Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les progrès considérables effectués durant les trente dernières années permettent de guérir actuellement plus de 75% des enfants atteints d’un cancer. Néanmoins, certains types de tumeur, comme les gliomes de haut grade et les neuroblastomes métastatiques des enfants de plus de un an, gardent un pronostic particulièrement sombre. De nouvelles stratégies thérapeutiques doivent donc être développées dans ces indications. Dans cette optique, nous avons étudié les effets de deux nouvelles molécules ciblées, le cilengitide, inhibiteur des intégrines αvβ3 et αvβ5, et le F14512, inhibiteur de la topoisomérase II dont la délivrance est vectorisée via le système de transport des polyamines, sur des modèles précliniques de gliomes pédiatriques et de neuroblastomes.Nous avons montré pour la première fois l’existence d’une expression variable d’αvβ3 et αvβ5 dans nos modèles de lignées cellulaires pédiatriques, peu modifiée par les radiations ionisantes. Le traitement par cilengitide a entraîné une inhibition dose-dépendante de la croissance des cellules exprimant αvβ3, liée à un rapide détachement cellulaire et à une sensibilité à l’anoïkis. Cette inhibition de croissance et le détachement cellulaire n’étaient pas corrélés au niveau d’expression des intégrines αvβ3 et αvβ5. Néanmoins, nos travaux semblent montrer que la cible principale du cilengitide est l’intégrine αvβ3. Le traitement par radiations ionisantes n’a pas modifié le détachement induit par le cilengitide dans nos modèles.Nous avons également mis en évidence une activité du système de transport des polyamines dans nos modèles, permettant ainsi une incorporation active du F14512 dans nos cellules de neuroblastomes. Nous avons montré une supériorité de la cytotoxicité du F14512 par rapport à l’étoposide in vitro, et son effet antitumoral a été démontré sur un modèle in vivo. Ces résultats, ainsi que l’effet globalement synergique de l’association du F14512 avec les sels de platine, sont de solides arguments pour poursuivre le développement de cette molécule, en phase clinique chez les patients atteints d’un neuroblastome. Par ailleurs, d’autres investigations pourraient être envisagées dans d’autres types tumoraux dans lesquels l’étoposide occupe une place importante. L’effet radiosensibilisant du F14512 pourrait dans ce cadre ouvrir des perspectives dans la prise en charge des médulloblastomes.[...] / Despite the progress made during the past thirty years leading to cure about 75% of children with cancer, the prognosis of high-grade gliomas (HGG) in children and metastatic neuroblastoma remains poor. The aim of the thesis was to study in vitro the mechanisms of action of a novel inhibitor of αvβ3 and αvβ5 integrins, so-called cilengitide , and of a new topoisomerase II inhibitor targeting the polyamine transport system (PTS), so-called F14512, used as a single drug or in combination therapy in neuroblastoma and pediatric gliomas cell lines. Our panel of cell lines included three pediatric HGG, 2 low-grade pediatric glioma and four neuroblastoma cell lines as well as one adult HGG cell line. The first part of the work involved cilengitide, and was based on clinical and preclinical data previously obtained in adult glioblastoma. There was no data concerning the effect of cilengitide on pediatric HGG or neuroblastoma cells nor about its use in combination with radiation therapy in children. Similarly, no data were available about the level of expression of αvβ3 and αvβ5 integrins on the surface of glioma and pediatric neuroblastoma cells. We showed by flow cytometry significant and various αvβ3 and αvβ5 integrin expression levels in our four neuroblastomas and in most of glioma cell lines. Those expression levels were unrelated to tumor grade. UW479 cells expressed only αvβ5 integrin and therefore served as a negative control. Irradiation of glioma cells slightly increased αvβ3 expression in SF188, KNS42 and Res259 cell lines without inducing de novo integrin expression in UW479 cells. Cilengitide treatment resulted in a dose-dependent inhibition of cell growth leading to obtain an IC50 in the three cell lines tested. UW479 cells were not sensitive to Cilengitide, suggesting that Cilengitide’s action largely depends on αvβ3 inhibition. It was not possible to determine an IC50 value in the adult prototypical U87MG cell line.Cilengitide treatment resulted in a rapid and dose -dependent detachment of more than 50% of our cells expressing αvβ3 when cultured in adherent conditions on vitronectin, which is a specific matrix of integrins, whereas it remained without effect when the cells were grown on collagen, a nonspecific matrix. The growth inhibition induced by cilengitide was comparable to that observed when cells were seeded on polyHEMA gel in physically non-adherent conditions. Not surprisingly, the cilengitide induced no detachment of UW479 cells regardless of the matrix used. In contrast, cell viability assays showed a strong growth inhibition when these cells were seeded on polyHEMA gel. Interestingly, U87MG cells remained able to grow despite a strong detachment induced by cilengitide, suggesting a resistance to anoikis. Finally, inhibition of cell growth induced by cilengitide seemed only linked to cell detachment and corresponded to cell death by anoikis. These inhibitions of cell detachment and cell growth were not correlated with the levels of expression of integrins [...].

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Les R-loops générés durant la transcription sont impliqués dans de nombreuse fonctions incluant la réplication, la recombinaison et l’expression génique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs études ont montré qu’un excès de supertours négatifs et des séquences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu’à maintenant, nos résultats nous ont permis d’établir un lien direct entre les topoisomérases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rôle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une étude détaillée du double mutant topA rnhA a montré qu’une déplétion de RNase HI induit une réponse cellulaire qui empêche la gyrase d’introduire des supertours. Il s’agit ici, de la plus forte évidence supportant les rôles majeurs de la RNase HI dans la régulation du surenroulement de l’ADN. Nos résultats ont également montré que les R-loops pouvaient inhiber l’expression génique. Cependant, les mécanismes exacts sont encore mal connus. L’accumulation d’ARNs courts au détriment d’ARNs pleine longueur peut être causée soit par des blocages durant l’élongation de la transcription soit par la dégradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxième article, nous montrons que l’hypersurenroulement négatif peut mener à la formation de R-loops non-spécifiques (indépendants de la séquence nucléotidique). La présence de ces derniers, engendre une dégradation massive des ARNs et ultimement à la formation de protéines tronquées. En conclusion, ces études montrent l’évidence d’un lien étroit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de l’ADN et l’expression génique. De plus, elles attestent de la présence d’un nouvel inhibiteur de gyrase ou d’un mécanisme encore inconnu capable de réguler son activité. Cette surprenante découverte est élémentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces études pourront servir également de base à des recherches similaires chez les cellules eucaryotes. / R-loops generated during transcription elongation are implicated in many DNA reactions, including replication, recombination and gene expression both in prokaryotes and in eukaryotes. Many studies have shown that negative supercoils excess and G-rich sequences induce the formation of R-loops. Up to now, our results allow us to establish a direct link between topoisomerases, supercoiling level, and the formation of R-loops. However, what the physiological significance, if any, of R-loops is still largely unknown. In the first article, a detailed study on double topA rnhA mutants showed that the depletion of RNase HI activity induces a cellular response which renders gyrase unable to perform supercoils. This is the first evidence implicating RNase HI as a major player in DNA supercoiling regulation. Our results also show that R-loops formation can lead to the inhibition of gene expression. However, the exact mechanism(s) leading to the inhibition of gene expression are not yet understood. The accumulation of shorter than full length RNAs could be caused by road-blocks during transcription elongation or by the degradation of full length RNAs. In the second article, we show that hypernegative supercoiling can lead to sequence independent R-loop formation. The physiological consequence is extensive RNA degradation which ultimately culminates in the formation of truncated proteins. In conclusion, this study clearly shows a close link between RNase HI activity, R-loop formation, DNA topology and gene expression. In addition, this study also provides some evidence for the synthesis of a gyrase inhibitor that can regulate gyrase activity directly or indirectly via unidentified mechanisms. This surprising observation is still preliminary taking into consideration that many antibiotics target gyrase. Finally results from this study could open up avenues for research in eukaryotes.

Les R-loops générés durant la transcription sont impliqués dans de nombreuse fonctions incluant la réplication, la recombinaison et l’expression génique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs études ont montré qu’un excès de supertours négatifs et des séquences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu’à maintenant, nos résultats nous ont permis d’établir un lien direct entre les topoisomérases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rôle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une étude détaillée du double mutant topA rnhA a montré qu’une déplétion de RNase HI induit une réponse cellulaire qui empêche la gyrase d’introduire des supertours. Il s’agit ici, de la plus forte évidence supportant les rôles majeurs de la RNase HI dans la régulation du surenroulement de l’ADN. Nos résultats ont également montré que les R-loops pouvaient inhiber l’expression génique. Cependant, les mécanismes exacts sont encore mal connus. L’accumulation d’ARNs courts au détriment d’ARNs pleine longueur peut être causée soit par des blocages durant l’élongation de la transcription soit par la dégradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxième article, nous montrons que l’hypersurenroulement négatif peut mener à la formation de R-loops non-spécifiques (indépendants de la séquence nucléotidique). La présence de ces derniers, engendre une dégradation massive des ARNs et ultimement à la formation de protéines tronquées. En conclusion, ces études montrent l’évidence d’un lien étroit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de l’ADN et l’expression génique. De plus, elles attestent de la présence d’un nouvel inhibiteur de gyrase ou d’un mécanisme encore inconnu capable de réguler son activité. Cette surprenante découverte est élémentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces études pourront servir également de base à des recherches similaires chez les cellules eucaryotes. / R-loops generated during transcription elongation are implicated in many DNA reactions, including replication, recombination and gene expression both in prokaryotes and in eukaryotes. Many studies have shown that negative supercoils excess and G-rich sequences induce the formation of R-loops. Up to now, our results allow us to establish a direct link between topoisomerases, supercoiling level, and the formation of R-loops. However, what the physiological significance, if any, of R-loops is still largely unknown. In the first article, a detailed study on double topA rnhA mutants showed that the depletion of RNase HI activity induces a cellular response which renders gyrase unable to perform supercoils. This is the first evidence implicating RNase HI as a major player in DNA supercoiling regulation. Our results also show that R-loops formation can lead to the inhibition of gene expression. However, the exact mechanism(s) leading to the inhibition of gene expression are not yet understood. The accumulation of shorter than full length RNAs could be caused by road-blocks during transcription elongation or by the degradation of full length RNAs. In the second article, we show that hypernegative supercoiling can lead to sequence independent R-loop formation. The physiological consequence is extensive RNA degradation which ultimately culminates in the formation of truncated proteins. In conclusion, this study clearly shows a close link between RNase HI activity, R-loop formation, DNA topology and gene expression. In addition, this study also provides some evidence for the synthesis of a gyrase inhibitor that can regulate gyrase activity directly or indirectly via unidentified mechanisms. This surprising observation is still preliminary taking into consideration that many antibiotics target gyrase. Finally results from this study could open up avenues for research in eukaryotes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans les cellules somatiques, les télomères s'érodent à chaque division cellulaire. Ce processus appelé « Sénescence Réplicative» est contrebalancé de manière basale chez la levure bourgeonnante S. cerevisiae par l'action de la télomérase qui, alors qu'elle est inactive dans les cellules somatiques des eucaryotes supérieures, est activée dans 85% des cancers. Un autre mécanisme impliqué dans les 15% des cas de cancer restants et est appelé Alternative Lengthening of Telomere (ALT). Dans ce processus, le maintien des télomères est assuré par des mécanismes de recombinaison télomérique induisant des échanges de séquences télomériques de chromatides sœurs (T-SCE).Nous avons évalué l'existence d'ALT dans la LLC-B connue pour rarement exprimer la télomérase. Nous avons montrer que 90% des patients LLC-B présentent une diminution de l'expression de TopoIIIα corrélée à une méthylation plus importante des îlots CpG de la région promotrice du gène suggérant que dans les LLC-B le maintien des télomères est défectueux.Nous avons étudié l'implication de la SUMOylation de TopoIIIα/Top3 dans les mécanismes de régulation du ALT. Nous avons montré que TopoIIIα était SUMOylée in vitro et in vivo au sein des cellules U2-OS ALT. Nous avons aussi observé chez S. cerevisiae que Top3 ne serait SUMOylée qu'en absence d'une activité télomérase. Nos résultats suggèrent que la SUMOylation de TopoIIIα augmenterait son activité in vitro et in vivo en diminuant son affinité pour les télomères une fois la recombinaison achevée et qu'elle serait requise pour son accumulation dans les APBs mais pas pour leur formation. / In somatic cells, telomeres erode with each cell division. This process named « Replicative Senescence » is basically counterbalanced in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by the action of telomerase which, while it is inactive in somatic cells of higher eukaryotes is activated in 85 % of cancer cases. Another process of telomere maintenance is involved in 15% of remaining cancer cases and is called Alternative Lengthening of Telomere (ALT). In this process, telomere maintenance is provided by telomeric recombination mechanisms inducing exchange of telomeric sister chromatid (T-SCE).We assessed the existence of an ALT mechanism in B-CLL known to rarely express telomerase. We have shown that 90% of B-CLL patients have a decreased expression of TopoIIIα correlated with largest methylation of CpG islands of the gene promoter region. Our results suggest that in B-CLL, telomere maintenance is defective either by telomerase or ALT mechanism.We investigated the involvement of post- SUMOylation of TopoIIIα/Top3 in mechanisms regulating ALT phenomenon. We have shown that TopoIIIα was SUMOylated in vitro and in vivo in U2-OS ALT cells. We also observed in S. cerevisiae that Top3p might be SUMOylated in absence of telomerase activity. Our results suggested that the SUMOylation of TopoIIIα increased its activity in vitro and in vivo by reducing its affinity for telomeres once recombination occurred and would be required for its accumulation in APBs but not for their formation.

Chez les plantes, les stress biotiques et abiotiques causent la surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les chloroplastes et les mitochondries. Ces ROS provoquent des dommages parfois irrémédiables pour la cellule ou déclenchent des voies de signalisation rétrogrades qui induisent la tolérance au stress. En parallèle, le génome nucléaire contrôle le développement et l’activité des organites grâce à la signalisation antérograde. Dans ce contexte, le complexe nucléaire Topoisomérase VI (Topo VI) a été étudié chez Arabidopsis thaliana. Topo VI est un régulateur des gènes de réponse à la signalisation rétrograde de la ROS oxygène singulet ; toutefois, les mécanismes qui régissent cette régulation sont inconnus. Afin de les déterminer, des interacteurs de la Topo VI ont été mis en évidence dont la sous-unité alpha du facteur général de transcription TFIIF (TFIIFα). Après caractérisation de l’expression du gène TFIIFα et des isoformes protéiques codées, des analyses transcriptomiques réalisées en condition standard de croissance et en condition de stress photo-oxydant ont montré que Topo VI et TFIIFα co-régulent la majorité des gènes de réponse à ce stress. De plus, ces interacteurs ont un rôle opposé dans la régulation de l’expression de gènes « PentatricoPeptide Repeat » (PPR). Les protéines PPR sont adressées aux chloroplastes et aux mitochondries dans lesquels elles participent à la régulation post-transcriptionnelle ; chez des mutants tfIIfα, des gènes PPR impliquées dans l’édition des ARN sont réprimés et l’édition de sites cibles associés est parfois altérée. Les conséquences de ces altérations sont discutées par l’analyse de fonctions chloroplastiques. / Under biotic and abiotic stress, plants overproduce reactive oxygen species (ROS) in plastids and mitochondria. ROS can cause damages sometimes definitive for cells or trigger retrograde signalling pathways to the nucleus that provide stress tolerance. Concurrently, the nuclear genome controls the development and the activity of organelles through anterograde signalling. In this context, the nuclear complex Topoisomerase VI (Topo VI) is studied in Arabidopsis thaliana. Topo VI is a regulator of stress responsive genes in the retrograde signalling triggered by the singlet oxygen ROS; nevertheless, the mechanisms controlling this regulation are still unknown. To determine them, Topo VI interactors were found out, including the alpha subunit of the general transcription factor TFIIF (TFIIFα). TFIIFα gene expression and the encoded protein isoforms were first characterized and then, transcriptomic analysis in standard growth conditions and under photo-oxidative stress showed that Topo VI and TFIIFα co-regulate most of stress responsive genes. Moreover, these interactors have an opposite role in the expression of "PentatricoPeptide Repeat" (PPR) genes. PPR proteins are targeted to plastids or mitochondria in which they contribute to post-transcriptional regulation mechanisms; in tfIIfα mutants, PPR genes involved in organellar RNA editing are down-regulated, and the editing of associated target sites was sometimes impaired. Possible consequences of this impairment were discussed through the analysis of plastidial functions.