Nanomateriais, incluindo as nanopartículas e nanotubos, tem sido extensivamente utilizados em diversas aplicações tecnológicas, devido principalmente às suas interessantes propriedades, advindas da alta relação área/volume. Para a efetiva aplicação destes materiais em dispositivos nanotecnológicos, no entanto, é crucial o desenvolvimento de sistemas altamente estáveis, que mantenham suas propriedades por longos períodos. Neste trabalho foi proposta uma rota sintética para a preparação de nanopartículas de ouro na presença de polieletrólitos e tióis numa só fase, juntamente com um estudo sistemático da estabilidade dos sistemas produzidos. Os espectros de UV-vis obtidos demonstraram a formação de nanopartículas de ouro, com banda plasmônica característica. As nanopartículas foram também visualizadas por imagens de microscopia de Transmissão. Análise de espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) mostraram as ligações químicas que ocorrem entre os materiais constituintes dos sistemas híbridos de AuNPs. O estudo de estabilidade das AuNps foi realizado com medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) bem como por medidas de UV-vis, o que permitiu a obtenção do tipo de solução e condições mais estáveis. Através de análise estatística, por meio da análise de componentes principais (PCA), foi possível verificar quais fatores influenciam de forma significativa a estabilidade das diferentes soluções preparadas. / The use of nanomaterials - including nanoparticles and nanotubes - for technological applications has received tremendous attention in the last few years, mainly due to their unique, size-dependent properties. The proper application of such nanomaterials in technological devices, however, has been limited by parameters such as their physical or chemical stability. In this Master´s dissertation, we introduce a single step synthetic route for preparation of gold nanoparticles in the presence of polyelectrolytes and thiols, with emphasis on the stability of the nanomaterials under different storage conditions. Four different hybrid nanoparticles had been investigated, containing either PAH or PVA as the polymeric phase, in the presence of 3-AMP or 11-AMP thiols, respectively. After synthesis, the formation of the Au nanoparticles (AuNPs) was evidenced by UV-vis spectroscopy, upon appearance of a characteristic plasmonic band centered at ca. 510 or 540 nm, depending on the stabilizing agents used. The AuNPs were also investigated via TEM images. FTIR analyses evidenced that electrostatic interactions occurred between the thiols and the polyelectrolytes, within the hybrid nanoparticles structure. The stability of the four different systems was detailed investigated using UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), and visual analyses. The data pointed to the higher stability presented by the AuNps stabilized with PAH in the presence of 3-AMP (PAH/3-AMP AuNPs). In contrast, the AuNPs stabilized with PVA exhibited the lowest stability. This feature was corroborated by statistical analysis, using principal component analysis (PCA), through which was possible to identify the main factor affecting AuNPs stability.

Nanomateriais, incluindo as nanopartículas e nanotubos, tem sido extensivamente utilizados em diversas aplicações tecnológicas, devido principalmente às suas interessantes propriedades, advindas da alta relação área/volume. Para a efetiva aplicação destes materiais em dispositivos nanotecnológicos, no entanto, é crucial o desenvolvimento de sistemas altamente estáveis, que mantenham suas propriedades por longos períodos. Neste trabalho foi proposta uma rota sintética para a preparação de nanopartículas de ouro na presença de polieletrólitos e tióis numa só fase, juntamente com um estudo sistemático da estabilidade dos sistemas produzidos. Os espectros de UV-vis obtidos demonstraram a formação de nanopartículas de ouro, com banda plasmônica característica. As nanopartículas foram também visualizadas por imagens de microscopia de Transmissão. Análise de espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) mostraram as ligações químicas que ocorrem entre os materiais constituintes dos sistemas híbridos de AuNPs. O estudo de estabilidade das AuNps foi realizado com medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) bem como por medidas de UV-vis, o que permitiu a obtenção do tipo de solução e condições mais estáveis. Através de análise estatística, por meio da análise de componentes principais (PCA), foi possível verificar quais fatores influenciam de forma significativa a estabilidade das diferentes soluções preparadas. / The use of nanomaterials - including nanoparticles and nanotubes - for technological applications has received tremendous attention in the last few years, mainly due to their unique, size-dependent properties. The proper application of such nanomaterials in technological devices, however, has been limited by parameters such as their physical or chemical stability. In this Master´s dissertation, we introduce a single step synthetic route for preparation of gold nanoparticles in the presence of polyelectrolytes and thiols, with emphasis on the stability of the nanomaterials under different storage conditions. Four different hybrid nanoparticles had been investigated, containing either PAH or PVA as the polymeric phase, in the presence of 3-AMP or 11-AMP thiols, respectively. After synthesis, the formation of the Au nanoparticles (AuNPs) was evidenced by UV-vis spectroscopy, upon appearance of a characteristic plasmonic band centered at ca. 510 or 540 nm, depending on the stabilizing agents used. The AuNPs were also investigated via TEM images. FTIR analyses evidenced that electrostatic interactions occurred between the thiols and the polyelectrolytes, within the hybrid nanoparticles structure. The stability of the four different systems was detailed investigated using UV-Vis spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), and visual analyses. The data pointed to the higher stability presented by the AuNps stabilized with PAH in the presence of 3-AMP (PAH/3-AMP AuNPs). In contrast, the AuNPs stabilized with PVA exhibited the lowest stability. This feature was corroborated by statistical analysis, using principal component analysis (PCA), through which was possible to identify the main factor affecting AuNPs stability.

A família Tiol Peroxidases (TPxs - Peroxirredoxinas e Glutationa peroxidases) purificadas definitivamente reduzem peróxidos rapidamente (peroxinitrito, ONOOH/ONOO; peróxido de hidrogênio, H2O2), mas nenhuma evidência direta desta atividade foi demonstrada em células vivas. Isto é particularmente importante pois o ciclo catalítico da atividade peróxido redutase de TPxs depende de sucessivas reações de trocas de tióis que podem limitar a velocidade de redução do peróxido. Neste trabalho, esta questão foi investigada em Saccharomyces cerevisiae (Sc) por meio de cinética de competição com um indicador fluorescente que é específico para ONOO (ácido borônico de cumarina; CBA), com a expectativa de que quanto maior a atividade peroxinitrito redutase, menor a oxidação do indicador. Também foi investigado o papel de duas peroxirredoxinas (Prxs) específicas na remoção deste peróxido. O estudo mostrou que a oxidação do indicador CBA dependente de ONOO foi sempre significativamente maior em células de Saccharomyces cerevisiae deficientes em TPxs (cepa 8) relativo a cepa nativa (WT). Além disso, a transfecção do gene que codifica a Prx mais abundante em Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) na cepa 8 diminui parcialmente a oxidação de CBA. Além disso, a oxidação de CBA foi maior na cepa deficiente apenas da peroxirredoxina Tsa1 (a mais abundante da família) relativo à cepa WT, mostrando a relevância desta isoforma especificamente. De forma adversa, a oxidação de CBA na cepa deficiente da peroxirredoxina Tsa2 foi semelhante à cepa WT. Também, foi constatado que o processo de remoção de ONOO é catalítico (e não estequiométrico) para crescentes fluxos de peroxinitrito em todas as cepas e condições utilizadas no estudo. Finalmente, o estudo sugere que células possuem sistemas catalíticos peroxinitrito redutase redundantes, já que a própria cepa 8 apresenta e pode modular esta atividade. Estes resultados confirmam a expectativa da relevância de TPxs na remoção de ONOO e por extensão de outros peróxidos biologicamente relevantes e são a primeira evidência direta e em tempo real da atividade peroxinitrito redutase de TPxs em células. / The purified Thiol Peroxidases family (TPxs - Peroxiredoxins and Glutathione peroxidases) rapidly reduces peroxides (peroxynitrite, ONOOH/ONOO-, hydrogen peroxide, H2O2), but no direct evidence of this activity has been demonstrated in living cells. This is particularly important since the catalytic cycle of the TPxs peroxide reductase activity depends on successive thiol exchange reactions, which may limit the rate of peroxide reduction. In this work, this question was investigated in Saccharomyces cerevisiae (Sc) by competition kinetics using a fluorescent indicator that is specific for ONOO- (coumarin boronic acid; CBA). It is expected that the higher the peroxynitrite reductase activity, the lower the oxidation of the indicator. The role of two specific peroxiredoxins (Prxs) in the removal of this peroxide has also been investigated. The study showed that the oxidation of ONOO- dependent CBA indicator was always significantly higher in TPxs-deficient Saccharomyces cerevisiae cells (strain 8) compared to the native strain (WT). In addition, the transfection of the gene encoding the most abundant Prx into Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) in the 8 strain partially diminishes CBA oxidation. Besides that, CBA oxidation was greater in the deficient strain only of the peroxiredoxin Tsa1 (the most abundant in the family) compared to the WT strain, showing the relevance of this isoform specifically. On the other hand, CBA oxidation in the deficient strain of the Tsa2 peroxiredoxin was similar to the WT strain. Also, it was found that the ONOO- removal process is catalytic (and not stoichiometric) for increasing peroxynitrite fluxes in all strains and conditions used in the study. Finally, the study suggests that cells have redundant peroxynitrite reductase catalytic systems, since the 8 strain itself presents and can modulate this activity. These results confirm the expectation of the relevance of TPxs in the removal of ONOO- and by extension of other biologically relevant peroxides and are the first direct and real-time evidence of peroxynitrite reductase activity of TPxs in cells.

A família Tiol Peroxidases (TPxs - Peroxirredoxinas e Glutationa peroxidases) purificadas definitivamente reduzem peróxidos rapidamente (peroxinitrito, ONOOH/ONOO; peróxido de hidrogênio, H2O2), mas nenhuma evidência direta desta atividade foi demonstrada em células vivas. Isto é particularmente importante pois o ciclo catalítico da atividade peróxido redutase de TPxs depende de sucessivas reações de trocas de tióis que podem limitar a velocidade de redução do peróxido. Neste trabalho, esta questão foi investigada em Saccharomyces cerevisiae (Sc) por meio de cinética de competição com um indicador fluorescente que é específico para ONOO (ácido borônico de cumarina; CBA), com a expectativa de que quanto maior a atividade peroxinitrito redutase, menor a oxidação do indicador. Também foi investigado o papel de duas peroxirredoxinas (Prxs) específicas na remoção deste peróxido. O estudo mostrou que a oxidação do indicador CBA dependente de ONOO foi sempre significativamente maior em células de Saccharomyces cerevisiae deficientes em TPxs (cepa 8) relativo a cepa nativa (WT). Além disso, a transfecção do gene que codifica a Prx mais abundante em Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) na cepa 8 diminui parcialmente a oxidação de CBA. Além disso, a oxidação de CBA foi maior na cepa deficiente apenas da peroxirredoxina Tsa1 (a mais abundante da família) relativo à cepa WT, mostrando a relevância desta isoforma especificamente. De forma adversa, a oxidação de CBA na cepa deficiente da peroxirredoxina Tsa2 foi semelhante à cepa WT. Também, foi constatado que o processo de remoção de ONOO é catalítico (e não estequiométrico) para crescentes fluxos de peroxinitrito em todas as cepas e condições utilizadas no estudo. Finalmente, o estudo sugere que células possuem sistemas catalíticos peroxinitrito redutase redundantes, já que a própria cepa 8 apresenta e pode modular esta atividade. Estes resultados confirmam a expectativa da relevância de TPxs na remoção de ONOO e por extensão de outros peróxidos biologicamente relevantes e são a primeira evidência direta e em tempo real da atividade peroxinitrito redutase de TPxs em células. / The purified Thiol Peroxidases family (TPxs - Peroxiredoxins and Glutathione peroxidases) rapidly reduces peroxides (peroxynitrite, ONOOH/ONOO-, hydrogen peroxide, H2O2), but no direct evidence of this activity has been demonstrated in living cells. This is particularly important since the catalytic cycle of the TPxs peroxide reductase activity depends on successive thiol exchange reactions, which may limit the rate of peroxide reduction. In this work, this question was investigated in Saccharomyces cerevisiae (Sc) by competition kinetics using a fluorescent indicator that is specific for ONOO- (coumarin boronic acid; CBA). It is expected that the higher the peroxynitrite reductase activity, the lower the oxidation of the indicator. The role of two specific peroxiredoxins (Prxs) in the removal of this peroxide has also been investigated. The study showed that the oxidation of ONOO- dependent CBA indicator was always significantly higher in TPxs-deficient Saccharomyces cerevisiae cells (strain 8) compared to the native strain (WT). In addition, the transfection of the gene encoding the most abundant Prx into Saccharomyces cerevisiae (Tsa1) in the 8 strain partially diminishes CBA oxidation. Besides that, CBA oxidation was greater in the deficient strain only of the peroxiredoxin Tsa1 (the most abundant in the family) compared to the WT strain, showing the relevance of this isoform specifically. On the other hand, CBA oxidation in the deficient strain of the Tsa2 peroxiredoxin was similar to the WT strain. Also, it was found that the ONOO- removal process is catalytic (and not stoichiometric) for increasing peroxynitrite fluxes in all strains and conditions used in the study. Finally, the study suggests that cells have redundant peroxynitrite reductase catalytic systems, since the 8 strain itself presents and can modulate this activity. These results confirm the expectation of the relevance of TPxs in the removal of ONOO- and by extension of other biologically relevant peroxides and are the first direct and real-time evidence of peroxynitrite reductase activity of TPxs in cells.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (σE) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (σE) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

Organic hydroperoxide resistance (Ohr) proteins are highly efficient thiol-based peroxidases that play central roles in bacterial response towards organic hydroperoxides. In Fungi, Ohr frequently presents a N-terminal extension, which is predicted to target them to mitochondria. The catalytic triad of Ohr comprises the peroxidatic Cys (Cp), the catalytic Arg (Rc) and a Glu (Ec) are fully conserved and interact among themselves by a salt bridge network in a reduced form of the enzyme (the so-called closed state). After getting oxidized to sulfenic acid (Cys-SOH), Cp condenses with the sulfhydryl group of resolution Cys (Cr) in a disulfide bond. The absence of negativity of the thiolate (RS-) in Cp facilitates the opening of the Arg-loop (containing the Rc) away from the active site, generating the so-called open state. However, the molecular events associated with the high reactivity of Ohr enzymes towards hydroperoxides and its specific reducibility by the dihydrolipoamide (DHL) or by lipoylated proteins were still elusive before this work. Additionally, several factors support the idea of Ohr as a target for drug development: (i) Ohr displays unique physicochemical properties; (ii) bacteria mutant for Ohr (Δ ohr) are highly sensitive to oxidative stress; (iii) the indications that Ohr might be involved in bacterial virulence; and (iv) its absence in mammals and vascularized plants. In this thesis, several aspects of Ohr enzymes were evaluated. In chapter 2, we biochemically characterized the Ohr homologs from the ascomycete fungus Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), the causative agent of Black Sigatoka disease in banana plants, which presented extraordinary reactivity towards linoleic acid hydroperoxides (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Furthermore, through subcellular fractionation of M fijiensis protoplast cells followed by western blot analysis, we confirmed the in silico prediction that MfOhr is a mitochondrial protein. In chapter 3 and 4, we described seven new crystallographic structures from two opportunistic pathogen, one from Xylella fastidiosa and six from Chromobacterium violaceum (including the first representative of the complex between Ohr and its biological reductant, DHL). Taken together these structures might represent new snapshots along the catalysis. Furthermore, several molecular modelling approaches, such as classical mechanics (MM), steered molecular dynamics (SMD), hybrid quantum mechanics (QM-MM) and together with enzymatic assays of point mutations, indicated that Ohr underwent unique structural switches to allow an intermittent opening (oxidized state) and returning to a more stable closed form (reduced state) of an Arg-loop along catalysis. Remarkably, dihydrolipoamide directly assisted the closing the Arg-loop and thereby the turnover of the enzyme. In chapter 5, we describe the identification of two compounds (C-31 & C-42) that could represent a framework for further studies attempting to find specific Ohr inhibitors, either through ab initio design of chemical compounds and virtual screening using pharmacophoric models. The IC50 calculated for C-31 and C-42 were 124.4-248.5 µM and 243.3-321.7 µM, respectively. Finally, this thesis highlights several new aspects related to Ohr function: 1 - evidence that eukaryotic Ohr are preferentially located in mitochondria and share several biochemical properties with the prokaryotic ones; 2 - the network of polar interactions among residues of the catalytic triad (Cp, Rc and E) strongly contributed to stabilize Ohr in the closed state, in an optimum configuration for hydroperoxide reduction; 3 - evidence that disulfide bond formation and the product release (alcohol derived from hydroperoxide reduction) facilitate the opening of the Rc loop to an intermediate state (probably not to the excessively open state presented in crystallographic structures); 4 - mapping the interactions between the biological reductant (DHL) and the Ohr active site; 5 - strong indications that DHL is not able to fit and react with Ohr in the close conformation; 6 - the first trials for search of molecules to specifically target Ohr proteins, although further assays must be performed to verify the specificity of the selected compounds to target Ohr. Therefore, we describe relevant new information for an antioxidant protein that displays highly efficient catalysis, comparable to other very important hydroperoxide removing enzymes, such as GSH peroxidase and peroxiredoxin / As proteínas Ohr (Organic hydroperoxide resistance) são peroxidases dependente de tiól extremamente eficientes e têm um papel central na resposta das bactérias contra peróxidos orgânicos. Em fungos, as proteínas Ohr apresentam uma extensão N-terminal, cujo predições in silico apontam estar associada ao direcionamento da proteína para a mitocôndria. A tríade catalítica é composta pela cisteína peroxidatic (Cp), a arginina (Rc) e o glutamato (Ec) catalíticos que são totalmente conservados e interagem entre eles por uma rede de interações de ponte salina, na forma reduzida da proteína (conformação fechada). Após se tornarem oxidadas em ácido sulfênico (Cis-SOH), a Cp condensa com o grupo sulfidrila da cisteína de resolução (Cr) numa ligação disulfeto. A ausência da carga negativa do tiolato (RS-) da Cp facilita a abertura da alça que contem a Rc para longe do centro ativo, gerando a conformação aberta. No entanto, os eventos moleculares associados a alta reatividade das enzimas Ohr contra hidroperóxidos e a sua redução pela dihydrolipoamida (presente em proteínas lipoiladas), ainda está descrita de forma bem superficial. Adicionalmente, vários fatores suportam a ideia de que a Ohr seria um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas: (i) a Ohr exibe propriedade físico-químicas únicas; (ii) as bactérias mutantes para Ohr (Δohr) são fortemente sensíveis ao stress oxidativo; (iii) indicações de que a Ohr poderá está envolvida na virulência de várias bactérias; e (iv) a ausência de Ohr em mamíferos e plantas vascularizadas. Nesta tese, vários aspetos relacionados com as enzimas Ohr foram avaliados. No Capitulo 2, foi caracterizada bioquimicamente a proteína Ohr homologa de fungo ascomiceto, Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), o agente causador da doença de bananas, Sigatoka-negra. A enzima apresentou eficiente atividade contra peroxido de ácido linoleico (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Além disso, através do fracionamento sub celular de protoblasto de M fijiensis seguido de western blot, foram confirmadas as predições in silico de que a MfOhr é uma proteína mitocondrial. No capítulo 3 e 4, foram descritas sete estruturas cristalográficas oriundas de dois patógenos oportunistas, uma de Xylella fastidiosa e seis de Chromobacterium violaceum (incluindo o primeiro representante do complexo entre a Ohr e o seu redutor biológico, DHL). Estas estruturas poderão representar diferentes conformações ao longo do ciclo catalítico. Adicionalmente, várias abordagens de modelagem molecular, tais como mecânica clássica (MM), mecânica molecular direcionada (SMM) e mecânica quântica híbrida (QM-MM), juntamente com ensaios experimentais com mutações pontuais, indicaram que a Ohr sofre várias mudanças conformacionais para permitir uma abertura intermitente (estado oxidado) e o retorno para uma conformação fechada mais estável (estado reduzido) da alça da arginina ao longo da catálise. Notavelmente, a dihydrolipoamide assistiu diretamente o fechamento da alça da arginina e por consequência o turnover da enzima. No capítulo 5, foi descrita a identificação de dois compostos (C-31 e C-42) que representam estudos iniciais com a finalidade de encontrar inibidores específicos para a enzima Ohr. Estes compostos foram encontrados por ab initio design e por varrimento virtual com o uso de modelos farmacofóricos. Os IC50 calculados para o C-31 e C-42 foram de 124.4-248.5 µM e 243.3-321.7 µM, respectivamente. Finalmente, esta tese descreve vários aspetos relacionados com a função da Ohr: 1 - evidências que as Ohr de eucariotos estão preferencialmente localizadas na mitocôndria e partilham várias propriedades bioquímicas com as Ohr de bactéria; 2 - a rede de interações polares entre os resíduos da tríade catalítica (Cp, Rc e Ec) contribuem fortemente para a estabilização do estado fechado, a configuração ótima para a redução de hydroperoxidos; 3 - evidências de que a formação da ligação disulfeto e a liberação do produto (álcool derivado da redução do hydroperoxido) facilitam a abertura da alça da arginina até um estado intermediários (provavelmente não o estado totalmente exposto apresentado nas estruturas cristalográficas) 4 - o mapeamento das interações entre o redutor biológico no centro ativo da Ohr; 5 - fortes indicações de que a DHL não é capaz de interagir e reagir com a Ohr na conformação fechada; 6 - os primeiros ensaios para a procura por moléculas que especificamente interajam com a Ohr, apesar de que futuros ensaios terão de ser executados para verificar a especificidade dos compostos selecionados. Assim, nós descrevemos nova informação relevante sobre uma proteína antioxidante que exibe uma alta eficiência catalítica, comparável com outras importantes enzimas removedores de hydroperoxidos, tais como glutationa peroxidases e peroxiredoxinas

Organic hydroperoxide resistance (Ohr) proteins are highly efficient thiol-based peroxidases that play central roles in bacterial response towards organic hydroperoxides. In Fungi, Ohr frequently presents a N-terminal extension, which is predicted to target them to mitochondria. The catalytic triad of Ohr comprises the peroxidatic Cys (Cp), the catalytic Arg (Rc) and a Glu (Ec) are fully conserved and interact among themselves by a salt bridge network in a reduced form of the enzyme (the so-called closed state). After getting oxidized to sulfenic acid (Cys-SOH), Cp condenses with the sulfhydryl group of resolution Cys (Cr) in a disulfide bond. The absence of negativity of the thiolate (RS-) in Cp facilitates the opening of the Arg-loop (containing the Rc) away from the active site, generating the so-called open state. However, the molecular events associated with the high reactivity of Ohr enzymes towards hydroperoxides and its specific reducibility by the dihydrolipoamide (DHL) or by lipoylated proteins were still elusive before this work. Additionally, several factors support the idea of Ohr as a target for drug development: (i) Ohr displays unique physicochemical properties; (ii) bacteria mutant for Ohr (Δ ohr) are highly sensitive to oxidative stress; (iii) the indications that Ohr might be involved in bacterial virulence; and (iv) its absence in mammals and vascularized plants. In this thesis, several aspects of Ohr enzymes were evaluated. In chapter 2, we biochemically characterized the Ohr homologs from the ascomycete fungus Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), the causative agent of Black Sigatoka disease in banana plants, which presented extraordinary reactivity towards linoleic acid hydroperoxides (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Furthermore, through subcellular fractionation of M fijiensis protoplast cells followed by western blot analysis, we confirmed the in silico prediction that MfOhr is a mitochondrial protein. In chapter 3 and 4, we described seven new crystallographic structures from two opportunistic pathogen, one from Xylella fastidiosa and six from Chromobacterium violaceum (including the first representative of the complex between Ohr and its biological reductant, DHL). Taken together these structures might represent new snapshots along the catalysis. Furthermore, several molecular modelling approaches, such as classical mechanics (MM), steered molecular dynamics (SMD), hybrid quantum mechanics (QM-MM) and together with enzymatic assays of point mutations, indicated that Ohr underwent unique structural switches to allow an intermittent opening (oxidized state) and returning to a more stable closed form (reduced state) of an Arg-loop along catalysis. Remarkably, dihydrolipoamide directly assisted the closing the Arg-loop and thereby the turnover of the enzyme. In chapter 5, we describe the identification of two compounds (C-31 & C-42) that could represent a framework for further studies attempting to find specific Ohr inhibitors, either through ab initio design of chemical compounds and virtual screening using pharmacophoric models. The IC50 calculated for C-31 and C-42 were 124.4-248.5 µM and 243.3-321.7 µM, respectively. Finally, this thesis highlights several new aspects related to Ohr function: 1 - evidence that eukaryotic Ohr are preferentially located in mitochondria and share several biochemical properties with the prokaryotic ones; 2 - the network of polar interactions among residues of the catalytic triad (Cp, Rc and E) strongly contributed to stabilize Ohr in the closed state, in an optimum configuration for hydroperoxide reduction; 3 - evidence that disulfide bond formation and the product release (alcohol derived from hydroperoxide reduction) facilitate the opening of the Rc loop to an intermediate state (probably not to the excessively open state presented in crystallographic structures); 4 - mapping the interactions between the biological reductant (DHL) and the Ohr active site; 5 - strong indications that DHL is not able to fit and react with Ohr in the close conformation; 6 - the first trials for search of molecules to specifically target Ohr proteins, although further assays must be performed to verify the specificity of the selected compounds to target Ohr. Therefore, we describe relevant new information for an antioxidant protein that displays highly efficient catalysis, comparable to other very important hydroperoxide removing enzymes, such as GSH peroxidase and peroxiredoxin / As proteínas Ohr (Organic hydroperoxide resistance) são peroxidases dependente de tiól extremamente eficientes e têm um papel central na resposta das bactérias contra peróxidos orgânicos. Em fungos, as proteínas Ohr apresentam uma extensão N-terminal, cujo predições in silico apontam estar associada ao direcionamento da proteína para a mitocôndria. A tríade catalítica é composta pela cisteína peroxidatic (Cp), a arginina (Rc) e o glutamato (Ec) catalíticos que são totalmente conservados e interagem entre eles por uma rede de interações de ponte salina, na forma reduzida da proteína (conformação fechada). Após se tornarem oxidadas em ácido sulfênico (Cis-SOH), a Cp condensa com o grupo sulfidrila da cisteína de resolução (Cr) numa ligação disulfeto. A ausência da carga negativa do tiolato (RS-) da Cp facilita a abertura da alça que contem a Rc para longe do centro ativo, gerando a conformação aberta. No entanto, os eventos moleculares associados a alta reatividade das enzimas Ohr contra hidroperóxidos e a sua redução pela dihydrolipoamida (presente em proteínas lipoiladas), ainda está descrita de forma bem superficial. Adicionalmente, vários fatores suportam a ideia de que a Ohr seria um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas: (i) a Ohr exibe propriedade físico-químicas únicas; (ii) as bactérias mutantes para Ohr (Δohr) são fortemente sensíveis ao stress oxidativo; (iii) indicações de que a Ohr poderá está envolvida na virulência de várias bactérias; e (iv) a ausência de Ohr em mamíferos e plantas vascularizadas. Nesta tese, vários aspetos relacionados com as enzimas Ohr foram avaliados. No Capitulo 2, foi caracterizada bioquimicamente a proteína Ohr homologa de fungo ascomiceto, Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), o agente causador da doença de bananas, Sigatoka-negra. A enzima apresentou eficiente atividade contra peroxido de ácido linoleico (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Além disso, através do fracionamento sub celular de protoblasto de M fijiensis seguido de western blot, foram confirmadas as predições in silico de que a MfOhr é uma proteína mitocondrial. No capítulo 3 e 4, foram descritas sete estruturas cristalográficas oriundas de dois patógenos oportunistas, uma de Xylella fastidiosa e seis de Chromobacterium violaceum (incluindo o primeiro representante do complexo entre a Ohr e o seu redutor biológico, DHL). Estas estruturas poderão representar diferentes conformações ao longo do ciclo catalítico. Adicionalmente, várias abordagens de modelagem molecular, tais como mecânica clássica (MM), mecânica molecular direcionada (SMM) e mecânica quântica híbrida (QM-MM), juntamente com ensaios experimentais com mutações pontuais, indicaram que a Ohr sofre várias mudanças conformacionais para permitir uma abertura intermitente (estado oxidado) e o retorno para uma conformação fechada mais estável (estado reduzido) da alça da arginina ao longo da catálise. Notavelmente, a dihydrolipoamide assistiu diretamente o fechamento da alça da arginina e por consequência o turnover da enzima. No capítulo 5, foi descrita a identificação de dois compostos (C-31 e C-42) que representam estudos iniciais com a finalidade de encontrar inibidores específicos para a enzima Ohr. Estes compostos foram encontrados por ab initio design e por varrimento virtual com o uso de modelos farmacofóricos. Os IC50 calculados para o C-31 e C-42 foram de 124.4-248.5 µM e 243.3-321.7 µM, respectivamente. Finalmente, esta tese descreve vários aspetos relacionados com a função da Ohr: 1 - evidências que as Ohr de eucariotos estão preferencialmente localizadas na mitocôndria e partilham várias propriedades bioquímicas com as Ohr de bactéria; 2 - a rede de interações polares entre os resíduos da tríade catalítica (Cp, Rc e Ec) contribuem fortemente para a estabilização do estado fechado, a configuração ótima para a redução de hydroperoxidos; 3 - evidências de que a formação da ligação disulfeto e a liberação do produto (álcool derivado da redução do hydroperoxido) facilitam a abertura da alça da arginina até um estado intermediários (provavelmente não o estado totalmente exposto apresentado nas estruturas cristalográficas) 4 - o mapeamento das interações entre o redutor biológico no centro ativo da Ohr; 5 - fortes indicações de que a DHL não é capaz de interagir e reagir com a Ohr na conformação fechada; 6 - os primeiros ensaios para a procura por moléculas que especificamente interajam com a Ohr, apesar de que futuros ensaios terão de ser executados para verificar a especificidade dos compostos selecionados. Assim, nós descrevemos nova informação relevante sobre uma proteína antioxidante que exibe uma alta eficiência catalítica, comparável com outras importantes enzimas removedores de hydroperoxidos, tais como glutationa peroxidases e peroxiredoxinas

Las nanopartículas (NPs) de metales nobles presentan gran interés tanto por sus propiedades básicas como por la amplia variedad de aplicaciones en las que se utilizan activamente. Para obtener NPs estables y evitar su aglomeración, es necesario utilizaragentes estabilizantes durante la síntesis. Estas moléculas se adsorben sobre la superficie de las NPs y evitan que estas interaccionen directamente con las partículas vecinas. Si bien existen diversas moléculas que pueden ser utilizadas para este fin, uno de los únicos tipos de NPs metálicas cuya distribución de tamaños es estrecha, son estables a lo largo del tiempo y pueden ser obtenidas en forma de polvo, lavadas, y utilizadas como si se tratase de un compuesto químico tradicional, son las NPs cubiertas por tioles. La gran estabilidad de estas partículas está dada por la alta energía del enlace que se forma entre el azufre del grupo tiol y el metal. Resulta, entonces, particularmente interesante estudiar la interfase entre la superficie metálica y las moléculas adsorbidas. En este trabajo se presenta un estudio de la interfase Au-tiol y Pd-tiol en diferentes sistemas que van desde monocapas autoensambladas (SAMs) de tioles sobre superficies planas hasta compuestos poliméricos de tiolatos metálicos, con especial énfasis en las NPs metálicas cubiertas por tioles. El estudio de estos sistemas fue realizado mediante la utilización de diversas técnicas. En todos los experimentos se controlaron las condiciones de medida de manera tal de minimizar los daños producidos sobre las muestras. En los casos en que esto no fue posible, se intentó elucidar qué tipo de daño se estaba produciendo para realizar el análisis de los resultados teniendo en cuenta estos efectos o bien descartar los datos que hayan sido afectados por los mismos.

Orientador: Oswaldo Luiz Alves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T13:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Otubo_Larissa_D.pdf: 20335674 bytes, checksum: e95a782705baee771821f94a195ba7d0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste trabalho foram feitas preparações de nanopartículas de ouro passivadas com diferentes moléculas orgânicas (4,4'-tiobisbenzenotiol, benzenotiol, aminotiofenol e tiocolesterol). Tais moléculas possuem cadeias aromáticas mono ou difuncionalizadas, tendo tióis e aminas como grupamentos terminais. Foram estudados parâmetros como tamanho, estabilidade frente à agregação e coalescência, formação de blocos de agregados de nanopartículas conectadas por moléculas bifuncionais, variações das absorções no UV-Vis frente à sua formação e agregação, mostrando a importância das moléculas passivadoras nas propriedades das nanopartículas. Foram estudados também os efeitos causados pelo tratamento hidrotérmico sobre os agregados de nanopartículas passivadas com mono e ditióis. Tal estudo reforçou a importância das moléculas passivadoras na estabilidade das nanopartículas, sendo que o ditiol utilizado foi capaz de impedir o crescimento e coalescência das nanopartículas. Na segunda parte desta Tese, foram feitas as purificação e modificação química de nanotubos de carbono de parede simples com grupamentos oxigenados, tióis e aminas, visando a sua interação com nanopartículas de ouro. Foram abordados dois métodos de interação dos nanotubos com as nanopartículas de ouro: o in situ e o ex situ. Tais métodos estão relacionados com a redução do ouro e formação das nanopartículas em presença ou não dos nanotubos modificados, respectivamente. Foi observado que o tipo de grupamento na superfície dos nanotubos e o método de interação influenciaram tanto na quantidade de nanopartículas aderidas aos nanotubos, dado as diferenças de afinidade, quanto na distribuição de tamanho / Abstract: In this Thesis, passivated gold nanoparticles were prepared with different types of organic molecules (4,4'-thiobisbenzenethiol, benzenethiol, aminethiophenol e thiocolesterol). These molecules have aromatic chains, mono or difunctionalized, with thiols and amines as terminal groups. Some aspects were studied: size, stability against aggregation and coalescence, formation of blocks of nanoparticles, connected through bifuntional molecules, variations of UV-Vis absorption during aggregation, wich showed the importance of the passivating molecules on the final properties of the nanoparticles. Hydrothermal treatments were also carried out on the nanoparticles aggregates.Such study reinforced the importance of the passivating molecules on the nanoparticles' stabilization, once the dithiol showed to be capable of preventing the growing and coalescence of the nanoparticles. In the second part of this work, single-walled carbon nanotubes were purified and chemically modified. The chemical modification on the surface of the carbon nanotubes were done resulting in oxygenated, thiol and amine groups, aiming their interaction with gold nanoparticles. Two methods of interaction of the carbon nanotubes with gold nanoparticles were used: in situ and ex situ. Such methods are related with the reduction of gold and formation of the nanoparticles in presence or not of the modified nanotubes, respectively. It was observed that the type of surface modification of the nanotubes and the method of interaction influenced not only in the amount of nanoparticles on the surface of the nanotubes, due to different affinity, but also the size distribution / Doutorado / Quimica Inorganica / Doutor em Ciências