With the current state of climate change and world peak oil on the horizon, it is important to focus our research efforts on alternative sources of energy. Ethanol obtained from the digestion of biomass (bioethanol) and oil harvesting from algae (biodiesel) are two promising fields of study for transportation fuel production. However, in their current state of development, neither option is capable of reasonably replacing the transportation fuel demand for this country. The land demand needed is too large for either process to become a viable option, albeit the land demand for biodiesel is considerably smaller than that of bioethanol. Therefore, when moving forward with alternative transportation fuel, harvesting oil from algae is a more promising option. Therefore, I investigated oil producing green algae to better understand algal growth, the algal cytoskeleton, and tried to establish a methodology to genetically manipulate algae. I developed a microgrowth assay in order to investigate algal growth and proliferation, while at the same time using considerably less material and space. This assay can directly monitor algal growth in response to media contents, and overcomes many of the limitations of existing microassays due to its use of solid media agar and fluorescent imaging. I also investigated algal genetic manipulation with the intention of creating a standard operating procedure, which could lead to further investigation of how to increase lipid output and increase lipid harvesting cycles through studying lipid production and cell division. Electroporation and PEG mediated transformation were the two chief methods investigated for nuclear transformation. Lastly, I performed an algal kinesin phylogenetic study to characterize the currently available algal kinesin superfamily, providing insight to proteins that are important for cell division as well as other functions within this superfamily. Kinesins 5, Kinesin 7s Class II and Class V, and Kinesin 14 Class I were identified to be important for algal cell division, while Kinesin 8, 12, 11, and some orphan kinesins will require further investigation due to their unknown plant function. Overall, this research provides a foundation for future algal studies required for optimal oil production necessary for a more sustainable future.

Les zones côtières sont soumises à des pressions anthropiques multiples notamment de nature chimique qui peuvent faire peser un risque réel pour la pérennité des espèces aquatiques. Le bassin d’Arcachon, lagune macrotidale située sur la façade atlantique, est aussi le siège d’une activité ostréicole importante. Cependant depuis plusieurs années, les exploitations ostréicoles sont confrontées à une baisse de recrutement et une forte mortalité des naissains d’huître. La contamination chimique du milieu comme facteur pouvant contribuer aux effets observés sur les huîtres n’a pour l’instant pas été vérifiée. L’étude présentée ici porte sur l’évaluation, à travers différentes approches, de la toxicité potentielle de métaux et pesticides sur les stades précoces de développement de l’huître creuse C. gigas. Les réponses embryotoxiques, génotoxiques et l’expression de gènes d’intérêt ont été étudiés. Les différents pesticides (S-métolachlore, irgarol et diuron) et métaux (cuivre et cadmium) ont tout d’abord été testés séparément pour déterminer leur spectre d’effets et leur mode d’action. Il a été montré qu’une exposition des gamètes ou des embryons d’huître aux pesticides étudiés et au cuivre conduit à une augmentation des malformations larvaires et des dommages à l’ADN, une diminution du succès de fécondation et un impact sur la qualité de la descendance à des teneurs environnementales. Le cadmium, quant à lui, ne présente pas d’effet embryotoxique et génotoxique aux concentrations présentes dans le milieu aquatique. Les métabolites du métolachlore, ESA métolachlore et OA métolachlore sont retrouvés dans le bassin d’Arcachon à de plus fortes concentrations que le composé parent, cependant rien n’est actuellement connu sur les effets toxiques de ces métabolites. Il a été montré que ces métabolites sont moins embryotoxiques et génotoxiques sur les embryons et sur les spermatozoïdes d’huître que le métolachlore. Des variations dans l’expression des gènes impliqués dans les défenses antioxydantes sont observées pour les larves d’huître exposées au métolachlore et au métolachlore ESA. La toxicité d’un mélange de pesticides représentatifs de la contamination du bassin d’Arcachon en présence ou non de cuivre a ensuite été évaluée. L’exposition des embryons d’huître à ces mélanges conduit à des défauts de développement, des dommages à l’ADN et des modifications de l’expression des gènes impliqués majoritairement dans le stress oxydant. Finalement, une cartographie de la toxicité des sédiments du bassin d’Arcachon a été réalisée au cours des 4 saisons de l’année 2011 à l’aide du test embryolarvaire huître. Les sédiments d’Arguin présentent une faible toxicité quelle que soit la saison considérée. En revanche, les sédiments du Tès montrent un effet embryotoxique plus important au printemps et en été par rapport à la saison hivernale. L’ensemble de ce travail permet d’émettre l’hypothèse d’un risque chimique accru pour le développement des premiers stades de vie de huître creuse dans le bassin d’Arcachon. / The coastal areas are subject to multiple anthropogenic pressures including chemical pollution that can pose a real risk to the sustainability of aquatic species. The Arcachon Bay, macrotidal lagoon located on the French Atlantic coast, is the important ecosystem for oyster farming. But for several years, the oyster farms face lower recruitment and high mortality of oyster spat. Chemical contamination of the environment as a factor that may contribute to the observed effects on oysters has so far not been investigated.The present thesis aimed at evaluating through different approaches, of the potential toxicity of heavy metals and pesticides representative of the Arcachon Bay contamination on the early life stages of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Embryotoxicity, genotoxicity and expression levels of eleven targeted genes were studied. Firstly, different pesticides (S-metolachlor, irgarol, and diuron) and metals (copper and cadmium) were separately tested to determine their spectrum of effects. It were shown that exposure of gametes and embryos of oyster to environmental concentrations of pesticides and copper increased developmental abnormalities and DNA damage, and reduced fertilization success and affected offpring quality. Cadmium, meanwhile, showed no embryotoxic and genotoxic effects at the concentrations found in the Arcachon Bay. Metabolites of metolachlor, metolachlor ESA and metolachlor OA, are found in the Arcachon Bay at higher concentrations than their parent compound. The results showed that these metabolites were less embryotoxic and genotoxic on oyster embryos and spermatozoa than metolachor. Significant changes in expression of genes involved in antioxidant defense were observed for oyster larvae exposed to metolachlor and metolachlor ESA. Toxicity of mixtures of pesticides representative of the Arcachon Bay contamination with and without copper was then evaluated. Exposures of oyster embryos to these mixtures lead to development defects, DNA damage and changes in the expression of genes involved mainly in oxidative stress responses. Finally, mapping of toxicity of sediments from the Arcachon Bay was conducted for four seasons of 2011 with the oyster embryo-larvae assay. Sediments collected from Arguin exhibited low toxicity, regardless any season. In contrast, sediments from Le Tès showed higher toxicity in spring and summer seasons compared to winter season.From this work, it can be hypothesized that chemical contamination of the Arcachon Bay represents a threat for oyster reproduction and development.

O ribeirão Limeira nasce em Piquete - SP e deságua no rio Paraíba do Sul, em Lorena - SP. Em sua bacia hidrográfica existem indústrias de materiais bélicos e abrasivos, plantações de eucalipto e áreas de pastagem. Para avaliar possíveis impactos do uso e ocupação da área, este estudo avaliou as condições limnológicas e ecotoxicológicas do ribeirão, entre set/07 e jul/08. Ao longo do ribeirão, foram estabelecidos sete pontos amostrais, da nascente até a foz. A água e sedimento foram avaliados quanto à toxicidade aguda e crônica através de bioensaios com os cladóceros Daphnia similis, Ceriodaphnia silvestrii e a alga Pseudokirchneriella subcapitata para a água; e C. silvestrii, D. similis e o quironomídeo Chironomus xanthus para o sedimento. Os parâmetros limnológicos analisados na água foram: turbidez, condutividade, OD, pH, DQO, DBO, nitrato, nitrito, fósforo total, sólidos totais dissolvidos, dureza, metais (Ag, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Mg, Ni, Pb e Zn) e coliformes termotolerantes. Os parâmetros físico-químicos do sedimento analisados foram: fósforo total, matéria orgânica, granulometria, metais totais e frações biodisponíveis. Bioensaios in situ foram realizados utilizando câmaras de PVC, em pontos previamente selecionados, baseados nos resultados de ecotoxicidade do período de set/07 a jul/08. A sazonalidade influenciou na dinâmica deste ambiente e nas variáveis analisadas, também ocorreu variação espacial indicando influência de ações antrópicas no ribeirão. Conforme os parâmetros analisados na água, alguns pontos amostrais estiveram fora dos padrões estabelecidos pela Resolução CONAMA 357/05 (Classe I e II) em alguns meses. Fontes de poluição difusa dificultaram a identificação das possíveis substâncias causadoras de toxicidade. Ao longo do ribeirão, certos pontos apresentaram valores de metais no sedimento fora dos limites preconizados pela Canadian Council of Ministers of the Environment. O ribeirão Limeira apresentou a qualidade da água regular, segundo o índice para a manutenção da vida aquática (IVA). Os ensaios in situ indicaram que o sedimento do ponto P4 apresentou toxicidade. Esses bioensaios no ambiente se mostraram mais eficientes que os ensaios laboratoriais, refletindo uma melhor realidade em relação à possível presença de substâncias tóxicas no ecossistema aquático. / The Limeira stream is born in Piquete - SP and flows into the Paraiba do Sul river, in Lorena - SP. In this basin there are military and abrasives industries, eucalyptus plantations and pasture areas. To evaluate potential impacts of the use and occupation of the area, this study assessed the ecotoxicological and limnological conditions of the stream between September 2007 and July 2008. Seven sampling points were estabilished along the river from the source to the mouth. The acute and chronic toxicity were evaluated both in the water and sediment, using the cladocerans Daphnia similis and Ceriodaphnia silvestrii, algae Pseudokirchneriella subcapitata for the water and C. silvestrii, D. similis and chironomids Chironomus xanthus for the sediment. The limnological parameters analyzed in water were: turbidity, conductivity, dissolved oxygen, pH, COD, BOD, nitrate, nitrite, total phosphorus, total dissolved solids, hardness, metals (Ag, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Mg, Ni , Pb and Zn) and fecal coliform; and the physical-chemical parameters of sediment were: total phosphorus, organic matter, granulometry, metals and bioavailable fractions. The in situ bioassays were conducted using PVC chambers at previously selected points, based on the results of ecotoxicity. The results showed that seasonality influenced both the dynamics of the environment and the analyzed variables. The spatial variation indicated influence of human activities along the stream. In some months, the analyzed parameters of water were outside the parameters established by CONAMA Resolution 357/05 for Class I and II. Diffuse pollution sources made it difficult to identify the potential toxicity-causing substances. In some points along the river, the values of metals in sediment were outside the limits recommended by the Canadian Council of Ministers of the Environment. According to the index for the maintenance of aquatic life (VAT), the river showed regular water quality due to the results of acute and chronic toxicity observed in some points.

O ribeirão Limeira nasce em Piquete - SP e deságua no rio Paraíba do Sul, em Lorena - SP. Em sua bacia hidrográfica existem indústrias de materiais bélicos e abrasivos, plantações de eucalipto e áreas de pastagem. Para avaliar possíveis impactos do uso e ocupação da área, este estudo avaliou as condições limnológicas e ecotoxicológicas do ribeirão, entre set/07 e jul/08. Ao longo do ribeirão, foram estabelecidos sete pontos amostrais, da nascente até a foz. A água e sedimento foram avaliados quanto à toxicidade aguda e crônica através de bioensaios com os cladóceros Daphnia similis, Ceriodaphnia silvestrii e a alga Pseudokirchneriella subcapitata para a água; e C. silvestrii, D. similis e o quironomídeo Chironomus xanthus para o sedimento. Os parâmetros limnológicos analisados na água foram: turbidez, condutividade, OD, pH, DQO, DBO, nitrato, nitrito, fósforo total, sólidos totais dissolvidos, dureza, metais (Ag, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Mg, Ni, Pb e Zn) e coliformes termotolerantes. Os parâmetros físico-químicos do sedimento analisados foram: fósforo total, matéria orgânica, granulometria, metais totais e frações biodisponíveis. Bioensaios in situ foram realizados utilizando câmaras de PVC, em pontos previamente selecionados, baseados nos resultados de ecotoxicidade do período de set/07 a jul/08. A sazonalidade influenciou na dinâmica deste ambiente e nas variáveis analisadas, também ocorreu variação espacial indicando influência de ações antrópicas no ribeirão. Conforme os parâmetros analisados na água, alguns pontos amostrais estiveram fora dos padrões estabelecidos pela Resolução CONAMA 357/05 (Classe I e II) em alguns meses. Fontes de poluição difusa dificultaram a identificação das possíveis substâncias causadoras de toxicidade. Ao longo do ribeirão, certos pontos apresentaram valores de metais no sedimento fora dos limites preconizados pela Canadian Council of Ministers of the Environment. O ribeirão Limeira apresentou a qualidade da água regular, segundo o índice para a manutenção da vida aquática (IVA). Os ensaios in situ indicaram que o sedimento do ponto P4 apresentou toxicidade. Esses bioensaios no ambiente se mostraram mais eficientes que os ensaios laboratoriais, refletindo uma melhor realidade em relação à possível presença de substâncias tóxicas no ecossistema aquático. / The Limeira stream is born in Piquete - SP and flows into the Paraiba do Sul river, in Lorena - SP. In this basin there are military and abrasives industries, eucalyptus plantations and pasture areas. To evaluate potential impacts of the use and occupation of the area, this study assessed the ecotoxicological and limnological conditions of the stream between September 2007 and July 2008. Seven sampling points were estabilished along the river from the source to the mouth. The acute and chronic toxicity were evaluated both in the water and sediment, using the cladocerans Daphnia similis and Ceriodaphnia silvestrii, algae Pseudokirchneriella subcapitata for the water and C. silvestrii, D. similis and chironomids Chironomus xanthus for the sediment. The limnological parameters analyzed in water were: turbidity, conductivity, dissolved oxygen, pH, COD, BOD, nitrate, nitrite, total phosphorus, total dissolved solids, hardness, metals (Ag, Cd, Cr, Cu, Fe, Mn, Mg, Ni , Pb and Zn) and fecal coliform; and the physical-chemical parameters of sediment were: total phosphorus, organic matter, granulometry, metals and bioavailable fractions. The in situ bioassays were conducted using PVC chambers at previously selected points, based on the results of ecotoxicity. The results showed that seasonality influenced both the dynamics of the environment and the analyzed variables. The spatial variation indicated influence of human activities along the stream. In some months, the analyzed parameters of water were outside the parameters established by CONAMA Resolution 357/05 for Class I and II. Diffuse pollution sources made it difficult to identify the potential toxicity-causing substances. In some points along the river, the values of metals in sediment were outside the limits recommended by the Canadian Council of Ministers of the Environment. According to the index for the maintenance of aquatic life (VAT), the river showed regular water quality due to the results of acute and chronic toxicity observed in some points.

Les sédiments agissent comme de véritable puits pour certains polluants organiques persistants et métaux représentant ainsi une source de contamination secondaire pour les milieux aquatiques. Dans ce contexte, un test embryo-larvaire utilisant le Medaka japonais (Oryzias latipes) a été développé afin d’évaluer la toxicité des polluants fixés aux particules sédimentaires. Le bioessai consiste à maintenir les embryons de Medaka en contact direct avec le sédiment durant tout leur développement embryonnaire puis à évaluer les effets létaux et sublétaux induits au niveau phénotypique et moléculaire chez les embryons et larves exposés. Tout d’abord, le bioessai a été appliqué à la caractérisation de la toxicité et des modes d’action de substances organiques et métalliques pures. Le pyrène et son dérivé, le méthylpyrène, se sont avérés fortement tératogènes avec un spectre de malformations rappelant le syndrome de la maladie du sac bleu. L’étude du profil d’expression génique a révélé la perturbation de certains processus cellulaires notamment la voie AhR, le métabolisme mitochondrial et la voie de signalétique et de métabolisation des rétinoïdes. Le cuivre et le cadmium ont induit de nombreuses malformations squelettiques et cardio-vasculaires, des dommages à l’ADN ainsi que l’altération de l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial, la régulation du cycle cellulaire et la réparation de l’ADN. Enfin, le bioessai a été appliqué à l’évaluation du potentiel toxique de sédiments naturels du système Lot-Garonne et du Bassin d’Arcachon. L’ensemble des sédiments testés a montré un large spectre d’effets tératogènes et seuls quelques-uns ont conduit à des effets létaux. Par ailleurs, l’expression plusieurs gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial, la voie AhR, le contrôle du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN et la détoxication des métaux a été modifiée lors de l’exposition à certains sédiments contaminés de la zone d’étude. / Aquatic sediments act as real sink for numerous anthropogenic chemicals such as persistent organic pollutants and heavy metals as well as a secondary contamination source. In this context, a fish embryo-larval assay was developed using the Japanese Medaka (Oryzias latipes) as a test organism to evaluate de toxicity of particle-bound contaminants. In this aim, fish embryos are kept in direct contact to sediment during their whole embryonic development and induced lethal and sub-lethal effects are measured at the phenotypical and molecular levels. This test was first applied to the toxicity evaluation and modes of action characterization of organic and metallic single compounds. Pyrene and its alkylated derivative, methylpyrene, revealed a high teratogenic potency inducing developmental deformities similar to the blue sac disease syndrome. Gene expressions response pattern using RT-PCR method highlighted the alteration of several cellular process including AhR pathway, mitochondrial metabolism and retinoids signaling and metabolism pathways. Copper and cadmium mainly induced numerous skeletal and cardiovascular injuries, DNA damage as well as modifications of gene expression involved in mitochondrial metabolism, DNA damage repair and cell cycle regulation. Finally, the Medaka embryo-larval assay was applied to analyze the toxic potential of natural sediments form the Lot-Garonne system and the Arcachon bay. All tested sediments showed a wide range of teratogenic effects but only few of them revealed to be acutely toxic. Moreover, the expression of several genes involved in mitochondrial metabolism, AhR pathway, cell cycle arrest, DNA repair and heavy metals detoxication proved to be modified in the presence of some contaminated sediments from the studied area.

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Ein Großteil der Lebensmittel wird in der heutigen Zeit vor allem aufgrund ihrer langen Haltbarkeit in Konservendosen verpackt. Zur Qualitätserhaltung des Lebensmittels werden Weißblechdosen im Innenbereich in der Regel mit einer Lackierung versehen. Lackrohstoffe sind dabei u. a. Phenol- und Epoxidharze, die als Basis- oder Vernetzerkomponente eingesetzt werden. Bei der Herstellung und Lagerung dieser Lebensmittel kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Migration von Bestandteilen aus der Kunststoffinnenbeschichtung in das Füllgut kommt. Toxikologisch und somit auch analytisch sind dabei vor allem die migrierenden Verbindungen unter 1000 Da von Interesse, da Substanzen mit einer Molmasse von über 1000 Da nur zu weniger als 1 % im Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. Analytik von phenolischen Verbindungen Bei Untersuchungen zur Migration phenolischer Verbindungen unter Verwendung verschiedener Modellcoatings und Simulanzlösemittel wurden Konzentrationen an migrierenden phenolischen Substanzen in Summe bis 160 µg/dm² bestimmt, womit dieser Gehalt deutlich unter dem gesetzlichen Grenzwert für die Gesamtmigration von 10 mg/dm² liegt. Die Quantifizierung erfolgte dabei über SEC-FLD-Kalibriergeraden der für diese Coatings verwendeten Phenolharze. Tendenziell steigt dabei die Menge an übergehenden Verbindungen mit abnehmender Polarität der verwendeten Simulanzien. Ebenso abhängig vom Lösungsmittel ist die Molekulargewichts¬verteilung der im Migrat enthaltenen Phenole. So zeigte sich eine deutliche Verschiebung der phenolischen Verbindungen zu höheren Molekulargewichten mit abnehmender Polarität der Simulanzlösemittel. Mit wenigen Ausnahmen besitzen jedoch alle migrierenden Substanzen eine Molmasse von unter 1000 Da. Das beobachtete Migrationsverhalten kann u. a. auf die unterschiedliche Reaktivität der phenolischen Basismonomere der Harze zurückgeführt werden, wodurch die Fähigkeit variiert, unter den Einbrennbedingungen ein ausgeprägtes Netzwerk zu bilden. Zur näheren Charakterisierung der Phenolharze wurden einzelne Hauptverbindungen der RP-HPLC-FLD-Chromatogramme identifiziert. Über Derivatisierungsreaktionen mit Picolinsäure, Essigsäureanhydrid sowie Dansylchlorid konnten Informationen zur Anzahl an alkoholischen und phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül erhalten werden. Mit dem Wissen um die eingesetzten Phenolmonomere und einer eventuellen Veretherung konnten Strukturvorschläge erstellt werden. Die Quantifizierung der migrierenden phenolischen Verbindungen in Migraten kommerzieller Coatings in Summe wurde über eine universell anwendbare Kalibrierung angestrebt. Dazu wurden 17 verschiedene Phenolharze bezüglich der Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden, des mittleren Molekulargewichtes, der Hydroxylzahl und dem Verhältnis OH-Gruppen/Molekül charakterisiert. Wie erwartet steigt mit wenigen Ausnahmen die Anzahl der OH-Gruppen im Molekül tendenziell mit dem mittleren Molekulargewicht. Es zeigte sich zudem, dass die verschiedenen Phenolharze in ihren fluorophoren Eigenschaften stark variieren. Die Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden konnte zudem in keine Korrelation mit einem anderen ermittelten Parameter gebracht werden. Die Anwendung einer universellen Kalibriergerade zur Quantifizierung war deshalb nicht möglich. Die Größenordnungen der Migratkonzentrationen konnten daher nur über die zwei im Anstieg am stärksten variierenden SEC-FLD-Kalibriergeraden abgeschätzt werden. Bei der Analyse kommerzieller Epoxy-Phenol-Coatings war im Gegensatz zu Polyester-Phenol-Coatings die isolierte Detektion der phenolischen Verbindungen im Migrat mittels Fluoreszenz nicht möglich, da sowohl Epoxide als auch Phenole fluorophorer Eigenschaft besitzen. Es wurde daher eine Methode zur Abtrennung der Phenole von anderen im Migrat enthaltenen Subtanzen auf Basis eines Anionenaustauschermaterials entwickelt. Dabei wurde die Eigenschaft der Phenole genutzt, im basischen Milieu Phenolate zu bilden. Diese, aber auch Säuren adsorbieren am Austauschermaterial, während Epoxide oder Polyester nicht retardiert werden. Für zwei kommerzielle Epoxy-Phenol-Coatings konnte somit der Anteil an phenolischen Verbindungen im Migrat zu 7 und 28 % bestimmt werden. Mittels RP-HPLC/ESI-MS war es möglich, einige der phenolischen Verbindungen in diesen Migraten zu identifizieren. Dabei handelt es sich um nichtepoxidierte BPA-Derivate der Epoxidkomponente des Coatings, die aufgrund des BPA-Grundkörpers eine phenolische Hydroxylgruppe besitzen. Phenolische Vernetzungsprodukte beider Basisharze konnten dagegen nicht identifiziert werden. Die Menge an migrierenden phenolischen Verbindungen der beiden Epoxy-Phenol-Coatings konnte über die Kalibration eines niedermolekularen Epoxidharzes zu 0,1 mg/dm² bzw. 0,27 mg/dm² abgeschätzt werden. Während für einzelne phenolische Verbindungen gesetzliche Grenzwerte für die Migration bestehen, gibt es für Oligomere, mit Ausnahme von BPA keine spezifischen Migrationslimits. Ebenso sind in der Literatur kaum toxikologische Untersuchungen zu Phenololigomeren zu finden. Um einen ersten Einblick in die toxikologische Relevanz migrierender phenolischer Verbindungen zu erhalten, wurden mehrere kommerzielle als auch selbst synthetisierte phenolische Standardsubstanzen und verschiedene Molekulargewichtsfraktionen eines Phenolharzes, im Fischembryotest an Eiern des Zebrabärblings (Brachydanio rerio) nach DIN 38415-T647 und/oder Neutralrottest an Hep-G2 und HT-29 Zellen untersucht. Die stärksten Effekte im Fischembryotest bewirkte das Trimer BPM, hier reichte bereits eine Konzentration von etwa 2 mg/l aus, um 50 % der Fischembryonen letal zu schädigen. Im Gegensatz dazu waren beim Dimer 5-Hydroxymethyl-2,4´-dihydroxydiphenylmethan (M 230) mit einem EC50-Wert von 170 mg/l die geringste toxikologische Wirkung zu beobachten. Für alle anderen Subtanzen konnten EC50-Werte im Bereich 20 - 100 mg/l bestimmt werden. Tendenziell zeichnete sich dabei eine Zunahme der EC50-Werte mit steigender Lipophilie, ausgedrückt über den KOW-Wert ab, was auf den Aufbau der Fischeier zurückzuführen ist. So müssen die zu untersuchenden Xenobiotika mehrere lipophile Membranen durchdringen, um am eigentlichen Wirkungsort Einfluss auf die Embryonalentwicklung nehmen zu können. Im Zelltest konnten tendenziell ähnliche Ergebnisse ermittelt werden wie im Fischembryotest, wobei in der Regel die Hep-G2 Zellen empfindlicher reagieren als die HT-29 Zellen. Während für Phenol im untersuchten Konzentrationsbereich keine toxischen Effekte beobachtet werden konnten, liegen die EC50-Werte für das Trimer BPM, analog zum Fischembryotest deutlich unter 10 mg/l. Für die anderen Verbindungen wurden EC50-Werte zwischen 16 und 100 mg/l bestimmt. Analog zu den Untersuchungen der Einzelsubstanzen zeigte sich auch bei den 5 untersuchten Molekulargewichtsfraktionen zwischen 0 und 1000 Da, dass das toxikologische Potential im niedermolekularen Bereich (0 - 200 Da) gegenüber den Fraktionen 200 400 und 400 600 Da vergleichsweise gering ist. Bereits 25,1 mg/l bzw. 17,3 mg/l der Fraktionen 200 400 Da und 400 600 Da waren in den Tests ausreichend, um alle Embryonen letal zu schädigen. Im Molekulargewichtsbereich über 600 Da konnten dagegen lediglich subletale oder gar keine Missbildungen beobachtet werden. Analytik von Epoxiden In der amtlichen Überwachung beschränkt sich die Analytik von Epoxidverbindungen bisher auf die Bestimmung rechtlich geregelter Einzelsubstanzen. Eine Summenmethode zur Erfassung aller in einem Migrat enthaltenen Substanzen mit reaktionsfähigen Oxirangruppen, wodurch das gesamte Reaktionspotential erfasst werden kann, liegt dagegen nicht vor. Zur selektiven Erfassung aller oxirangruppenhaltigen Verbindungen wurde daher mittels statistischer Versuchsplanung eine Derivatisierung mittels Cysteamin entwickelt. Die Reaktion mit Cysteamin erfolgt dabei nach Abtrennung der Substanzen > 1000 Da mittels Größenausschlusschromatographie. Im Anschluss werden die Derivate durch Zugabe eines Kationenaustauschers aus der Lösung entfernt. Durch den Vergleich der RP-HPLC-FLD Chromatogramme vor und nach der Aufarbeitung können Substanzen mit intakten Oxirangruppen somit einfach erkannt werden. Eine quantitative Abschätzung der enthaltenen Epoxidverbindungen ist bei Lacken auf Basis von BPA-Harzen über die BPA-Chromophorkonzentration möglich. Bei der Untersuchung von 5 kommerziellen Coatings wurden in den einzelnen Migraten recht unterschiedliche Gehalte an Substanzen mit intakten Epoxidgruppen ermittelt. Ebenso ist die Anzahl der oxriangruppenhaltigen Verbindungen, auf die sich dieser Gehalt verteilt sehr unterschiedlich, was möglicherweise an unterschiedlichen Einbrennzeiten, -temperaturen aber auch der Menge an Lack pro m² und an der Art und Menge des Reaktionspartners liegt. Für die Konzentration der epoxidischen Verbindungen in den Coatingmigraten wurden Werte zwischen 18,5 und 835 µg/dm² bestimmt. Dies entspricht einem Anteil der reaktionsfähigen Substanzen an der Fraktion unter 1000 Da berechnet über die Flächen im Chromatogramm zwischen 2,6 und 76,3 %. Neben dem Einsatz als Basismaterial für Konservendoseninnenbeschichtungen werden Epoxidharzsysteme auch in Zubereitungen wie Grundierungen, Füllmassen, Lacken oder Klebstoffen für die Bauchemie vielfach in verschiedenen Mischungen (aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Glycidylether bzw. Siloxanglycidylether) eingesetzt. Durch den Kontakt dieser Materialien mit der Haut kann es zu Kontaktekzemen kommen, deren Ursache durch Epikutantests (Patchtests) mit den potentiell auslösenden Substanzen ermittelt werden kann. Der Umfang der in den Standardtestsystemen enthalten Testsubstanzen entspricht dabei jedoch nicht dem Spektrum der in der Industrie verwendeten Materialien. Über die genaue Zusammensetzung der in den Patchtest´s eingesetzten Materialien ist zudem wenig bekannt. Durch die Analyse einer Vielzahl von Patchtestsubstanzen und industriellen Epoxidkomponenten mittels RP-HPLC/UVD bzw. -ELSD Chromatographie und die Identifizierung der enthaltenen Verbindungen über RP-HPLC/ESI-MSD, konnte ein genaueres Bild über den Charakter dieser Materialen gewonnen werden. Bei den BPA- und BPF-Harzen wurden überwiegend Monomere, die entsprechenden Di- und Trimere aber auch dessen hydrolysierte Verbindungen identifiziert. Im Gegensatz dazu liegen bei den analysierten aliphatischen Produkten z. T. die reinen Glycidylether gar nicht oder nur in geringen prozentualen Anteilen vor. Vielmehr wird durch die sauer geführte Reaktion bei den aliphatischen Verbindungen die Bildung von 1,3 Chlorhydrinen als Nebenreaktion zur 1,2 Chlorhydrinbildung gefördert, wodurch eine beträchtliche Menge an Substanzen, die nicht verseifbares Chlor enthalten, in den Materialien vorhanden ist. Um die enthaltenen Verbindungen von aliphatischen und cycloaliphatischen Epoxidzubereitungen quantifizieren zu können, wurde eine Derivatisierung mit einem selbst synthetisierten Fluorophor (5-(Dimethylamino)-N-(2-mercaptoethyl)-1-naphthalen-sulfonamid) entwickelt. Dadurch konnten auch Verbindungen erfasst werden, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit mittels ELSD nicht detektierbar waren. Bei der Analyse von Handelsprodukten zeigte sich, dass die einzelnen Komponenten in ihrer Zusammensetzung gut mit den untersuchten aromatischen und aliphatischen Rohmaterialien vergleichbar sind. Bei entsprechend eingesetzten Patchtestsubstanzen spiegeln diese somit die Produkte gut wieder, mit denen die Patienten in Kontakt kommen.

The coastal areas are subject to multiple anthropogenic pressures including chemical pollution that can pose a real risk to the sustainability of aquatic species. The Arcachon Bay, macrotidal lagoon located on the French Atlantic coast, is the important ecosystem for oyster farming. But for several years, the oyster farms face lower recruitment and high mortality of oyster spat. Chemical contamination of the environment as a factor that may contribute to the observed effects on oysters has so far not been investigated.The present thesis aimed at evaluating through different approaches, of the potential toxicity of heavy metals and pesticides representative of the Arcachon Bay contamination on the early life stages of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Embryotoxicity, genotoxicity and expression levels of eleven targeted genes were studied. Firstly, different pesticides (S-metolachlor, irgarol, and diuron) and metals (copper and cadmium) were separately tested to determine their spectrum of effects. It were shown that exposure of gametes and embryos of oyster to environmental concentrations of pesticides and copper increased developmental abnormalities and DNA damage, and reduced fertilization success and affected offpring quality. Cadmium, meanwhile, showed no embryotoxic and genotoxic effects at the concentrations found in the Arcachon Bay. Metabolites of metolachlor, metolachlor ESA and metolachlor OA, are found in the Arcachon Bay at higher concentrations than their parent compound. The results showed that these metabolites were less embryotoxic and genotoxic on oyster embryos and spermatozoa than metolachor. Significant changes in expression of genes involved in antioxidant defense were observed for oyster larvae exposed to metolachlor and metolachlor ESA. Toxicity of mixtures of pesticides representative of the Arcachon Bay contamination with and without copper was then evaluated. Exposures of oyster embryos to these mixtures lead to development defects, DNA damage and changes in the expression of genes involved mainly in oxidative stress responses. Finally, mapping of toxicity of sediments from the Arcachon Bay was conducted for four seasons of 2011 with the oyster embryo-larvae assay. Sediments collected from Arguin exhibited low toxicity, regardless any season. In contrast, sediments from Le Tès showed higher toxicity in spring and summer seasons compared to winter season.From this work, it can be hypothesized that chemical contamination of the Arcachon Bay represents a threat for oyster reproduction and development.

Ein Großteil der Lebensmittel wird in der heutigen Zeit vor allem aufgrund ihrer langen Haltbarkeit in Konservendosen verpackt. Zur Qualitätserhaltung des Lebensmittels werden Weißblechdosen im Innenbereich in der Regel mit einer Lackierung versehen. Lackrohstoffe sind dabei u. a. Phenol- und Epoxidharze, die als Basis- oder Vernetzerkomponente eingesetzt werden. Bei der Herstellung und Lagerung dieser Lebensmittel kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Migration von Bestandteilen aus der Kunststoffinnenbeschichtung in das Füllgut kommt. Toxikologisch und somit auch analytisch sind dabei vor allem die migrierenden Verbindungen unter 1000 Da von Interesse, da Substanzen mit einer Molmasse von über 1000 Da nur zu weniger als 1 % im Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. Analytik von phenolischen Verbindungen Bei Untersuchungen zur Migration phenolischer Verbindungen unter Verwendung verschiedener Modellcoatings und Simulanzlösemittel wurden Konzentrationen an migrierenden phenolischen Substanzen in Summe bis 160 µg/dm² bestimmt, womit dieser Gehalt deutlich unter dem gesetzlichen Grenzwert für die Gesamtmigration von 10 mg/dm² liegt. Die Quantifizierung erfolgte dabei über SEC-FLD-Kalibriergeraden der für diese Coatings verwendeten Phenolharze. Tendenziell steigt dabei die Menge an übergehenden Verbindungen mit abnehmender Polarität der verwendeten Simulanzien. Ebenso abhängig vom Lösungsmittel ist die Molekulargewichts¬verteilung der im Migrat enthaltenen Phenole. So zeigte sich eine deutliche Verschiebung der phenolischen Verbindungen zu höheren Molekulargewichten mit abnehmender Polarität der Simulanzlösemittel. Mit wenigen Ausnahmen besitzen jedoch alle migrierenden Substanzen eine Molmasse von unter 1000 Da. Das beobachtete Migrationsverhalten kann u. a. auf die unterschiedliche Reaktivität der phenolischen Basismonomere der Harze zurückgeführt werden, wodurch die Fähigkeit variiert, unter den Einbrennbedingungen ein ausgeprägtes Netzwerk zu bilden. Zur näheren Charakterisierung der Phenolharze wurden einzelne Hauptverbindungen der RP-HPLC-FLD-Chromatogramme identifiziert. Über Derivatisierungsreaktionen mit Picolinsäure, Essigsäureanhydrid sowie Dansylchlorid konnten Informationen zur Anzahl an alkoholischen und phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül erhalten werden. Mit dem Wissen um die eingesetzten Phenolmonomere und einer eventuellen Veretherung konnten Strukturvorschläge erstellt werden. Die Quantifizierung der migrierenden phenolischen Verbindungen in Migraten kommerzieller Coatings in Summe wurde über eine universell anwendbare Kalibrierung angestrebt. Dazu wurden 17 verschiedene Phenolharze bezüglich der Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden, des mittleren Molekulargewichtes, der Hydroxylzahl und dem Verhältnis OH-Gruppen/Molekül charakterisiert. Wie erwartet steigt mit wenigen Ausnahmen die Anzahl der OH-Gruppen im Molekül tendenziell mit dem mittleren Molekulargewicht. Es zeigte sich zudem, dass die verschiedenen Phenolharze in ihren fluorophoren Eigenschaften stark variieren. Die Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden konnte zudem in keine Korrelation mit einem anderen ermittelten Parameter gebracht werden. Die Anwendung einer universellen Kalibriergerade zur Quantifizierung war deshalb nicht möglich. Die Größenordnungen der Migratkonzentrationen konnten daher nur über die zwei im Anstieg am stärksten variierenden SEC-FLD-Kalibriergeraden abgeschätzt werden. Bei der Analyse kommerzieller Epoxy-Phenol-Coatings war im Gegensatz zu Polyester-Phenol-Coatings die isolierte Detektion der phenolischen Verbindungen im Migrat mittels Fluoreszenz nicht möglich, da sowohl Epoxide als auch Phenole fluorophorer Eigenschaft besitzen. Es wurde daher eine Methode zur Abtrennung der Phenole von anderen im Migrat enthaltenen Subtanzen auf Basis eines Anionenaustauschermaterials entwickelt. Dabei wurde die Eigenschaft der Phenole genutzt, im basischen Milieu Phenolate zu bilden. Diese, aber auch Säuren adsorbieren am Austauschermaterial, während Epoxide oder Polyester nicht retardiert werden. Für zwei kommerzielle Epoxy-Phenol-Coatings konnte somit der Anteil an phenolischen Verbindungen im Migrat zu 7 und 28 % bestimmt werden. Mittels RP-HPLC/ESI-MS war es möglich, einige der phenolischen Verbindungen in diesen Migraten zu identifizieren. Dabei handelt es sich um nichtepoxidierte BPA-Derivate der Epoxidkomponente des Coatings, die aufgrund des BPA-Grundkörpers eine phenolische Hydroxylgruppe besitzen. Phenolische Vernetzungsprodukte beider Basisharze konnten dagegen nicht identifiziert werden. Die Menge an migrierenden phenolischen Verbindungen der beiden Epoxy-Phenol-Coatings konnte über die Kalibration eines niedermolekularen Epoxidharzes zu 0,1 mg/dm² bzw. 0,27 mg/dm² abgeschätzt werden. Während für einzelne phenolische Verbindungen gesetzliche Grenzwerte für die Migration bestehen, gibt es für Oligomere, mit Ausnahme von BPA keine spezifischen Migrationslimits. Ebenso sind in der Literatur kaum toxikologische Untersuchungen zu Phenololigomeren zu finden. Um einen ersten Einblick in die toxikologische Relevanz migrierender phenolischer Verbindungen zu erhalten, wurden mehrere kommerzielle als auch selbst synthetisierte phenolische Standardsubstanzen und verschiedene Molekulargewichtsfraktionen eines Phenolharzes, im Fischembryotest an Eiern des Zebrabärblings (Brachydanio rerio) nach DIN 38415-T647 und/oder Neutralrottest an Hep-G2 und HT-29 Zellen untersucht. Die stärksten Effekte im Fischembryotest bewirkte das Trimer BPM, hier reichte bereits eine Konzentration von etwa 2 mg/l aus, um 50 % der Fischembryonen letal zu schädigen. Im Gegensatz dazu waren beim Dimer 5-Hydroxymethyl-2,4´-dihydroxydiphenylmethan (M 230) mit einem EC50-Wert von 170 mg/l die geringste toxikologische Wirkung zu beobachten. Für alle anderen Subtanzen konnten EC50-Werte im Bereich 20 - 100 mg/l bestimmt werden. Tendenziell zeichnete sich dabei eine Zunahme der EC50-Werte mit steigender Lipophilie, ausgedrückt über den KOW-Wert ab, was auf den Aufbau der Fischeier zurückzuführen ist. So müssen die zu untersuchenden Xenobiotika mehrere lipophile Membranen durchdringen, um am eigentlichen Wirkungsort Einfluss auf die Embryonalentwicklung nehmen zu können. Im Zelltest konnten tendenziell ähnliche Ergebnisse ermittelt werden wie im Fischembryotest, wobei in der Regel die Hep-G2 Zellen empfindlicher reagieren als die HT-29 Zellen. Während für Phenol im untersuchten Konzentrationsbereich keine toxischen Effekte beobachtet werden konnten, liegen die EC50-Werte für das Trimer BPM, analog zum Fischembryotest deutlich unter 10 mg/l. Für die anderen Verbindungen wurden EC50-Werte zwischen 16 und 100 mg/l bestimmt. Analog zu den Untersuchungen der Einzelsubstanzen zeigte sich auch bei den 5 untersuchten Molekulargewichtsfraktionen zwischen 0 und 1000 Da, dass das toxikologische Potential im niedermolekularen Bereich (0 - 200 Da) gegenüber den Fraktionen 200 400 und 400 600 Da vergleichsweise gering ist. Bereits 25,1 mg/l bzw. 17,3 mg/l der Fraktionen 200 400 Da und 400 600 Da waren in den Tests ausreichend, um alle Embryonen letal zu schädigen. Im Molekulargewichtsbereich über 600 Da konnten dagegen lediglich subletale oder gar keine Missbildungen beobachtet werden. Analytik von Epoxiden In der amtlichen Überwachung beschränkt sich die Analytik von Epoxidverbindungen bisher auf die Bestimmung rechtlich geregelter Einzelsubstanzen. Eine Summenmethode zur Erfassung aller in einem Migrat enthaltenen Substanzen mit reaktionsfähigen Oxirangruppen, wodurch das gesamte Reaktionspotential erfasst werden kann, liegt dagegen nicht vor. Zur selektiven Erfassung aller oxirangruppenhaltigen Verbindungen wurde daher mittels statistischer Versuchsplanung eine Derivatisierung mittels Cysteamin entwickelt. Die Reaktion mit Cysteamin erfolgt dabei nach Abtrennung der Substanzen > 1000 Da mittels Größenausschlusschromatographie. Im Anschluss werden die Derivate durch Zugabe eines Kationenaustauschers aus der Lösung entfernt. Durch den Vergleich der RP-HPLC-FLD Chromatogramme vor und nach der Aufarbeitung können Substanzen mit intakten Oxirangruppen somit einfach erkannt werden. Eine quantitative Abschätzung der enthaltenen Epoxidverbindungen ist bei Lacken auf Basis von BPA-Harzen über die BPA-Chromophorkonzentration möglich. Bei der Untersuchung von 5 kommerziellen Coatings wurden in den einzelnen Migraten recht unterschiedliche Gehalte an Substanzen mit intakten Epoxidgruppen ermittelt. Ebenso ist die Anzahl der oxriangruppenhaltigen Verbindungen, auf die sich dieser Gehalt verteilt sehr unterschiedlich, was möglicherweise an unterschiedlichen Einbrennzeiten, -temperaturen aber auch der Menge an Lack pro m² und an der Art und Menge des Reaktionspartners liegt. Für die Konzentration der epoxidischen Verbindungen in den Coatingmigraten wurden Werte zwischen 18,5 und 835 µg/dm² bestimmt. Dies entspricht einem Anteil der reaktionsfähigen Substanzen an der Fraktion unter 1000 Da berechnet über die Flächen im Chromatogramm zwischen 2,6 und 76,3 %. Neben dem Einsatz als Basismaterial für Konservendoseninnenbeschichtungen werden Epoxidharzsysteme auch in Zubereitungen wie Grundierungen, Füllmassen, Lacken oder Klebstoffen für die Bauchemie vielfach in verschiedenen Mischungen (aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Glycidylether bzw. Siloxanglycidylether) eingesetzt. Durch den Kontakt dieser Materialien mit der Haut kann es zu Kontaktekzemen kommen, deren Ursache durch Epikutantests (Patchtests) mit den potentiell auslösenden Substanzen ermittelt werden kann. Der Umfang der in den Standardtestsystemen enthalten Testsubstanzen entspricht dabei jedoch nicht dem Spektrum der in der Industrie verwendeten Materialien. Über die genaue Zusammensetzung der in den Patchtest´s eingesetzten Materialien ist zudem wenig bekannt. Durch die Analyse einer Vielzahl von Patchtestsubstanzen und industriellen Epoxidkomponenten mittels RP-HPLC/UVD bzw. -ELSD Chromatographie und die Identifizierung der enthaltenen Verbindungen über RP-HPLC/ESI-MSD, konnte ein genaueres Bild über den Charakter dieser Materialen gewonnen werden. Bei den BPA- und BPF-Harzen wurden überwiegend Monomere, die entsprechenden Di- und Trimere aber auch dessen hydrolysierte Verbindungen identifiziert. Im Gegensatz dazu liegen bei den analysierten aliphatischen Produkten z. T. die reinen Glycidylether gar nicht oder nur in geringen prozentualen Anteilen vor. Vielmehr wird durch die sauer geführte Reaktion bei den aliphatischen Verbindungen die Bildung von 1,3 Chlorhydrinen als Nebenreaktion zur 1,2 Chlorhydrinbildung gefördert, wodurch eine beträchtliche Menge an Substanzen, die nicht verseifbares Chlor enthalten, in den Materialien vorhanden ist. Um die enthaltenen Verbindungen von aliphatischen und cycloaliphatischen Epoxidzubereitungen quantifizieren zu können, wurde eine Derivatisierung mit einem selbst synthetisierten Fluorophor (5-(Dimethylamino)-N-(2-mercaptoethyl)-1-naphthalen-sulfonamid) entwickelt. Dadurch konnten auch Verbindungen erfasst werden, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit mittels ELSD nicht detektierbar waren. Bei der Analyse von Handelsprodukten zeigte sich, dass die einzelnen Komponenten in ihrer Zusammensetzung gut mit den untersuchten aromatischen und aliphatischen Rohmaterialien vergleichbar sind. Bei entsprechend eingesetzten Patchtestsubstanzen spiegeln diese somit die Produkte gut wieder, mit denen die Patienten in Kontakt kommen.