This research was an attempt to use a dicot transformation vector to transform a monocot. The initial purpose of this thesis was to transform orchids with the sense and antisense coat protein genes from the Odontoglossum ringspot virus (ORSV) in an effort to mitigate viral symptoms in transgenic plants using the transformation vector, Agrobacterium tumefaciens. However, it soon became apparent that much time would be needed to develop a transformation protocol. The transformation vectors used included the Agrobacterium tumefaciens disarmed strain LBA4404 with the binary plasmid pB1121, the disarmed strain At699 with the binary plasmid pCNL65, and the wild-type strain Chry5. The marker gene on the binary plasmids of both disarmed strains was p-glucuronidase (GUS).Several transformation protocols were used in an effort to determine if this transformation system would work on orchids. Transformation was not achieved even though a number of experimental conditions were varied. These included using two different types of orchid tissue, callus and protocorms; using two different species of orchids, Cattleya Chocolate Drop x Cattleytonia Kieth Roth and Cymbidium maudidum; varying the time the plant tissue was exposed to the bacteria from 1 hour to 96 hours; performing experiments with and without the wound signal molecule acetosyringone; and exposing the tissue to the virulent strains of A. tumefaciens mentioned previously.This research also developed GUS assay conditions necessary to decrease the number of false positives due to bacterial contamination. These conditions included chloramphenicol in the GUS assay buffer. / Department of Biology

The Tobacco mosaic virus (TMV) is a simple and frequently used model virus which has been studied already more over than 130 years. Due to the intensive study of this virus the details of its infectious cycle, genomic information and also the structure of the created viral particle as well as the mechanism of its creation are known today. The process of encapsidation (viral particle formation) is sufficiently described in the in vitro conditions. In the in vitro conditions the origin of assembly (OAS) was also described. The OAS was identified in the coding sequence of the gene for the movement protein (MP). The importance of replication centers (replication factories) has also been supposed. The aim of the diploma thesis was to study the specificity of the interaction of RNA and coat protein in the process of the particle assembly taking place directly inside the plants. The experiments were performed to verify the necessity of presence of OAS sequence in process of initiation of viral encapsidation. The effect of the cell compartmentation on this process has also been studied. Based on several viral systems (the Tobacco mosaic virus, the Potato virus X, the Bean yellow dwarf virus and Cowpea mosaic virus) gene constructs were created. These constructs enables to study this idea at the molecular...

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Para que el proceso infeccioso de un virus de plantas tenga éxito la progenie viral tiene que propagarse desde las primeras células infectadas al resto de la planta; inicialmente se moverá célula a célula a través de los plasmodesmos (PDs) hasta alcanzar el sistema vascular, lo cual le permitirá invadir las partes distales de la planta. En este proceso, las proteínas de movimiento (MPs), junto con la colaboración de otros actores secundarios, desempeñan un papel relevante. El conocimiento de la posible asociación de las MPs con estructuras u orgánulos celulares así como de la interacción con factores del huésped es de vital importancia para poder desarrollar estrategias antivirales que permitan una mejora en la producción de los cultivos. Además, este tipo de estudios no sólo han posibilitado un mayor conocimiento de las respuestas al estrés en plantas sino que han sido pioneros en desentrañar los mecanismos de translocación intercelular de factores celulares implicados en los procesos de desarrollo de las plantas. Las MPs virales se clasifican en familias/grupos en función de su grado de similitud. Los virus, cuyas MPs pertenecen a la Superfamilia 30K, expresan una única MP encargada de orquestar el movimiento intra- e intercelular de genoma viral. En el Capítulo 1 de la presente Tesis se ha caracterizado la asociación de la MP del Virus del mosaico del tabaco (TMV), miembro tipo de la familia 30K, al sistema de endomembranas. Mediante el uso de aproximaciones in vivo se ha estudiado la eficiencia de inserción de sus regiones hidrofóbicas (HRs) en la membrana del retículo endoplasmático (ER). Nuestros resultados demuestran que ninguna de las dos HRs de la MP es capaz de atravesar las membranas biológicas y que la alteración de la hidrofobicidad de la primera HR es suficiente para modificar su asociación a la membrana. En base a los resultados obtenidos, proponemos un modelo topológico en el cual la MP del TMV se encontraría fuertemente asociada a la cara citosólica de la membrana del ER, sin llegar a atravesarla. La observación de que i), el modelo propuesto es compatible con otros motivos, previamente caracterizados, de la MP de TMV y ii), concuerda con la topología descrita para otras MPs de la familia 30K, permite cuestionar el modelo establecido desde el año 2000 para la MP de TMV así como predecir, en base a la conservada estructura secundaria de las MPs de esta familia, una topología similar para todos sus componentes. Para el transporte intercelular de los virus de plantas se han descrito tres modelos en base a la capacidad de transportar complejos ribonucloeprotéicos, a través de PD modificados, formados por el RNA viral y la MP (ej. MP de TMV) más la proteína de cubierta (ej. MP del virus del mosaico del pepino, CMV) o la capacidad de transportar viriones a través estructuras tubulares formadas por la MP (ej. MP del Virus del mosaico del caupí, CPMV). A pesar de las diferencias observadas entre los tres modelos, las MPs representativas de cada uno de ellos pertenecen a la misma familia 30K y son funcionalmente intercambiables (MPs de TMV, CMV, CPMV, Virus del mosaico del Bromo -BMV- o Virus de los anillos necróticos de los prunus -PNRSV-) por la MP del Virus del mosaico de la alfalfa (AMV), para el transporte a corta distancia. Con el objeto de comprender la versatilidad que presentan las MPs en cuanto al movimiento viral, hemos analizado la capacidad de estas MPs heterólogas de transportar sistémicamente el genoma quimérico del AMV. El estudio ha revelado que todas las MPs analizadas permiten el transporte del genoma quimera a las partes distales de la planta, independientemente del modelo descrito para el transporte a corta distancia, aunque requieren la extensión de los 44 aminoácidos C-terminales de la MP del AMV. Además, para todas las ellas, excepto para la MP del TMV, se ha establecido una relación entre la capacidad de movimiento local y la presencia del virus en las hojas no inoculadas de la planta, indicando la existencia de un umbral de transporte célula a célula, por debajo del cual, el virus es incapaz de invadir sistémicamente la planta. Durante el proceso de infección viral, las MPs interaccionan tanto con otras proteínas de origen viral como de la planta huésped. La interacción entre las MPs y dichos factores de la planta afectan a la patogénesis viral, facilitando u obstaculizando el movimiento intra- o intercelular del virus. En el Capítulo 3 del presente trabajo hemos demostrado la interacción entre la MP del AMV y dos miembros de la familia de Patellinas de arabidopsis, Patellin 3 (atPATL3) y Patellin 6 (atPATL6), mediante el sistema de los dos híbridos de levadura y ensayos de reconstitución bimolecular de la fluorescencia. Nuestros resultados, en general, demuestran que la interacción entre la MP-PATLs obstaculizaría un correcto direccionamiento de la MP al PD, dando lugar a un movimiento intracelular menos eficiente de los complejos virales, que forma la MP, y disminuyendo el movimiento célula a célula del virus. Podríamos estar hablando de un posible mecanismo de defensa de la planta, dirigido a evitar la invasión sistémica del huésped. En este sentido, las MPs virales pueden ser buenos candidatos para el desarrollo de estrategias antivirales dado que cualquier respuesta de defensa de la planta que, a priori, reduzca el transporte célula a célula del virus, puede representar la diferencia entre una infección local o sistémica, como hemos observado en el Capítulo 2 del presente trabajo. Los virus, a su vez, también son capaces de evolucionar hacia variantes más eficaces, que permitan superar las diferentes barreras defensivas de la planta huésped. En este contexto hemos identificado a la MP del Virus del bronceado del tomate (TSWV) como determinante de avirulencia en la resistencia mediada por el gen Sw-5. Del mismo modo, comprobamos que el cambio de 1-2 residuos de amino ácidos de la MP de TSWV fue suficiente para superar la resistencia pero que a la vez, y posiblemente debido a las altas restricciones que conlleva el reducido genoma de un virus, afectaron a la eficiencia de la MP. / Peiró Morell, A. (2014). Proteínas de movimiento de la familia 30K:interacción con membranas biológicas y factores proteicos y su implicación en el transporte viral [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48471 / TESIS