La résistance acquise aux traitements anticancéreux représente un problème clinique majeur. Les voies de réparation de l'ADN fournissent un mécanisme de résistance, mais celle-ci peut aussi résulter de mutations ou d'une expression réduite de la protéine ciblée. La surexpression ou la localisation nucléaire de la Y-Box binding (YB-1) protéine est considérée comme un marqueur pronostique de chimiorésistance de la tumeur. YB-1 interagit avec plusieurs partenaires ; dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur son interaction avec l'enzyme de réparation de l'ADN NTH1 (hNTH1) et l'ADN topoisomérase I (hTopoI), deux enzymes stimulées par YB-1. L'abondance du complexe hNTH1/YB-1 est accrue dans les cellules tumorales résistantes au cisplatine. La TopoI humaine est une enzyme essentielle impliquée dans la régulation cellulaire du surenroulement de l'ADN et est la cible de plusieurs agents anticancéreux. YB-1 augmente la sensibilité à l'inhibiteur de TopoI, la camptothécine, dans les tumeurs. Nous avons caractérisé les complexes YB-1/hNTH1 et YB-1/hTopoI in vitro et in vivo en utilisant des mesures de transfert d'énergie par résonance en fluorescence (ou FRET) pour identifier et développer de nouvelles stratégies pour le traitement de tumeurs chimio-résistantes. Nous avons développé et optimisé un biosenseur original basé sur le FRET pour cribler deux chimiothèques de taille moyenne afin d’identifier des inhibiteurs potentiels du complexe hNTH1/YB-1. Plusieurs «hits» ont été identifiés qui réduisent de façon significative le niveau de FRET de notre biosenseur. Pour certains de ces composés, nous avons reproduit ces résultats à partir de poudres, effectué des courbes dose-réponse et validé leurs actions en tant qu'inhibiteurs de l'interface hNTH1/YB-1 en utilisant d'autres tests d’interactions. Ensemble nos résultats démontrent que YB-1 interagit directement et stimule des enzymes de la réparation de l'ADN et du relaxation de l’ADN, et que cibler l’interface YB-1/hNTH1 représente une nouvelle stratégie intéressante pour le développement de traitements anticancéreux. / Acquired resistance to anti-cancer therapy is common and is a major clinical issue. Functional DNA repair pathways provide a common mechanism for drug resistance, but it can also result from mutations or reduced expression of the targeted protein. The overexpression or nuclear localisation of the multifunctional Y-box binding protein (YB-1) is considered as a prognostic marker for drug resistance in tumours. YB-1 has several interaction partners in cells; in this study, we have focused on its interaction with the human DNA repair enzyme NTH1 (hNTH1) and human DNA topoisomerase I (hTopoI), two enzymes that have been shown to be stimulated by YB-1. The abundance of the hNTH1/YB-1 complex was shown to increase in cisplatin-resistant tumour cells. Human TopoI is an essential enzyme involved in cellular regulation of DNA supercoiling and is the target of several anti-cancer agents. YB-1 enhances the activity of hTopoI and its sensitivity to hTopoI inhibitor, camptothecin in tumour cells. We have characterised the YB-1/hNTH1 and YB-1/hTopoI complexes in vitro and in vivo using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements to identify and develop new strategies for the treatment of drug-resistant tumours. We also designed and optimised an original FRET-based biosensor to screen two medium-sized chemical libraries in order to find potential inhibitors of the hNTH1/YB-1 complex. Several “hits” were identified that significantly reduced the FRET level of our biosensor. For some of these compounds, we have reproduced these results starting from powders, have performed dose-response curves and have validated their actions as inhibitors of the hNTH1/YB-1 interface using alternative binding assays. Taken together, our results demonstrate that YB-1 directly interacts and stimulates a DNA repair and a DNA relaxing enzyme and targeting the YB-1/hNTH1 interface represents an interesting new strategy for the development of anti-cancer drugs.

Le protozoaire Leishmania est à l’origine d’une maladie tropicale négligée qui peut s’avérer mortelle si elle n’est pas traitée adéquatement. Dans les dernières années, l’efficacité des médicaments utilisés dans le combat de la leishmaniose a grandement diminué en raison de la résistance du parasite à ceux-ci. Bien que le Topotecan (TPT), présentement utilisé comme antitumoral, ait démontré une activité antileishmaniale puissante (EC50 de l’ordre des nanomolaires), son efficacité pourrait être compromise par l’émergence de la résistance du parasite d’autant plus que des résistances tumorales cliniques au TPT ont déjà été rapportées. Dans cette étude, les mécanismes de résistance au TPT par Leishmania infantum ont été caractérisés d’un point de vue moléculaire. Le génome complet des parasites sélectionnés résistants au TPT (16 x EC50) (TPT700.1, TPT700.2, TPT700.3) a été séquencé. Le rôle dans la résistance des différents éléments génétiques identifiés a été confirmé à l’aide d’une complémentation par nucléofection épisomale dans le parasite sauvage et a été étudié avec des simulations computationnelles. Aucune amplification ni délétion n’a été identifiée et seulement une variation mineure du nombre de chromosomes a été observée. Cependant, un polymorphisme d’un seul nucléotide non synonyme a été identifié dans le gène de la grande sous-unité de la topoisomérase IB (TOP IB), la cible du TPT, chez chacun des parasites mutants résistants conférant des niveaux de résistance variables (TPT700.1 F187Y > TPT700.3 W232R > TPT700.2 G191A > sauvage). De plus, des modélisations in sillico ont permis d’illustrer la proximité de ces substitutions d’acides aminés au site catalytique de TOP IB ainsi qu’au site de liaison du TPT. En conclusion, ces résultats suggèrent qu’une mutation ponctuelle dans la grande sous-unité TOP IB est suffisante pour engendrer des hauts niveaux de résistance (environ 24 x EC50) chez TPT700.1F187Y, TPT700.2G191A et TPT700.3 W232R. TPT pourrait être considéré comme un modèle pharmacologique pour l’étude de la résistance chez Leishmania. / Leishmania, a protozoan parasite, causes a neglected tropical disease that is fatal if left untreated. In recent years, the effectiveness of the drugs used to tackle leishmaniasis has decreased dramatically due to the emergence of drug resistant parasites. Even though Topetecan (TPT), currently employed as an anti-tumoral drug, has shown strong anti-leishmanial activity (its EC50 being measured in nanomoles), its efficiency may be compromised by the resistance developped by the parasites, similarly to the resistance already recorded by tumoral cells to the drug. In this study, the mecanisms of resistance to TPT by Leishmania infantum were caracterised at the molecular level. The whole genome of parasites resistant to TPT (16 x EC50) (TPT700.1, TPT700.2, TPT700.3) was sequenced. The role of various genetic elements in the resistance mecanisms was confirmed via a complementation by episomal nucleofection in the wild type and was studied with the help of computational models. Neither amplications nor deletions were identified and only a minor variation in the chromosome number was observed. However, a non-synonymous single nucleotide polymorphism was identified in the gene coding the large subunit of topoisomerase IB, TPT’s target, within each of the resistant mutant parasites confering variable levels of resistance (TPT700.1 F187Y > TPT700.3 W232R > TPT700.2 G191A > wild type). Furthermore, in sillico models highlighted the proximity of these amino acid substitutions to the catalytic site of topoisomerase IB and also to the binding pockets of TPT. In conclusion, these results suggest that a point mutation in the large subunit of TOP IB is sufficient to confer high levels of resistance (about 24 x EC50) to TPT700.1F187Y, TPT700.2G191A and TPT700.3 W232R. Therefore, TPT can be considered a pharmacological tool to study resistance in Leishmania.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les ARN produits chez la bactérie Escherichia coli sont généralement amenés vers deux voies distinctes. Le plus souvent, l' ARN naissant se dissocie de la matrice, durant sa synthèse, afin d'être fonctionnel. Celui-ci peut alors servir de matrice pour les ribosomes qui le traduisent en polypeptides, ou alors il peut servir de matériau de structure dans la composition des ribosomes. Le second type de transcrit trouve son utilité lorsque l' ARN demeure attaché à la matrice ADN afin d'amorcer la réplication. Ce type d' ARN est très court et il est immédiatement utilisé comme amorce par la polymérase ADN de la cellule. Récemment, il a été démontré que les hybrides ARN­ADN peuvent aussi être impliqués dans la recombinaison. Plusieurs travaux menés sur la formation de ces structures hybrides indiquent que celle-ci dépend généralement du surenroulement de l' ADN et de certains paramètres de transcription. La formation d'hybrides ARN-ADN durant la transcription démontre bien que la compréhension des mécanismes de transcription serait évidemment incomplète sans y inclure la topologie de l' ADN. L'étude de la transcription révèle un mécanisme dynamique très complexe, finement régulé à plusieurs niveaux, tant à l'initiation, l'élongation, que la terminaison. La topologie de l' ADN, ainsi que les topoisomérases ADN ont été caractérisées comme des modulateurs importants dans toutes les étapes de l'expression génique, allant de la reconnaissance spécifique des promoteurs jusqu'au déplacement de l' ARN naissant ou de son attachement à la matrice ADN. De plus, la transcription est l'évènement génétique le plus fréquent dans une cellule. Selon le travail présenté ici, un des rôles essentiels de la topoisomérase I semble être l'inhibition de la formation d'hybrides ARN-ADN durant la transcription chez Escherichia coli. Ceux-ci semblent survenir principalement au niveau des opérons ribosomaux. Le couplage entre la traduction et la transcription, chez les ARNm, aide à prévenir la formation d'hybrides ARN-ADN. La croissance à basse température favorise l'appariement de l' ARN à l' ADN. La suite des travaux décrits propose que le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli n'est pas la relaxation du surenroulement global de l' ADN, mais plutôt l'élimination du surenroulement local généré durant la transcription. Ce surenroulement semble responsable de l'initiation de la formation de structures hybrides ARN-ADN, alors que la gyrase provoquerait leur élongation. Ces observations permettent de suggérer de nouveaux rôles pour la topoisomérase I et la gyrase chez les bactéries.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.

La division cellulaire est un processus fondamental des êtres vivants. À chaque division cellulaire, le matériel génétique d'une cellule mère est dupliqué et ségrégé pour produire deux cellules filles identiques; un processus nommé la mitose. Tout d'abord, la cellule doit condenser le matériel génétique pour être en mesure de séparer mécaniquement et également le matériel génétique. Une erreur dans le niveau de compaction ou dans la dynamique de la mitose occasionne une transmission inégale du matériel génétique. Il est suggéré dans la littérature que ces phénomènes pourraient causé la transformation des cellules cancéreuses. Par contre, le mécanisme moléculaire générant la coordination des changements de haut niveau de la condensation des chromosomes est encore incompris. Dans les dernières décennies, plusieurs approches expérimentales ont identifié quelques protéines conservées dans ce processus. Pour déterminer le rôle de ces facteurs dans la compaction des chromosomes, j'ai effectué un criblage par ARNi couplé à de l'imagerie à haute-résolution en temps réel chez l'embryon de C. elegans. Grâce à cette technique, j'ai découvert sept nouvelles protéines requises pour l'assemblage des chromosomes mitotiques, incluant la Ribonucléotide réductase (RNR) et Topoisomérase II (topo-II). Dans cette thèse, je décrirai le rôle structural de topo-II dans l'assemblage des chromosomes mitotiques et ces mécanismes moléculaires. Lors de la condensation des chromosomes, topo-II agit indépendamment comme un facteur d'assemblage local menant par la suite à la formation d'un axe de condensation tout au long du chromosome. Cette localisation est à l'opposé de la position des autres facteurs connus qui sont impliqués dans la condensation des chromosomes. Ceci représente un nouveau mécanisme pour l'assemblage des chromosomes chez C. elegans. De plus, j'ai découvert un rôle non-enzymatique à la protéine RNR lors de l'assemblage des chromosomes. Lors de ce processus, RNR est impliqué dans la stabilité des nucléosomes et alors, permet la compaction de haut niveau de la chromatine. Dans cette thèse, je rapporte également des résultats préliminaires concernant d'autres nouveaux facteurs découverts lors du criblage ARNi. Le plus important est que mon analyse révèle que la déplétion des nouvelles protéines montre des phénotypes distincts, indiquant la fonction de celles-ci lors de l'assemblage des chromosomes. Somme toute, je conclus que les chromosomes en métaphase sont assemblés par trois protéines ayant des activités différentes d'échafaudage: topoisomérase II, les complexes condensines et les protéines centromériques. En conclusion, ces études prouvent le mécanisme moléculaire de certaines protéines qui contribuent à la formation des chromosomes mitotiques. / Cell division is a fundamental process that continuously happens in all living organisms. In each cell division, genetic material of the parent cell duplicates and segregates to produce genetically identical daughter cells in a process called mitosis. Cells need to condense their genetic material to be able to partition them equally. Any subtle defects, either timing or compaction level, could lead to the unequal inheritance of genetic material, a phenomenon that is believed to be the leading cause of cancerous transformation. However, the precise molecular mechanisms underlying the coordinated changes of higher-order chromosome structure are poorly understood. In the last two decades, various approaches have identified several conserved factors required for chromosome condensation. To define the roles of known and novel factors in this process, I performed an RNAi based screen using high-resolution live imaging of the C. elegans one-cell embryo. Importantly, using an in vivo approach, I discovered seven novel factors required for mitotic chromosome assembly, including Ribonulceotide reducatase (RNR) and DNA topoisomerase II (topo-II). In this thesis, I report a structural role for topo-II in mitotic chromosome assembly and underlying molecular mechanisms. During chromosome condensation process, topo-II acts independently as a local assembly factor leading to global chromosome axis formation, contradicting models that chromosomes organize around preassembled scaffolds, thus representing a novel pathway for chromosome assembly in C. elegans. Furthermore, I also discovered a non-enzymatic role of RNR in the mitotic chromosome assembly process. During this process, RNR is involved in nucleosome stability, and thereby, it allows higher-order chromatin assembly. In this thesis, I also report preliminary data for other novel factors that I discovered in the RNAi based screen for factors involved in chromosome condensation. Importantly, my analyses revealed that the depletion of several proteins results in distinct chromosome condensation phenotypes, indicating that they function in discrete events during mitotic chromosome assembly. In sum, I conclude that metaphase chromosomes are built by the distinct scaffolding activities of three proteins: DNA topoisomerase II, condensin complexes and centromere proteins. Taken together, these studies provide underlying molecular mechanisms contributing to the mitotic chromosome formation.

Les topoisomérases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomérases (topos) de type IA d’Escherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de l’excès de surenroulement négatif, tandis que peu d’information est disponible sur le rôle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomérases de type IA sont manquantes souffrent d’une croissance difficile ainsi que de défauts de ségrégation sévères. Nous démontrons que ces problèmes sont majoritairement attribuables à des mutations dans la gyrase qui empêchent l’accumulation d’excès de surenroulement négatif chez les mutants sans topA. L’augmentation de l’activité de la gyrase réalisée par le remplacement de l’allèle gyrB(Ts) par le gène de type sauvage ou par l’exposition des souches gyrB(Ts) à une température permissive, permet la correction significative de la croissance et de la ségrégation des cellules topos de type IA. Nous démontrons également que les mutants topB sont hypersensibles à l’inhibition de la gyrase par la novobiocine. La réplication non-régulée en l’absence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la nécessité de l’activité de la topoisomérase III. De plus, en l’absence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomérase III permet de réduire la dégradation importante d’ADN qui est observée en l’absence de recA (RecA). Nous proposons un rôle pour la topoisomérase III dans la ségrégation des chromosomes lorsque l’activité de la gyrase n’est pas optimale, par la réduction des collisions fourches de réplication s’observant particulièrement en l’absence de la topo I et de la RNase HI. / E. coli possesses two type IA topoisomerases (topos), namely topo I (topA) and topo III (topB). The major function of topo I is the relaxation of excess negative supercoiling. Much less is known about the function of topo III. Cells lacking both type IA topos suffer from severe chromosome segregation and growth defects. We show that these defects are mostly related to the presence of gyrase mutations that prevent excess negative supercoiling in topA null mutants. Indeed, increasing gyrase activity by spontaneous mutations, by substituting a gyrB(Ts) allele for a wild-type one or by exposing cells carrying the gyrB(Ts) allele to permissive temperatures, significantly corrected the growth and segregation defects of cells lacking type IA topo activity. We also found that topB mutants are hypersensitive to novobiocin due to gyrase inhibition. Our data also suggest that unregulated replication occurring in the absence of topA and rnhA (RNase HI) exacerbates the need for topo III activity. Moreover, when topA and rnhA were absent, we found that topo III overproduction reduced the extensive DNA degradation that took place in the absence of recA (RecA). All together, our results lead us to propose a role for topo III in chromosome segregation when gyrase activity is suboptimal, thus reducing replication forks collapse, especially when replication is unregulated due to the absence of topo I and RNase HI.

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare disease of unknown etiology that affects people that have a genetic predisposition to autoimmunity. Despite the latest advancement and development in the field, the mechanisms underlying disease development remain poorly understood. The lack of animal model that encompasses the cardinal features of human systemic sclerosis is a major cause of the slowdown in the understanding of this disease. In fact, some mouse models such as the bleomycin induced-SSc and TSK-1 mouse are widely used in preclinical studies of scleroderma. However, these models have several shortcomings since these mice do not display all the cardinal features of the disease found in humans. To contribute to the research of SSc, postdoctoral fellow Dre Heena Mehta has developed in Dre Sarfati’s laboratory in collaboration with Dr Senécal, an experimental murine model of SSc induced by dendritic cells loaded with topoisomerase I peptide. In order to characterise the model and establish an immune profile of our experimental mice, my analysis focused mainly on the cardinal features of scleroderma such as fibrosis, inflammation and polyclonal hyper-γ-globulinemia, vasculopathy and cytokines gene expression. Hence, immunization with dendritic cells loaded topoisomerase I peptides (TOPOIA and TOPOIB) induced pulmonary and dermal inflammation together with diffuse form of fibrosis. The mice also showed symptoms of vasculopathy and high levels of polyclonal antibodies. These results showed that TOPOIA peptides are effective in inducing fibrosis and inflammatory response while TOPOIB peptides are involved in skin fibrosis. Together with the results, the preliminary data on cytokine profile in tissue suggested that our mouse model could possibly replace/complement other current animal models of scleroderma.

Les facteurs de transcription STAT3 sont activés dans de nombreuses tumeurs et leurs effets sur la prolifération et la survie suggéraient fortement que ces protéines puissent être impliquées à la fois dans la transformation cellulaire et dans l'échappement aux traitements classiques de chimiothérapie.<br />Nous nous sommes donc intéressés aux différents aspects impliquant STAT3 dans la réponse de lignées cellulaires aux agents génotoxiques de chimiothérapie, et plus particulièrement aux inhibiteurs de topoisomérase. Durant ces traitements, STAT3 interagit avec le répresseur transcriptionnel Rb et l'inhibiteur du cycle cellulaire p21. Ces deux protéines inhibent son activité transcriptionnelle, notamment sur les gènes c-myc et cdc25A, et permettent la mise en place de la sénescence induite par les dommages de l'ADN et la catastrophe mitotique. Cependant, en présence d'une activité constitutive de STAT3 induite par l'oncogène v-src, STAT3 empêche l'activation de Rb et de p21, favorise la résistance des cellules aux inhibiteurs de topoisomérase II, et génère de l'instabilité génomique. Finalement,<br />deux inhibiteurs de STAT3, le cetuximab, un anticorps monoclonal dirigé contre l'EGFR, et un inhibiteur de la tyrosine kinase c-src, sensibilisent des cellules colorectales aux inhibiteurs de topoisomérase I. L'inhibition de STAT3 empêche l'activation du gène Eme1 qui induit l'expression d'une protéine de réparation de l'ADN.<br />STAT3 est donc un facteur de résistance aux inhibiteurs de topoisomérase. Sa détection pourrait ainsi permettre de mieux prédire la réponse des patients à ces inhibiteurs, et son inhibition, dans les tumeurs où il est actif, pourrait permettre de les sensibiliser aux inhibiteurs de topoisomérase.

Au cours de cette thèse , nous avons étudié le fonctionnement des topoisomérases de type II en utilisant un dispositif de micromanipulation de molécules uniques d'ADN. Les topoisomérases sont des enzyme responsables de la régulation de la topologie de l'ADN in vivo, en particulier lors de la réplication, la transcription et la condensation des chromosomes. Dans une première partie, nous introduisons le formalisme topologique nécessaire à la compréhension de la structure adoptée à grande échelle par la molécule d'ADN, puis nous présentons les techniques usuelles qui permettent d'étudier la topologie de ces molécules. Dans une seconde partie, nous présentons le dispositif de micromanipulation d'ADN que nous avons utilisé. Celui-ci, basé sur l'utilisation de pinces magnétiques, permet de sonder directement les propriétés élastiques en tension et en torsion d'une molécule unique d'ADN, mais aussi d'étudier la caténation ou le tressage de molécules d'ADN. Ainsi, il offre la possibilité d'étudier en temps réel l'activité d'enzymes appelées topoisomérases qui décatènent ou modifient l'état de super-enroulement de l'ADN. Dans la troisième partie, nous présentons les résultats que nous avons obtenus sur différentes enzymes de la classe des topoisomérases de type II. Nous montrons que les expériences de molécules unique permettent une étude très fine du cycle enzymatique des topoisomérases. Par ailleurs, nous mettons en évidence le fait que la topoisomérase 4 opère une reconnaissance de son substrat, basée sur l'angle entre segments dans un croisement d'ADN. Enfin, nous présentons des expériences qui visent à comprendre les propriétés thermodynamiques particulières de ces enzymes.