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Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2004. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 100-109).

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Characterization of the polyoma virus chromosome as a circular, double-stranded, supercoiled DNA (Weil and Vinograd, 1963; Vinograd et al.,-1965) made it apparent that the DNA enzymatic machinery faces a formidable problem in ensuring faithful replication of genetic material. These studies initiated a search for enzymatic activities that are capable of overcoming this topological barrier and led to the discovery of DNA topoisomerase I, originally denoted as omega protein (Wang, 1971), followed by DNA gyrase (Gellert et al., 1976) from Escherichia coli. It is now established that Escherichia coli encodes four distinct topoisornerases. These include topoisomerase I (topA) (Wang, 1971), topoisomerase II (gyrA and gyrB) (Gellert et al., 1976), topoisomerase III (topB) (DiGate and Marians, 1988) and topoisomerase IV (parC and parE) (Kato et al, 1990; 1992). These enzymes perform various non-overlapping functions in vivo (reviewed in Roca, 1995). Additionally, a 'reverse gyrase", capable of introducing positive supercoils into DNA, in an ATP dependent manner, has been characterized from hyperthermophiles (Kikuchi and Asai, 1984; Kozyavkin et al., 1994).

O ditelureto difenila (DTDF) é um protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Estudos prévios caracterizaram o efeito citotóxico dessa molécula em fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) mas os mecanismos relacionados à redução da viabilidade pelo DTDF são pouco conhecidos. Portanto, neste trabalho foi investigado o tipo de morte celular provocada pelo DTDF, sua influência no ciclo celular e sua possível interação com enzimas topoisomerases empregando células V79 e a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelos biológicos de estudo. Conforme esperado, houve redução da viabilidade celular após o tratamento DTDF observada pelo ensaio MTT. A análise morfológica por coloração diferencial mostrou ocorrência de células apoptóticas e necróticas. Um aumento da atividade da enzima caspase 3/7 confirma a indução de apoptose pelo DTDF. Foi observada parada na progressão do ciclo celular na fase S e em sub-G1. A interação com topoisomerases foi verificada pelo teste de micronúcleo (MN) em células V79 onde foi verificado um possível potencial intercalante do DPDT. Linhagens de levedura deficientes em Top1p apresentaram maior tolerância ao DTDF em relação à linhagem selvagem, sugerindo que a interação com a enzima pode estar envolvida na toxicidade do DTDF. A sensibilidade ao DTDF encontrada na linhagem top3Δ indica que Top3p pode participar na reparação das lesões do DNA induzidas por este composto. Os nossos resultados sugerem que a diminuição da viabilidade celular pode ser atribuída à interação do DTDF com enzimas topoisomerases, levando a formação de quebras no DNA com consequente parada no ciclo celular e morte celular por apoptose/necrose. / The diphenyl ditelluride (DPDT) is a prototype for the development of new biologically active molecules. In previous studies, this organotelluride has shown an elevated cytotoxicity in lung fibroblast cell line derived from Chinese hamster (V79 cells), but the mechanisms for reduction of cell viability still remain unknown. Therefore, in this study we investigate the type of cell death induced by DPDT, the influence on cell cycle and its possible interaction with topoisomerase enzymes using V79 cells and the Saccharomyces cerevisiae yeast as biological models of study. As expected, there was a reduction in cell viability after DPDT treatment observed by MTT assay. Morphological analysis showed significant elevation in apoptotic and necrotic cells. An increase of caspase 3/7 activity confirms the apoptosis induction by DPDT. The arrest in the progression of the cell cycle in S phase and in sub-G1 was observed. The interaction with DNA topoisomerases was verified by the micronucleus test (MN) in V79 cells, which showed a possible intercalating potential of DPDT. Yeast strain deficient in Top1p showed higher tolerance to DPDT in relation to the wild type isogenic strain, suggesting that the interaction with this enzyme could be involved in the toxicity of DPDT. The sensitivity to DPDT found in top3Δ strain indicates that Top3p could participate in the repair of DNA lesions induced by this compound. Our results suggest that the decrease in cell viability can be attributed to interaction of DPDT with topoisomerases enzymes, leading to formation of DNA breakage and consequent cell cycle arrest and cell death by apoptosis / necrosis.

O ditelureto difenila (DTDF) é um protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Estudos prévios caracterizaram o efeito citotóxico dessa molécula em fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) mas os mecanismos relacionados à redução da viabilidade pelo DTDF são pouco conhecidos. Portanto, neste trabalho foi investigado o tipo de morte celular provocada pelo DTDF, sua influência no ciclo celular e sua possível interação com enzimas topoisomerases empregando células V79 e a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelos biológicos de estudo. Conforme esperado, houve redução da viabilidade celular após o tratamento DTDF observada pelo ensaio MTT. A análise morfológica por coloração diferencial mostrou ocorrência de células apoptóticas e necróticas. Um aumento da atividade da enzima caspase 3/7 confirma a indução de apoptose pelo DTDF. Foi observada parada na progressão do ciclo celular na fase S e em sub-G1. A interação com topoisomerases foi verificada pelo teste de micronúcleo (MN) em células V79 onde foi verificado um possível potencial intercalante do DPDT. Linhagens de levedura deficientes em Top1p apresentaram maior tolerância ao DTDF em relação à linhagem selvagem, sugerindo que a interação com a enzima pode estar envolvida na toxicidade do DTDF. A sensibilidade ao DTDF encontrada na linhagem top3Δ indica que Top3p pode participar na reparação das lesões do DNA induzidas por este composto. Os nossos resultados sugerem que a diminuição da viabilidade celular pode ser atribuída à interação do DTDF com enzimas topoisomerases, levando a formação de quebras no DNA com consequente parada no ciclo celular e morte celular por apoptose/necrose. / The diphenyl ditelluride (DPDT) is a prototype for the development of new biologically active molecules. In previous studies, this organotelluride has shown an elevated cytotoxicity in lung fibroblast cell line derived from Chinese hamster (V79 cells), but the mechanisms for reduction of cell viability still remain unknown. Therefore, in this study we investigate the type of cell death induced by DPDT, the influence on cell cycle and its possible interaction with topoisomerase enzymes using V79 cells and the Saccharomyces cerevisiae yeast as biological models of study. As expected, there was a reduction in cell viability after DPDT treatment observed by MTT assay. Morphological analysis showed significant elevation in apoptotic and necrotic cells. An increase of caspase 3/7 activity confirms the apoptosis induction by DPDT. The arrest in the progression of the cell cycle in S phase and in sub-G1 was observed. The interaction with DNA topoisomerases was verified by the micronucleus test (MN) in V79 cells, which showed a possible intercalating potential of DPDT. Yeast strain deficient in Top1p showed higher tolerance to DPDT in relation to the wild type isogenic strain, suggesting that the interaction with this enzyme could be involved in the toxicity of DPDT. The sensitivity to DPDT found in top3Δ strain indicates that Top3p could participate in the repair of DNA lesions induced by this compound. Our results suggest that the decrease in cell viability can be attributed to interaction of DPDT with topoisomerases enzymes, leading to formation of DNA breakage and consequent cell cycle arrest and cell death by apoptosis / necrosis.

O ditelureto difenila (DTDF) é um protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Estudos prévios caracterizaram o efeito citotóxico dessa molécula em fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) mas os mecanismos relacionados à redução da viabilidade pelo DTDF são pouco conhecidos. Portanto, neste trabalho foi investigado o tipo de morte celular provocada pelo DTDF, sua influência no ciclo celular e sua possível interação com enzimas topoisomerases empregando células V79 e a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelos biológicos de estudo. Conforme esperado, houve redução da viabilidade celular após o tratamento DTDF observada pelo ensaio MTT. A análise morfológica por coloração diferencial mostrou ocorrência de células apoptóticas e necróticas. Um aumento da atividade da enzima caspase 3/7 confirma a indução de apoptose pelo DTDF. Foi observada parada na progressão do ciclo celular na fase S e em sub-G1. A interação com topoisomerases foi verificada pelo teste de micronúcleo (MN) em células V79 onde foi verificado um possível potencial intercalante do DPDT. Linhagens de levedura deficientes em Top1p apresentaram maior tolerância ao DTDF em relação à linhagem selvagem, sugerindo que a interação com a enzima pode estar envolvida na toxicidade do DTDF. A sensibilidade ao DTDF encontrada na linhagem top3Δ indica que Top3p pode participar na reparação das lesões do DNA induzidas por este composto. Os nossos resultados sugerem que a diminuição da viabilidade celular pode ser atribuída à interação do DTDF com enzimas topoisomerases, levando a formação de quebras no DNA com consequente parada no ciclo celular e morte celular por apoptose/necrose. / The diphenyl ditelluride (DPDT) is a prototype for the development of new biologically active molecules. In previous studies, this organotelluride has shown an elevated cytotoxicity in lung fibroblast cell line derived from Chinese hamster (V79 cells), but the mechanisms for reduction of cell viability still remain unknown. Therefore, in this study we investigate the type of cell death induced by DPDT, the influence on cell cycle and its possible interaction with topoisomerase enzymes using V79 cells and the Saccharomyces cerevisiae yeast as biological models of study. As expected, there was a reduction in cell viability after DPDT treatment observed by MTT assay. Morphological analysis showed significant elevation in apoptotic and necrotic cells. An increase of caspase 3/7 activity confirms the apoptosis induction by DPDT. The arrest in the progression of the cell cycle in S phase and in sub-G1 was observed. The interaction with DNA topoisomerases was verified by the micronucleus test (MN) in V79 cells, which showed a possible intercalating potential of DPDT. Yeast strain deficient in Top1p showed higher tolerance to DPDT in relation to the wild type isogenic strain, suggesting that the interaction with this enzyme could be involved in the toxicity of DPDT. The sensitivity to DPDT found in top3Δ strain indicates that Top3p could participate in the repair of DNA lesions induced by this compound. Our results suggest that the decrease in cell viability can be attributed to interaction of DPDT with topoisomerases enzymes, leading to formation of DNA breakage and consequent cell cycle arrest and cell death by apoptosis / necrosis.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-01T17:14:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Sybelle Christianne Batista de Lacerda Pedrosa.pdf: 5176774 bytes, checksum: 1019c1cbbdc608acf7ad6992d2a65e8e (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-02T18:30:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Sybelle Christianne Batista de Lacerda Pedrosa.pdf: 5176774 bytes, checksum: 1019c1cbbdc608acf7ad6992d2a65e8e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T18:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Sybelle Christianne Batista de Lacerda Pedrosa.pdf: 5176774 bytes, checksum: 1019c1cbbdc608acf7ad6992d2a65e8e (MD5) Previous issue date: 2017-05-30 / O câncer é caracterizado por crescimento celular descontrolado e capacidade de migração celular do local de origem para outros órgãos, o que pode resultar em morte. Apesar dos avanços na compreensão dos mecanismos envolvidos nesta patologia e os progressos realizados na terapêutica do câncer, a toxicidade e a resistência aos fármacos tradicionais ainda constituem um grande desafio no tratamento do câncer. Assim, torna-se relevante o desenvolvimento de novos fármacos e pesquisas por novos alvos terapêuticos buscando obter êxito na terapia do câncer. Nesta perspectiva, este trabalho propôs a síntese de dezesseis compostos indólicos-tiossemicarbazonas e a partir destes foram realizadas reações de ciclização obtendo-se dez derivados 4-tiazolidinonas. Além disso, foi verificada a atividade antiproliferativa in vitro, analisada a capacidade de interação com o DNA, avaliada a atividade inibitória topoisomerase IIα e verificada a capacidade de induzir a morte celular na linhagem tumoral mais sensível do ensaio antiproliferativo. As moléculas foram obtidas através de rotas sintéticas eficazes, rendimentos satisfatórios e ponto de fusão na faixa de pureza. Todas as estruturas foram caracterizadas e comprovadas por espectrometria de massas (MS), infravermelho (IV), metódos espectroscópicos unidimensionais de RMN ¹H e RMN ¹³C, e técnicas espectroscópicas bidimensionais, como COSY ¹H-¹H, HSQC ¹H-¹³C e NOESY. Os compostos indólicos-tiossemicarbazonas foram testados quanto à atividade antitumoral in vitro, por meio de ensaio antiproliferativo Sulforrodamina B frente às linhagens de células tumorais de mama (MCF-7), ovário (OVCAR-03), ovário resistente a múltiplas drogas (NCI-ADR/RES), pulmão (NCI-H460), cólon (HT-29), rim (786-0), leucemia (K-562) e glioma (U-251). Neste teste, o composto LqIT/LT-51 mostrou-se o mais ativo da série, destacando se frente às linhagens HT-29 e K-562 com valores de GI₅₀ (concentração molar do composto que inibe 50% do crescimento celular) = 0.01 μM, para ambas as linhagens. Com isso, o derivado LqIT/LT-51 foi conduzido para análise da interação com o DNA por meio da espectroscopia de absorção e emissão da fluorescência. O LqIT/LT-51 mostrou alterações em suas propriedades espectroscópicas após a ligação com DNA, apresentando efeito hipercrômico e sugerindo mudanças na conformação da estrutura do DNA. A constante de ligação (Kb) calculada foi 4.30 x 10⁴. A supressão da fluorescência (Ksv) apresentou o valor de 1.19 x 10³ M¹, indicando afinidade pelos pares de base do DNA. A atividade de LqIT/LT-51 como inibidor topoisomerase IIα foi visualizada nas concentrações de 50 e 100 μM, e ambas as concentrações produziram inibição enzimática parcial. Na análise da indução da morte celular, o LqIT/LT-51 induziu a morte celular, possivelmente apoptótica nas células de HT-29 de forma concentração-dependente e promoveu a parada do ciclo na fase G2/M. Estes resultados mostraram que o núcleo indol, a tiossemicarbazona e o grupo 1-naftil são promissores scaffolds para o desenvolvimento de novos fármacos com potencial capacidade de atuar em múltiplos alvos terapêuticos do câncer. / Cancer is characterized by uncontrolled cell growth and the ability of cell migration from the place of origin to other organs, which can result in death. Despite advances in understanding the mechanisms involved in this disease and the progress achieved in cancer therapy, the toxicity and the resistance to the traditional drugs still constitutes a major challenge in the treatment of cancer. Thus, it is relevant the development of new drugs and researches for new therapeutic targets to achieve success in cancer therapy. In this perspective, this work proposed the synthesis of sixteen indole-thiosemicarbazone compounds and from these cyclic reactions were performed, obtaining ten derivatives presenting the 4-thiazolidinone. In addition, was to verified the in vitro antiproliferative activity, analyzed the capacity of interaction with the DNA, evaluated the topoisomerase IIα inhibition activity and was verified the ability to induce cell death in the most sensitive tumor line of the antiproliferative assay. The molecules were obtained by efficient synthetic routes, satisfactory yields and melting point in the purity range. All the structures obtained were characterized by mass spectrometry (MS), infrared (IR), one-dimensional spectroscopic methods of NMR ¹H and NMR ¹³C, and two-dimensional spectroscopic techniques such as COSY ¹H-¹H, HSQC ¹H-¹³C and NOESY. The indole-thiosemicarbazones compounds were tested for in vitro antitumor activity by antiproliferative assay Sulforrodamine B against breast cancer cell lines (MCF-7), ovary (OVCAR-03), multiple drug resistant ovary (NCI-ADR /RES), lung (NCI-H460), colon (HT-29), kidney (786-0), leukemia (K-562) and glioma (U-251). In this test, the compound LqIT/LT-51 proved to be the most active in the series, highlighting against cell lines HT-29 and K-562 with GI₅₀ (Molar concentration of compound which inhibits 50% of cell growth) values = 0.01 μM for both strains. Thus, the LqIT/LT-51 derivative was conducted for DNA binding analysis by fluorescence absorption and emission spectroscopy. The LqIT/LT-51 presented changes in its spectroscopic properties after interaction with DNA, showing hyperchromic effect, suggesting changes in DNA structure. The calculated binding constant (Kb) was 4.30 x 10⁴. Fluorescence suppression (Ksv) showed the value of 1.19 x 10³ M⁻¹, indicating affinity for DNA base pairs. The activity of LqIT/LT-51 as topoisomerase II inhibitor was visualized at the concentration of 50 and 100 μM, and both concentrations induced partial enzyme inhibition. The LqIT/LT-51 induced cell death in HT-29 cells in concentration-dependent way possibly through apoptosis and also promoted cell cycle arrest in G2/M phases. These results showed that the indole nucleus, the thiosemicarbazone and the 1-naphthyl group are promising scaffolds for the development of new drugs with potential ability to act in multiple therapeutic targets for cancer.

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Doenças tropicais negligenciadas compartilham características que permitem que elas persistam nas condições de pobreza, onde se aglomeram e se sobrepõe frequentemente. Mais de um bilhão de pessoas sofrem de uma ou mais doenças tropicais negligenciadas. Entre estas está a doença de Chagas, resultante da infecção pelo protozoário parasito hemoflagelado Trypanosoma cruzi, tendo insetos triatomíneos como vetores. Topoisomerases são enzimas envolvidas na regulação do superespiralamento do DNA resolvendo problemas topológicos associados com replicação, transcrição, recombinação e reparo. As topoisomerases do tipo II são essenciais para tripanossomatídeos por atuarem na replicação e organização do DNA contido em uma região especializada da mitocôndria denominada cinetoplasto. O estudo da Topoisomerase II Mitocondrial (TcTopoIImit) foi realizado através de análises sequenciais e estruturais de outras topoisomerases para a determinação de construções para a clonagem. As construções para o domínio N-terminal foram clonadas no vetor pTZ57R/T e subclonadas em vetores do sistema pET para expressão proteica em E. coli. Experimentos de expressão foram realizados em diferentes cepas, vetores, soluções tampão e outros parâmetros variáveis visando a obtenção dos produtos recombinantes na forma solúvel, porém, tais resultados não foram obtidos. A flavoproteína Old Yellow Enzyme de Trypanosoma cruzi (TcOYE) é uma oxidoredutase que usa NAD(P)H como cofator. Esta enzima é clinicamente relevante devido ao seu papel no mecanismo de ação de alguns agentes tripanocidas, utilizados no tratamento da doença de Chagas, por produzirem espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho, a enzima recombinante TcOYE foi produzida, purificada, cristalizada pelo método de difusão de vapor e sua estrutura cristalográfica, resolvida por substituição molecular e refinada. A TcOYE foi cristalizada nas formas cristalinas P212121 e P21 e os dados de difração foram coletados para o máximo de resolução de 1,27 e 2,00 Å, respectivamente. As coordenadas atômicas e fatores de estrutura das estruturas da TcOYE nas formas cristalinas P212121 e P21 foram depositados no Banco de Dados de Proteínas com os códigos de acesso 4E2B e 4E2D, respectivamente. A TcOYE apresenta um enovelamento canônico em um barril (α/β)8 com o grupo prostético localizado na cavidade maior do sítio ativo. Após a obtenção dos modelos cristalográficos análises sequenciais e estruturais foram realizadas para a TcOYE e outras OYEs. A região 141-156 do subdomínio capping em TcOYE, assim como em outras OYEs, é intrinsecamente desestruturada exibindo altos valores de fatores B. A região mais divergente entre as OYEs é o loop estendido (289-297), que pode variar em comprimento e composição mudando o volume e a acessibilidade ao sítio ativo. / Neglected tropical diseases share features that allow them to persist in conditions of poverty, which clump together and frequently overlap. More than 1 billion people suffer from one or more neglected tropical diseases. Among them is the Chagas disease is an important parasitic disease resulting from infection by the flagellate protozoan parasite Trypanosoma cruzi, with triatomine insects as vectors. Topoisomerases are ubiquitous enzymes involved in the regulation of DNA supercoiling and overcoming topological barriers during replication, transcription, recombination and repair. The type II topoisomerases are essential for trypanosomatids since, in addition to their role in nuclear DNA metabolism, these enzymes might also play an important role in the replication and organization of the DNA contained in the specialized region of the mitochondrion known as the kinetoplast. The study of Mitochondrial Topoisomerase II from T. cruzi (TcTopoIImit) was performed by sequence and structural analyses into topos members for determination of domains constructions for cloning. Constructions for the N-domain were then cloned in pTZ57R/T vector and subcloned into pET system vectors for protein expression in E. coli. The protein expression experiments were performed by different strain cells, vectors, buffers solutions and others adjustable parameters for improve the solubility but recombinant products in soluble form were not obtained. The flavoprotein Old Yellow Enzyme from Trypanosoma cruzi (TcOYE) is an oxidoreductase that uses NAD(P)H as cofactor. This enzyme is clinically relevant due to its role in the action mechanism of some trypanocidal drugs used in the treatment of Chagas disease by producing reactive oxygen species. In this work, the recombinant enzyme TcOYE was produced, purified, crystallized by the vapour diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. TcOYE was crystallized in two crystalline forms, P212121 and P21 and diffraction data were collected to a maximum resolution of 1.27 and 2.00 Å, respectively. The atomic coordinates and structure factors of the TcOYE structure in P212121 and P21 crystalline forms have been deposited in the Protein Data Bank with the accession codes 4E2B and 4E2D, respectively. TcOYE displays a canonical (α/β)8-barrel fold with a FMN prosthetic group located at the large active-site cavity. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for TcOYE and others OYEs. The region 141-156 of the capping subdomain in TcOYE as well as in others OYEs is intrinsically flexible exhibiting high B-factor values. The most divergent region among these OYEs is the extended loop (289-297), which can vary in length and composition changing the volume and accessibility to the active site.