Einleitung: Zu den konventionellen αβ T-Zellen zählen die klassischen CD4+ einfach-positiven T-Helfer (Th) bzw. regulatorischen T-Zellen (Treg) sowie CD8αβ+ einfach-positive zytotoxische T-Zellen. Säugetiere besitzen jedoch noch weitere T-Zell-Subpopulationen, die entweder den T-Zell-Rezeptor αβ (TCRαβ) oder γδ (TCRγδ) exprimieren. Bei Hunden wurde bisher nur die hoch aktivierte CD4+CD8α+ doppelt-positive (dp) T-Zellpopulation des peripheren Blutes detailliert charakterisiert. Über ihre Verteilung in lymphatischem und nicht lymphatischem Gewebe ist jedoch wenig bekannt. Darüber hinaus besitzen Hunde αβ T-Zellen, die weder CD4 noch CD8α (CD4-CD8α- doppelt-negative (dn) T-Zellen) exprimieren, sowie γδ T-Zellen, deren Phänotyp bisher noch nicht untersucht wurde. Ziele der Studie: Ziel dieser Studie war es, einen Überblick über das Vorkommen und den Phänotyp von nichtkonventionellen T-Zellen im peripheren Blut und Geweben des Hundes zu bieten. Zu diesem Zweck wurden CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen hinsichtlich der Expression von Oberflächenmarkern, wichtigen Transkriptionsfaktoren und Zytokinen charakterisiert. Tiere, Material und Methoden: Canine T-Zellen Zellen aus dem Blut (Stichprobenumfang: n = 10) sowie aus den Peyerschen Platten (PP; n = 10), dem Dünndarmepithel (IEL; n = 6), den mesenterialen Lymphknoten (mLN; n = 10), tracheobronchialen Lymphknoten (tLN; n = 9), der Lunge (n = 10), Milz (n = 10) und dem Thymus (n = 10) wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Studiendesign erforderte, dass die Gewebeproben von einer anderen Gruppe gesunder Beagle-Hunde (n = 12) entnommen wurden als das periphere Blut. CD4+CD8α+ dp T-Zellen wurden auf ihre Gewebeverteilung, die Expression des T-Zell-Rezeptortyps und die Zusammensetzung des CD8-Dimers (d.h. CD8αα Homodimer vs. CD8αβ Heterodimer) sowie die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 untersucht. Um Hinweise auf die potenzielle(n) Funktion(en) von CD4+CD8α+ dp T-Zellen in Geweben zu erhalten, wurde die Expression des Transkriptionsfaktors Forkhead Box P3 (FoxP3) und des zytotoxischen Moleküls Granzym B analysiert. Darüber hinaus wurden Gewebe und Blut auf die Verteilung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen untersucht. Eine umfassende Charakterisierung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen des peripheren Blutes erfolgte durch die Untersuchung der folgenden Marker: CD25 und CD5, FoxP3, GATA-3, T-Box-Transkriptionsfaktor TBX21 (T-bet) und Granzym B. Im Rahmen funktioneller Analysen wurde die Zytokinproduktion (Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-17A, IL-17A) nach Stimulation der Zellen mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)/Ionomycin durchgeführt. Normalverteilte Datensätze wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Post-Hoc-Test (Vergleich mehrerer Gruppen) oder ungepaartem t-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) analysiert. Bei nichtparametrischen Daten wurde entweder der Kruskal-Wallis H-Test mit Dunn's Post-Test (Ver-gleich mehrerer Gruppen) oder der Mann-Whitney U-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) angewandt. Ergebnisse: Canine CD4+CD8α+ dp T-Zellen der Gewebe sind hauptsächlich TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ und akkumulieren in den PP (durchschnittlich 1.6 %). Obwohl CD4+CD8α+ dp T-Zellen der LN CD4 und CD8α nicht gleich stark exprimieren und zahlenmäßig gering (durchschnittlich 0,2 %) sind, sind sie teilweise FoxP3+. Dies weist auf ein regulatorisches Potential dieser Untergruppe hin. Einige CD4+CD8α+ dp T-Zellen der IEL exprimieren TCRγδ und/oder Granzym B, was die Einzigartigkeit der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten unterstreicht. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T-Zellen machen einen wesentlichen Anteil aller αβ T-Zellen in Blut (Median 14,4 %) und Gewebe (Median 15 % (Lunge) - 7,5% (PP)) aus und besitzen ein bemerkenswert hohes Expressionsniveau an CD25. CD25 wird entweder mit FoxP3 (hinweisend auf einen regulatorischen Phänotyp) oder ohne FoxP3 (hinweisend auf einen Effektorphänotyp) exprimiert. Zusätzlich weisen IFN-γ, GATA-3 oder IL-17A-exprimierende Subpopulationen Eigenschaften von konventio-nellen Typ 1 T-Helferzellen (Th1), Th2 bzw. Th17 auf. Interessanterweise wurden auch FoxP3+GATA-3+-Hybridzellen gefunden. Canine γδ T-Zellen hingegen sind entweder CD8α+ einfach-positiv oder CD4 CD8α- dn. Während TCRγδ+CD8α+ einfach-positive T-Zellen ihren zytotoxischen TCRαβ+CD8αβ+ T-Zell-Pendants ähneln (T-bet+, IFN-γ+, Granzym B+), exprimieren TCRγδ+CD4 CD8α- dn T-Zellen GATA-3 und nur geringe Mengen an T-bet und Granzym B. Schlussfolgerungen: Dies ist die erste Studie, die einen umfassenden Überblick über nichtkonventionelle T-Zell-Populationen des Hundes bietet. Hinsichtlich ihrer Gewebeverteilung, ihrer Anzahl und ihres funktionellen Potentials ist es wahrscheinlich, dass diese Zellen an wichtigen Immunreaktionen sowie an der Pathogenese von Erkrankungen des Hundes beteiligt sind. Hierzu werden weitere Studien erforderlich sein. Es ist anzumerken, dass das klassische Schema der CD4+ und CD8αβ+ einfach-positiven T-Zellen als canine Haupteffektor- bzw. regulatorische T-Zellen neu überdacht werden sollte. :1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65 / Introduction: Conventional αβ T cells comprise the classical CD4+ single-positive (sp) T helper (Th) resp. T regulatory (Treg) and CD8αβ+ sp cytotoxic T cell subsets. However, further T cell subpopulations either expressing T cell receptor αβ (TCRαβ) or γδ (TCRγδ) occur in mammals. In dogs, only the highly activated CD4+CD8α+ double-positive (dp) T cell population of peripheral blood has been characterized in detail. Yet, little is known about its distribution in lymphoid and non-lymphoid tissues. Furthermore, dogs possess αβ T cells neither expressing CD4 nor CD8α (CD4-CD8α- double-negative (dn) T cells) and γδ T cells, whose phenotype was still undefined. Aims of study: The objective of this study was to provide an overview on the occurrence and phenotype of non-conventional T cells in canine peripheral blood and tissues. To this end, CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn, and γδ T cells were characterized regarding expression of surface markers, key transcription factors, and cytokines. Animals, material and methods: Canine T lymphocytes from peripheral blood (sample size: n = 10), Peyer’s patches (PP; n = 10), epithelium of the small intestine (IEL; n = 6), mesenteric lymph nodes (mLN; n = 10), tracheobronchial lymph nodes (tLN; n = 9), lung (n = 10), spleen (n = 10), and thymus (n = 10) were analyzed by flow cytometry. Due to the study design tissue samples had to be taken from a different group of healthy Beagle dogs (n = 12) than peripheral blood. CD4+CD8α+ dp T cells were studied for their tissue distribution, expression of T cell receptor type and composition of the CD8 dimer (i.e. CD8αα homodimer vs. CD8αβ heterodimer), as well as expression of the activation marker CD25. To define the potential function(s) of CD4+CD8α+ dp T cells in tissues, expression of the transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) and the cytotoxic molecule granzyme B were analyzed. Furthermore, tissues and blood were studied for distribution of TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells. A comprehensive characterization of blood TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells was made by investigation of the following markers: CD25 and CD5, FoxP3, GATA-3, T-box transcription factor TBX21 (T-bet), and granzyme B. Functional analyses were performed by examination of cytokine production (interferon γ (IFN-γ) and interleukin 17A, IL-17A) following stimulation of cells with phorbol-myristate-acetate (PMA)/ionomycin. Normally distributed data sets were analyzed using One-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc test (multiple groups) or unpaired Student’s t-test (two-tailed; two groups). For nonparametric data, either Kruskal-Wallis H test with Dunn’s post-test (multiple groups) or Mann-Whitney U test (two-tailed; two groups) was applied. Results: Canine CD4+CD8α+ dp T cells of tissues can be mainly described as TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ accumulating in PP (1.6% on average). Although not homogeneous in expression levels of CD4 and CD8α and low in number (0.2% on average), CD4+CD8α+ dp T cells of LN are partly FoxP3+. This indicates regulatory potential of this subset. Some CD4+CD8α+ dp T cells of IEL express TCRγδ and/or granzyme B, underlining the uniqueness of intestinal intraepithelial lymphocytes. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T cells make up a substantial portion of all αβ T cells in blood (median 14.4%) and tissues (median 15% (lung) – 7.5% (PP)) with a remarkably high expression level of CD25. CD25 is either co-expressed with FoxP3 (reminiscent of a regulatory phenotype), or without FoxP3 (reminiscent of an effector phenotype). In addition, subsets expressing IFN-γ, GATA-3, or IL-17A suggest properties of conventional type 1 T helper cells (Th1), Th2, and Th17, respectively. Interestingly, FoxP3+GATA-3+ hybrid cells were found, too. Canine γδ T cells, on the other hand, are either CD8α+ sp or CD4-CD8α- dn. While TCRγδ+CD8α+ sp T cells resemble their TCRαβ+CD8αβ+ cytotoxic T cell counterparts (T-bet+, IFN-γ+, granzyme B+), TCRγδ+CD4-CD8α- dn T cells express GATA-3, and only low levels of T-bet and granzyme B. Conclusions: This is the first study providing a comprehensive overview on canine non-conventional T cell subsets. Regarding tissue distribution, abundance and functions resp. functional potential of these T cells, it is conceivable that they play a major role in health and diseases of dogs. Further studies examining this topic will be needed. Of note, the classical scheme of CD4+ sp Th/Treg and CD8αβ+ cytotoxic T cells as main effector/regulatory T cells in dogs should be reconsidered.:1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65

PURPOSE: Cytochrome P450 2W1 (CYP2W1) is a monooxygenase detected in 30% of colon cancers, whereas its expression in nontransformed adult tissues is absent, rendering it a tumor-specific drug target for development of novel colon cancer chemotherapy. Previously, we have identified duocarmycin synthetic derivatives as CYP2W1 substrates. In this study, we investigated whether two of these compounds, ICT2705 and ICT2706, could be activated by CYP2W1 into potent antitumor agents. EXPERIMENTAL DESIGN: The cytotoxic activity of ICT2705 and ICT2706 in vitro was tested in colon cancer cell lines expressing CYP2W1, and in vivo studies with ICT2706 were conducted on severe combined immunodeficient mice bearing CYP2W1-positive colon cancer xenografts. RESULTS: Cells expressing CYP2W1 suffer rapid loss of viability following treatment with ICT2705 and ICT2706, whereas the CYP2W1-positive human colon cancer xenografts display arrested growth in the mice treated with ICT2706. The specific cytotoxic metabolite generated by CYP2W1 metabolism of ICT2706 was identified in vitro. The cytotoxic events were accompanied by an accumulation of phosphorylated H2A.X histone, indicating DNA damage as a mechanism for cancer cell toxicity. This cytotoxic effect is most likely propagated by a bystander killing mechanism shown in colon cancer cells. Pharmacokinetic analysis of ICT2706 in mice identified higher concentration of the compound in tumor than in plasma, indicating preferential accumulation of drug in the target tissue. CONCLUSION: Our findings suggest a novel approach for treatment of colon cancer that uses a locoregional activation of systemically inactive prodrug by the tumor-specific activator enzyme CYP2W1.