Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (σE) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (σE) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

[ES] La presente tesis "Vías de inmovilización de biomoléculas sobre SU-8 y otras superficies poliméricas para su utilización en biosensado óptico sin marcaje" tiene como objetivo el diseño, desarrollo y evaluación de diferentes métodos de anclaje de biorreceptores en distintos materiales, en formato de micromatriz, con aplicación en biosensado. En la actualidad sigue siendo un área de creciente interés desarrollar nuevos sistemas de análisis para la detección de analitos, más sensibles y selectivos, con tiempos de análisis reducidos, miniaturizables y automatizables. Estos desarrollos pueden aplicarse en dispositivos biosensores que encuentran su aplicación en campos tan diversos como diagnóstico clínico, medicina forense y medio ambiente. Con el objetivo de desarrollar biosensores con prestaciones mejoradas se estudiaron estrategias de inmovilización de sondas sobre el soporte de ensayo basadas en el empleo de hidrogeles. En una primera fase, los desarrollos se realizaron usando tecnología de micromatrices de fluorescencia, que permite utilizar una menor cantidad de muestra y analizar múltiples analitos y muestras a la vez, reduciendo el tiempo de análisis y el coste Posteriormente, los desarrollos ya optimizados se emplearon para la puesta a punto de un biosensor óptico sin marcaje de tipo BICELL (Biophotonic Sensing Cells) en colaboración con la UPM (Universidad Politecnica de Madrid), que se aplicaron a sistemas modelo y a problemas reales. Asimismo, y en colaboración con el Centro de Tecnología Nanofotónica de la UPV, se implementó la estrategia de inmovilización a través del uso de hidrogeles, en biosensores ópticos sin marcaje constituidos por guías de ondas corrugadas. En este caso, además de la inmovilización a través de hidrogeles, se estudió un método de inmovilización covalente de fragmentos de anticuerpos que permitió su fijación orientada y muy próxima a la superficie del sensor. La tesis se estructura en seis capítulos. En el Capítulo 1 se da una visión general del concepto de biosensado, atendiendo a las distintas clasificaciones y los diferentes aspectos que hay que considerar en su diseño. En el Capítulo 2 se plantean los objetivos generales y particulares de la tesis. El Capítulo 3 plantea la aplicación de dos hidrogeles fotoinducidos derivados de fosforicolina y dextrano para mejorar la inmovilización de biomoléculas en formato micromatriz, sobre superficies planas y usando el formato de micromatriz de fluorescencia para realizar ensayos de detección con proteínas y oligonucleótidos. La polimerización del gel y el anclaje de las sondas se lleva a cabo simultáneamente mediante la utilización de reacciones fotoinducidas empleando la química click de acoplamiento tiol-eno. En el Capítulo 4 se implementa el método desarrollado en micromatriz con uno de los hidrogeles en dos tipos de biosensores interferométricos sin marcaje fabricados en SU-8. Con ambos sensores se detecta CRP en suero con muy buena sensibilidad (, LOD de 21 pg/mL). Por otro lado, esta estrategia se ensaya también en sensores nanofotónicos basados en guías de ondas corrugadas con resultados prometedores. En este capítulo también se pone a punto y se evalúa en tiempo real la inmovilización de fragmentos de anticuerpo sobre la superficie del sensor nanofotónico, mediante la reacción de acoplamiento tiol-eno inducida por luz UV. La monitorización en tiempo real permite demostrar el papel indispensable de la luz en el proceso de inmovilización. Utilizando esta aproximación se ensaya la detección sin marcaje de tres biomarcadores cardíacos de interés (CRP, cTnI/T y Mioglobina). El quinto capítulo se dedica a la descripción detallada de todos los procedimientos experimentales que se llevan a cabo en los Capítulos 3 y 4. Finalmente, el Capítulo 6 recoge las conclusiones alcanzadas a partir de los resultados obtenidos en el desarrollo de la tesis doctoral. / [EN] This thesis "Biomolecule immobilization approaches on SU-8 and other polymer surfaces for label-free optical biosensing" aims to design, develop and evaluate different methods for anchoring bioreceptors in different materials, in a microarray format, with application in biosensing. Currently, it is still an area of growing interest to develop new analysis systems for the detection of biomolecules, being more sensitive and selective, with reduced analysis time, miniaturizable and automatable. These developments can be applied in biosensing devices that find utility in fields as diverse as clinical diagnosis, forensic medicine and environmental monitoring. To develop biosensors with improved performance, here strategies for immobilization of probes on the test support based on the use of hydrogels were studied. In a first phase, the developments were carried out using microarray technology, which uses lower amount of sample and can analyze multiple targets and samples at the same time, reducing tests time and cost. Subsequently, the optimized developments were used to develop, in collaboration with UPM (Polytechnic University of Madrid), a label-free optical biosensor based onBICELLs (Biophotonic Sensing Cells), which were applied to model systems and real samples. Likewise, and in collaboration with the Nanophotonic Technology Center at UPV, the hydrogel-based immobilization strategy was implemented in other label-free nanophotonic biosensors consisting of corrugated waveguides. In this case, in addition to immobilization through hydrogels, we studied a method of covalent immobilization of antibody fragments that allowed them to be oriented and very close to the sensor surface. Thus the thesis is organized into six chapters. Chapter 1 gives an overview of the concept of biosensing, and takes into account the different classifications and different items that must be considered in its design. Chapter 2 sets out the general and particular objectives of the thesis. Chapter 3 discusses the application of two photoinduced hydrogels, derived from phosphoricoline and dextran, respectively, to improve the immobilization of biomolecules in microarray format, on planar surfaces and using the fluorescence microarray format to perform detection assays with proteins and oligonucleotides. The polymerization of the gel and the anchoring of the probes are carried out using photoinduced reactions using the thiol-ene coupling click chemistry, and derivatives, performing both steps simultaneously. In Chapter 4 the method developed with one of the hydrogels in microarray format is transferred to two types of SU-8 based interferometric label-free biosensors. Both biosensors detected CRP in blood serum with very good sensitivity (LOD de 21 pg/mL). Besides, this strategy is also tested on nanophotonic sensors based on corrugated waveguides with promising results. In this chapter, immobilization of antibody fragments on the surface of the nanophotonic sensor is also performed and assessed in real time by the UV light-induced thiol-ene coupling reaction. Real-time monitoring shows the essential role of light in the immobilization process. Using this approach, the label-free detection of three cardiac biomarkers of interest (CRP, cTnI / T and Myoglobin) is tested. The fifth chapter is devoted to the detailed description of all the experimental procedures that are carried out in chapters 3 and 4. Finally, Chapter 6 collects the conclusions reached from the results obtained in the development of the doctoral thesis. / [CA] La present tesi "Vies d'immobilització de biomolècules sobre SU-8 i altres superfícies polimèriques per a la seva utilització en biosensado òptic sense marcatge" té com a objectiu el disseny, desenvolupament i avaluació de diferents mètodes d'ancoratge de bioreceptors en diferents materials, en format de micromatriu , amb aplicació en biosensat. En l'actualitat segueix sent una àrea de creixent interès desenvolupar nous sistemes d'anàlisi per a la detecció de biomolècules, que siguen més sensibles i selectius, amb temps d'anàlisi reduïts, miniaturizables i automatitzables. Aquests desenvolupaments poden aplicar-se en dispositius biosensors que troben la seva utilitat en camps tan diversos com diagnòstic clínic, medicina forense i medi ambient. Amb l'objectiu de desenvolupar biosensors amb prestacions millorades es van estudiar estratègies d'immobilització de sondes sobre el suport d'assaig basades en l'ús de hidrogels. En una primera fase, els desenvolupaments es van realitzar usant tecnologia de micromatrius, que permet utilitzar una menor quantitat de mostra i analitzar múltiples dianes i mostres alhora, reduint el temps d'anàlisi i el cost Posteriorment, els desenvolupaments ja optimitzats es van emprar per a la posada a punt d'un biosensor òptic sense marcatge de tipus BICELL (Biophotonic Sensing Cells) en col·laboració amb la UPM (Universitat Politècnica de Madrid), que es van aplicar a sistemes model i als problemes reals. Així mateix, i en col·laboració amb el Centre de Tecnologia Nanofotònica de la UPV, es va implementar l'estratègia d'immobilització a través de l'ús de hidrogels, en biosensors òptics sense marcatge constituïts per guies d'ones corrugades. En aquest cas, a més de la immobilització mitjançant hidrogels es va estudiar un mètode d'immobilització covalent de fragments d'anticossos que va permetre la seva unió orientada i molt propera a la superfície del sensor. Així donç, la tesi s'estructura en sis capítols. En el capítol 1 es dóna una visió general delconcepte de biosensat, atenent les diferents classificacions i els diferents aspectes que cal considerar en el seu disseny. En el capítol 2 es plantegen els objectius generals i particulars de la tesi. El Capítol 3 planteja l'aplicació de dos hidrogels fotoinduïts derivats de fosforicolina i dextrà respectivament per millorar la immobilització de biomolècules en format micromatriu, sobre superfícies planes i usant el format de micromatriu de fluorescència per a realitzar assajos de detecció amb proteïnes i oligonucleòtids. La polimerització dell gel i l'ancoratge de les sondes es porta a terme simultàniament mitjançant la utilització de reaccions fotoinducides emprant la química click d'acoblament tiol-eno, i derivades. En el capítol 4 s'implementa el mètode desenvolupat en micromatriu amb un dels hidrogels en dos tipus de biosensors interferométricos sense marcatge basats en SU-8. Amb tots dos sensors es detecta CRP en sèrum sanguini amb molt bona sensibilitat (LOD de 21 pg/mL). D'altra banda, aquesta estratègia s'assaja també en sensors nanofotònics basats en guies d'ones corrugades amb resultats prometedors. En aquest capítol també es posa a punt i s'avalua en temps real la immobilització de fragments d'anticòs sobre la superfície del sensor nanofotònic, mitjançant la reacció d'acoblament tiol-eno induïda per llum UV. El monitoratge en temps real permet demostrar el paper indispensable de la llum en el procés d'immobilització. Utilitzant aquesta aproximació s'assaja la detecció sense marcatge de tres biomarcadors cardíacs d'interès (CRP, cTnI / T i Mioglobina). El cinquè capítol es dedica a la descripció detallada de tots els procediments experimentals que es duen a terme en els capítols 3 i 4. Finalment, el Capítol 6 recull les conclusions assolides a partir dels resultats obtinguts en el desenvolupament de la tesi doctoral. / Agradecer a la financiación de esta investigación por Garantía Juvenil, FEDER y los proyectos del MINECO CTQ / 2016/75749‐R y TEC / 2017/84846‐R. Además, fue apoyado por el Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del proyecto H2020‐PHC‐634013 (PHOCNOSIS). / Díaz Betancor, Z. (2020). Vías de inmovilización de biomoléculas sobre SU-8 y otras superficies poliméricas para su utilización en biosensado óptico sin marcaje [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149576 / TESIS

I detta arbete så har en uppsättning aromatiska ditiol-ligander framställts (3,5-dimerkaptobensoesyra I, methyl-3,5-dimerkaptobensoat II, 3,5-dimerkaptotoluen III, 4,6-dimerkaptoisoftalaldehyde IV). En trestegssyntes innehållande Newman-Kwart omlagring som nyckelsteg användes för framställning av föreningarna I-III medan förening IV togs fram via en annan syntesväg. De fyra föreningarna syntetiserades I relativt bra utbyte (5-80% över 3, 4 eller 6 steg) och karaktäriserades med hjälp av 1H-NMR, 13C-NMR, och högupplösande masspektrometri. I en framtida fortsättning av projektet så kommer föreningarna I-IV användas som organiska ligander i koordinationspolymerer, vilka kommer karaktäriseras i termer av elektriska och termiska egenskaper. / In this work, a family of aromatic dithiol ligands were synthesized in the laboratory (3,5-dimercapto benzoic acid I, methyl 3,5-dimercapto benzoate II, 3,5-dimercapto toluene III, 4,6-dimercaptoisophthalaldehyde IV). A three-step synthesis strategy, involving the Newman-Kwart rearrangement as key step, for the formation of I, II and III was used, whereas compound IV required a different synthetic route. The four compounds were synthesized with relatively good yields (5-80% over 3, 4 or 6 steps) and were fully characterized using 1H-NMR, 13C-NMR, and high-resolution mass spectrometry. In a future extension of this work, compounds I-IV will be used as organic ligands in coordination polymers (CPs), which will be characterized in terms of electric and thermal properties.

Estudos da reatividade de espécies oxidantes e a interação destas espécies com estruturas sensíveis a oxidação e antioxidantes em condições biológicassão de grande importância no entendimento dos processos redox em alimentos e no corpo humano. A mioglobina é a ferro heme proteína majoritária do músculo esquelético de mamíferos e a sua ativação por peróxido de hidrogênio dá origem às espécies reativas de ferro heme hipervalentes,perferrilmioglobina e ferrilmioglobina, que podem induzir a condição de estresse oxidativo. A reação das espécies de ferro heme hipervalentes com constituintes do meio biológico ou alimentos como proteínas ou membranas podem tanto afetar a qualidade de produtos cárneos quanto causar danos celulares no trato gastrointestinal durante sua digestão.Pequenas moléculas tais como o NO, H2S e CO são produzidas endogenamente em sistemas biológicos e, além de desempenharem importantes funções na manutenção dometabolismo celular,podem apresentar atividade antioxidante.A presente Tese procurou investigara cinética e o mecanismo para a redução das espécies perferrilmioglobina e ferrilmioglobina pelo monóxido de carbono, reação esta que apresentaconstante de velocidade de segunda ordem de k2 =(3,3 ± 0,6) 102 mol L-1, a 25 oC, para a redução da espécie perferrilmioglobina. Posteriormente,foi investigada a cinética e mecanismo de redução da ferrilmioglobinapelo H2S levando à formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II). A constante de segunda ordem obtida para a reação entre a espécie protonada da ferrilmioglobina e o H2Sfoide k2 = (2,5 ± 0,1) 106 L mol-1 s-1, duas ordens de magnitude superior a constante de velocidade paraa reação entre a espécie ferrilmioglobina e o íonHS-, k2 = (1,0 ± 0,7)104L mol-1 s-1a 25 oC.Para a redução da espécie ferrilmioglobina pelo H2S/HS- e a formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II) observa-se um efeito de compensação de temperatura (?H? = (2,1 ± 0,9) kJ mol-1) o que é um fator determinante na ocorrência do processo de greening em produtos cárneos condimentados durante estocagem a baixa temperatura. A formação da espécie sulfomioglobina foi também investigada na reação de redução da ferrilmioglobina pela L-cisteína. Para esta reação foi observada dependência do mecanismo da reação com o pH. A formação da espécie sulfomioglobina foi observada para a reação conduzia em meio ácido a neutro, enquanto que para a reação em condições alcalinas, observa-se a formação majoritária da espécie oximioglobina. Areação da cisteína com a espécie protonada da ferrilmioglobina apresentou constante de segunda ordem de k2 = (5,1 ± 0,4)L mol-1 s-1, e a reação entre a cisteína diânion e a ferrilmioglobina,em meio alcalino,apresentou constante de velocidade de segunda ordem com k2 =(0,12 ± 0,01) L mol-1s-1.A diferença de reatividade e no produto da reação é um indicativo da mudança de mecanismo de transferência de elétrons seguida de adição do radical HSo, em meio ácido, para um mecanismo sequencial detransferência de elétrons do dianion da cisteína para as espécies ferrilmioglina e metamioglobina levando a formação de oximioglobina em condições alcalinas. / Studies on the reactivity and interaction of oxidant species with oxidizable sensitive structures and antioxidants in biological settings are of great importance for understanding the redox process in food and in the human body. Myoglobin is the major heme-iron protein in the mammal skeletal muscle and its activation by hydrogen peroxide generate reactive hypervalent heme-iron species, perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin, which may induce oxidative stress conditions. The reaction of hypervalent heme-iron species with biological medium or food constituents like proteins or membranes may affect the quality of meat products or could lead to cellular damage in the gastrointestinal tract during digestion. Small molecules like NO, H2S, and CO are produced endogenously in biological systems and, despite playing relevant function in the maintenance of cell metabolism, may present antioxidant activity. The present Thesis aimed to investigate the kinetics and mechanism for the reduction of perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin species by carbon monoxide, reaction that shows a second-order reaction constant with k2 = (3.3 ± 0.6) 102L mol-1 s-1at 25 oC for the reduction of the perferrylmyoglobin species. Furthermore, the kinetics and mechanism for the reduction of the ferrylmyoglobin by H2S leading to the formation of the sulfmyoglobin-Fe(II) species has been investigated. The obtained second-order rate constant for the reaction between the protonated ferrylmyoglobin species and H2S was k2 = (2.5 ± 0.1) 106 L mol-1 s-1, two-orders of magnitude higher than the second-order rate constant for the reaction between the ferrylmyoglobin species and the HS- ion, k2 = (1.0 ± 0.7) 104L mol-1 s-1at 25 oC. For the ferrylmyoglobin species reduction by H2S/HS- and the formation of sulfmyoglobin-Fe(II) it is observed an temperature compensation effect (?H? = (2.1 ± 0.9) kJ mol-1) which is the determination factor for the occurrence of the greening process in condiment meat products during storage at low temperature. The formation of the sulfmyoglobin species has been further investigated during the reduction reaction of ferrylmyoglobin by L-cysteine. For this reaction it was observed a dependence of the reaction mechanism on the pH. The formation of sulfmyoglobin was observed for the reaction conducted in acidic and neutral medium, meanwhile for the reaction in alkaline conditions, it is mainly observed the formation of oxymyoglobin. The reaction between cysteine and the protonated ferrylmyoglobin species shown second-order rate constant with k2 = (5.1 ± 0.4) L mol-1 s-1, and the reaction between the cysteine dianion and ferrylmyoglobin, in alkaline medium, shows second order rate constant with k2 = (0.12 ± 0.01) L mol-1s-1.The difference in reactivity and in the reaction product is an indicative of change of the electron transfer-radical addition mechanism to a sequential electron transfer mechanism from the cysteine dianion to the ferrylmyoglobin and metmyoglobin species leading to the formation of oxymyoglobin under alkaline conditions.

Estudos da reatividade de espécies oxidantes e a interação destas espécies com estruturas sensíveis a oxidação e antioxidantes em condições biológicassão de grande importância no entendimento dos processos redox em alimentos e no corpo humano. A mioglobina é a ferro heme proteína majoritária do músculo esquelético de mamíferos e a sua ativação por peróxido de hidrogênio dá origem às espécies reativas de ferro heme hipervalentes,perferrilmioglobina e ferrilmioglobina, que podem induzir a condição de estresse oxidativo. A reação das espécies de ferro heme hipervalentes com constituintes do meio biológico ou alimentos como proteínas ou membranas podem tanto afetar a qualidade de produtos cárneos quanto causar danos celulares no trato gastrointestinal durante sua digestão.Pequenas moléculas tais como o NO, H2S e CO são produzidas endogenamente em sistemas biológicos e, além de desempenharem importantes funções na manutenção dometabolismo celular,podem apresentar atividade antioxidante.A presente Tese procurou investigara cinética e o mecanismo para a redução das espécies perferrilmioglobina e ferrilmioglobina pelo monóxido de carbono, reação esta que apresentaconstante de velocidade de segunda ordem de k2 =(3,3 ± 0,6) 102 mol L-1, a 25 oC, para a redução da espécie perferrilmioglobina. Posteriormente,foi investigada a cinética e mecanismo de redução da ferrilmioglobinapelo H2S levando à formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II). A constante de segunda ordem obtida para a reação entre a espécie protonada da ferrilmioglobina e o H2Sfoide k2 = (2,5 ± 0,1) 106 L mol-1 s-1, duas ordens de magnitude superior a constante de velocidade paraa reação entre a espécie ferrilmioglobina e o íonHS-, k2 = (1,0 ± 0,7)104L mol-1 s-1a 25 oC.Para a redução da espécie ferrilmioglobina pelo H2S/HS- e a formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II) observa-se um efeito de compensação de temperatura (?H? = (2,1 ± 0,9) kJ mol-1) o que é um fator determinante na ocorrência do processo de greening em produtos cárneos condimentados durante estocagem a baixa temperatura. A formação da espécie sulfomioglobina foi também investigada na reação de redução da ferrilmioglobina pela L-cisteína. Para esta reação foi observada dependência do mecanismo da reação com o pH. A formação da espécie sulfomioglobina foi observada para a reação conduzia em meio ácido a neutro, enquanto que para a reação em condições alcalinas, observa-se a formação majoritária da espécie oximioglobina. Areação da cisteína com a espécie protonada da ferrilmioglobina apresentou constante de segunda ordem de k2 = (5,1 ± 0,4)L mol-1 s-1, e a reação entre a cisteína diânion e a ferrilmioglobina,em meio alcalino,apresentou constante de velocidade de segunda ordem com k2 =(0,12 ± 0,01) L mol-1s-1.A diferença de reatividade e no produto da reação é um indicativo da mudança de mecanismo de transferência de elétrons seguida de adição do radical HSo, em meio ácido, para um mecanismo sequencial detransferência de elétrons do dianion da cisteína para as espécies ferrilmioglina e metamioglobina levando a formação de oximioglobina em condições alcalinas. / Studies on the reactivity and interaction of oxidant species with oxidizable sensitive structures and antioxidants in biological settings are of great importance for understanding the redox process in food and in the human body. Myoglobin is the major heme-iron protein in the mammal skeletal muscle and its activation by hydrogen peroxide generate reactive hypervalent heme-iron species, perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin, which may induce oxidative stress conditions. The reaction of hypervalent heme-iron species with biological medium or food constituents like proteins or membranes may affect the quality of meat products or could lead to cellular damage in the gastrointestinal tract during digestion. Small molecules like NO, H2S, and CO are produced endogenously in biological systems and, despite playing relevant function in the maintenance of cell metabolism, may present antioxidant activity. The present Thesis aimed to investigate the kinetics and mechanism for the reduction of perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin species by carbon monoxide, reaction that shows a second-order reaction constant with k2 = (3.3 ± 0.6) 102L mol-1 s-1at 25 oC for the reduction of the perferrylmyoglobin species. Furthermore, the kinetics and mechanism for the reduction of the ferrylmyoglobin by H2S leading to the formation of the sulfmyoglobin-Fe(II) species has been investigated. The obtained second-order rate constant for the reaction between the protonated ferrylmyoglobin species and H2S was k2 = (2.5 ± 0.1) 106 L mol-1 s-1, two-orders of magnitude higher than the second-order rate constant for the reaction between the ferrylmyoglobin species and the HS- ion, k2 = (1.0 ± 0.7) 104L mol-1 s-1at 25 oC. For the ferrylmyoglobin species reduction by H2S/HS- and the formation of sulfmyoglobin-Fe(II) it is observed an temperature compensation effect (?H? = (2.1 ± 0.9) kJ mol-1) which is the determination factor for the occurrence of the greening process in condiment meat products during storage at low temperature. The formation of the sulfmyoglobin species has been further investigated during the reduction reaction of ferrylmyoglobin by L-cysteine. For this reaction it was observed a dependence of the reaction mechanism on the pH. The formation of sulfmyoglobin was observed for the reaction conducted in acidic and neutral medium, meanwhile for the reaction in alkaline conditions, it is mainly observed the formation of oxymyoglobin. The reaction between cysteine and the protonated ferrylmyoglobin species shown second-order rate constant with k2 = (5.1 ± 0.4) L mol-1 s-1, and the reaction between the cysteine dianion and ferrylmyoglobin, in alkaline medium, shows second order rate constant with k2 = (0.12 ± 0.01) L mol-1s-1.The difference in reactivity and in the reaction product is an indicative of change of the electron transfer-radical addition mechanism to a sequential electron transfer mechanism from the cysteine dianion to the ferrylmyoglobin and metmyoglobin species leading to the formation of oxymyoglobin under alkaline conditions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The diphenyl ditelluride (PhTe)2 is one of the most toxic organic compounds of tellurium which can make their use unsafe. The mechanism(s) involved in (PhTe)2 toxicity is(are) elusive, but thiol oxidation of critical proteins are important targets. Consequently, the possible remedy of its toxicity by thiol-containing compounds is of experimental and clinical interest. Therefore, this study aimed to evaluate the toxicity of in vivo exposure to (PhTe)2 from oxidative stress biomarkers and behavioral parameters in adult mice and the possible protective effect of N-acetylcysteine (NAC). They evaluated parameters of oxidative stress and behavior in mice. In order to alleviate the toxicity, NAC was administered before (3 days) and simultaneously (PhTe)2 (7 days). Mice were separated into six groups receiving daily injections of (1) Potassium phosphate buffer (TFK) (2.5 ml/kg, intraperitonealy (i.p.)) plus canola oil (10 ml/kg, subcutaneously (s.c.)), (2) NAC (100 mg/kg, i.p.) plus canola oil s.c., (3) TFK i.p. plus (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), (4) TFK i.p. plus (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.), (5) NAC plus (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), and (6) NAC plus (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.). Treatment with (PhtE) started on day 2 of treatment with NAC. The results demonstrate that (PhTe)2 induced behavioral changes in locomotor activity at a concentration of 50 μmol/kg and NAC did not change the effect of (PhTe)2. Motor coordination and lift the bar were compromised and both showed severe motor abnormalities in test animals independent of concentration of (PhTe)2 . The (PhTe)2 also inhibited important selenoenzymes, thioredoxin reductase (at concentrations of 10 μmol/kg and 50 μmol/kg) and glutathione peroxidase (at concentration of 10 μmol/kg) but produced little or no effect on the antioxidant activity of catalase and glutathione reductase. Contrary to expectation, the co-administration of NAC did not protect against deleterious effects (PhTe)2. It was possible to establish high sensitivity of brain tissue compared to the damage (PhTe)2. Other low molecular weight thiols must be investigated to determine whether they may or may not be effective against ditellurides. / O ditelureto de difenila (PhTe)2 é um dos compostos orgânicos de telúrio mais tóxicos, o que pode tornar seu emprego pouco seguro. O mecanismo envolvido na toxicidade do (PhTe)2 ainda é incerto, mas a oxidação de tióis em proteínas são alvos importantes. A partir disso, compostos contendo tiol possívelmente poderiam solucionar ou minimizar a sua toxicidade. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade da exposição in vivo ao (PhTe)2 a partir de biomarcadores de estresse oxidativo e parâmetros comportamentais em camundongos adultos e o possível efeito protetor da N-acetilcisteína (NAC). Foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e comportamentais em camundongos. A fim de mitigar a toxicidade, foi administrado NAC antes (3 dias) e, simultaneamente ao (PhTe)2 (7 dias). Os camundongos foram separados em seis grupos que receberam injeções diárias de (1) Tampão fosfato de potássio (TFK) (2.5 ml/kg, intraperitonealmente (i.p.)) mais óleo de canola (10 ml/kg, subcutaneamente (s.c.)), (2) NAC (100 mg/kg, i.p.) mais óleo de canola s.c., (3) TFK i.p. mais (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), (4) TFK i.p. mais (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.), (5) NAC mais (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), e (6) NAC mais (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.). O tratamento com (PhTe)2 começou no quarto dia de tratamento com NAC. Os resultados demonstram que (PhTe)2 induziu alterações comportamentais na atividade locomotora na concentração de 50 μmol/kg e a NAC não modificou o efeito do (PhTe)2. A coordenação motora e a força de sustentação na barra foram comprometidas e ambas revelaram alterações motoras graves nos animais testados independente da concentração de (PhTe)2. O (PhTe)2 também inibiu selenoenzimas importantes, tiorredoxina redutase (nas concentrações de 10 μmol/kg e 50 μmol/kg) e glutationa peroxidase (na concentração de 10 μmol/kg), mas produziu mínimo ou nenhum efeito sobre a atividade antioxidante da catalase e glutationa redutase. Contrariamente ao esperado, a co-administração com NAC não protegeu contra os efeitos deletérios do (PhTe)2. Foi possível estabelecer grande sensibilidade do tecido cerebral frente aos danos causados pelo (PhTe)2. Outros tióis de baixo peso molecular devem ser investigados para determinar se eles podem ou não ser eficazes contra diteluretos.

Orientador: Newton Luiz Dias Filho / Resumo: No presente trabalho, a 3-cloropropil sílica gel (SG) foi preparada e organofuncionalizada com dois grupos funcionais, 2-aminotiazol (SATZ) e 5-amino-1,3,4-tiadiazol-2-tiol (SATT). Com o objetivo de produzir novos materiais através da modificação química da superfície da sílica gel, com aplicabilidade na remoção de íons metálicos em meio etanólico, tendo a possibilidade de serem aplicados na remoção de metais pesados em combustível etanol e aguardente. Esses novos materiais também podem ser trabalhados como novos eletrodos quimicamente modificados na detecção de nitrito encontrado na urina e em águas naturais. Esses materiais foram caracterizados por técnicas de espectroscopia na Região do Infravermelho (FTIR), ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Posteriormente foram realizados estudos de adsorção de íons metálicos (Cu+2, Cd+2 e Zn+2) para o SATZ e SATT em solvente etanólico (99%). Para testar a capacidade de adsorção de íons metálicos, determinou-se a cinática de adsorção para todos íons Cu+2, Cd+2 e Zn+2 (40 minutos), determinou-se a capacidade de adsorção (Nf) através de isotermas com diferentes concentrações molares dos íons metálicos. Ambos os adsorventes tiveram uma capacidade máxima de adsorção maior para os íons Zn2+ do que para os íons Cd2+ e Cu2+, de acordo com a seguinte ordem: Zn2+>Cd2+>Cu2+. Em uma segunda etapa do trabalho após a adsorção dos íons cúpricos (Cu2+) pelo SATT, reagiu-se o SATT com hexacianoferrato (III) ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the present work, 3-chloropropyl silica gel (SG) was prepared and organofunctionalized with two functional groups, 2-aminothiazole (SATZ) and 5-amino-1,3,4-thiadiazole-2-thiol (SATT). With the objective of producing new materials through the chemical modification of the silica gel surface, with applicability in the removal of metallic ions in ethanolic medium, having the possibility of being applied in the removal of heavy metals in fuel ethanol and brandy. These new materials can also be worked as new chemically modified electrodes in the detection of nitrite found in urine and in natural waters. These materials were characterized by Infrared Region Spectroscopy (FTIR), Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Scanning Electron Microscopy (SEM) techniques. Subsequently, adsorption studies of metal ions (Cu + 2, Cd + 2 and Zn + 2) were performed for SATZ and SATT in ethanolic solvent (99%). The adsorption kinetics were determined for all metal ions Cu + 2, Cd + 2 and Zn + 2 (40 minutes), the adsorption capacity (Nf) was determined through isotherms with different molar concentrations of the metal ions. Both adsorbents had a maximum adsorption capacity it was higher for Zn2 + ions than for Cd2 + and Cu2 + ions, according to the following order: Zn2 +> Cd2 + > Cu2+ . In a second step of the work after the copper ions (Cu2+) adsorption by SATT, the SATT was reacted with potassium hexacyanoferrate (III), thus forming the CuSATTH complex. The graphite paste electrode chemically mod... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre