogenesis, insulin signaling and inhibits autophagy. One of the most important roles of this signaling pathway is to integrate differents signals such as growth factors, energy status, oxygen, and nutrients. Thus, the mTORC1/S6K1 pathway is overactivated by nutrient excess conditions such as obesity. In addition, RSK is a downstream kinase of MAPK (mitogen-activated protein kinase) and it is also known to regulates cell proliferation, growth and to activate the mTORC1 pathway. Insulin and hyperglycemia are known to be among RSK activators. Therefore, mTORC1/S6K1 and RSK are involved in insulin resistance, obesity and type 2 diabetes. In a first study published in Diabetologia journal, we evaluated the effect of S6K1 inhibition with a selective S6K1 inhibitor, PF-4708671, on insulin resistance and energy metabolism. We used myotubes (L6) and hepatocytes (FAO) and observed that S6K1 inhibition increases glucose uptake in muscle and decrease glucose production in hepatocytes. In both cell type, S6K1 inhibition increases insulin-stimulating Akt phosphorylation. In addition, we treated obese mice fed high-fat diet for 1-week with S6K1 inhibitor. Mice treated with PF-4708671 have improved glucose tolerance and insulin-stimulating Akt phosphorylation in muscle, adipose tissue, and liver compared to obese mice treated with vehicle. Mechanistically, we showed in a 2nd study that this inhibitor inhibits S6K1 activity but also mitochondrial complex 1 which is associated with an increase in AMPK activation. Along with this study, we showed in a 3rd study published in J. Biol. Chem., that RSK1 phosphorylates directly IRS-1 on Ser1101 and RSK inhibition, by using either a RSK inhibitor (BI-D1870) or dominant-negative RSK1, improves insulin stimulating Akt phosphorylation as well as increasing glucose uptake in myotubes and inhibiting hepatic glucose production in vitro. Therefore, we demonstrated that RSK is a novel regulator of insulin signaling by phosphorylation Ser1101 of IRS-1. In conclusion, we are proposing that S6K1 inhibition and RSK1 inhibition are potential therapeutics targets to treat insulin resistance and type 2 diabetes. Keywords : mTORC1, S6K1, RSK, MAPK, insulin resistance, obesity, PF-470867