Le Benzo(a)pyrène (B(a)P) est un hydrocarbure polycyclique aromatique (HAP). Il provient de la combustion incomplète de matériaux organiques, de la circulation automobile, du chauffage domestique, du tabagisme et de l'alimentation. Il est métabolisé principalement dans le foie. Il existe pour le B(a)P trois voies métaboliques : la monoxygenation, la voie des peroxydases et la voie des quinones. Une fois le B(a)P biotransformé, ses métabolites sont conjugués principalement au glutathion, au PAPS (3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate) et l'UDPGA (acide uridine 5'-diphosphoglucuronique). On connaît le pouvoir cancérogène et génotoxique du B(a)P, cependant, certains médicaments pourraient interférer dans une ou plusieurs voies métaboliques utilisées par ce dernier, voire même dans le processus de réparation de l'ADN lors de la formation d'adduits ADN-BPDE (BPDE : benzo(a)pyrène diol époxyde) chez l'humain. Les connaissances actuelles concernant le potentiel d'interactions des médicaments sur le pouvoir cancérogène du B(a)P restent minimes. Très peu d'information existe sur les interactions métaboliques entre le B(a)P et médicaments pouvant affecter le taux de formation des adduits à l'ADN. Les objectifs de cette étude consistent à mettre au point une méthode analytique spécifique pour mesurer le taux de formation d'adduits ADN-B(a)P et à l'appliquer pour identifier des médicaments susceptibles d'interférer dans ce processus. Pour cela, on incube des lignées cancéreuses d'hépatocytes humains (HepG2) pendant 6 h en présence de 30 µM de 7-10 14C B(a)P (doublement marqué en C7 et en C10) seul ou en présence du médicament à tester (la concentration du médicament = 10 x la concentration maximale plasmatique thérapeutique). La gamme de médicaments sélectionnée a un large spectre de consommation dans le monde. Cette gamme est composée de : l'acétaminophène, l'ibuprofène, l'acide acétylsalicylique, l'acide méfénamique, le naproxène, l'acide valproïque, le carbamazépine, le gliclazide et la théophylline. La mesure du taux de formation d'adduits à l'ADN s'est faite par détection radiométrique sur de l'ADN isolée. On a aussi comparé les taux d'adduits formés dans les échantillons témoins (exposé seulement au B(a)P) à ceux formés en présence de médicaments. A l'aide de la méthodologie développée, nous avons observé que pour certains passages de culture cellulaires (HepG2), l'ibuprofène augmente substantiellement le taux de formation d'adduit à l'ADN du B(a)P (jusqu'à 2.3 fois), alors que le naproxène et l'acide méfénamique ont plutôt un effet protecteur (jusqu'à 0.5 fois pour le naproxène et 0.7 fois pour le l'acide méfénamique). Ces résultats suggèrent que la consommation chronique de certains anti-inflammatoires non stéroïdiens pourrait augmenter (ibuprofène) ou diminuer (naproxène et acide méfénamique) le risque carcinogène. Ceci est la première étude qui se consacre à déterminer les interactions du B(a)P avec neuf médicaments. Des études plus poussées sur la cinétique de réparation de l'ADN et sur la caractérisation des différentes interactions aboutiraient à une meilleure évaluation du risque toxicologique du B(a)P. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Bezopyrene, interactions, adduits, AINS.

Le développement de méthodes alternatives à la culture in vivo pour l’évaluation de la toxicité des molécules chimiques s’est accéléré ces dernières années, l’objectif étant de limiter l’utilisation d’animaux. Préconisés par l’OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), ces modèles alternatifs visent à mimer les conditions physiologiques en employant des systèmes in vitro ou in silico. Parmi les différents systèmes développés, les biopuces microfluidiques ont prouvé leur contribution à l’amélioration des fonctions cellulaires, ce qui permet des études toxicologiques pertinentes. Les travaux de ce doctorat sont basés sur l’emploi de ces biopuces pour cultiver des hépatocytes (cellules du foie) et portent sur la mise au point d’une méthode d’analyse d’images issues de ces cultures sous microscope au cours du temps. L’acquisition d’images tout au long de l’expérience permet de suivre, après traitement, l’évolution et le comportement des cellules au contact de molécules chimiques et d’évaluer les réponses toxicologiques. Les premiers résultats de ces travaux ont permis l’amélioration du procédé de culture microfluidique adaptée au matériel d’acquisition d’images, la sélection de sondes fluorescentes, et le choix d’un algorithme de traitement des images sur CellProfiler. Cela nous a permis de quantifier et caractériser certaines fonctions biologiques au sein de la biopuce comme l’activité mitochondriale. Le potentiel de cet outil pour évaluer la toxicité de molécule a été testé grâce à l’emploi d’un toxique connu : la staurosporine. Les résultats obtenus ont révélé l’impact de la mise en culture en dynamique sur le comportement des hépatocytes, et la toxicité de la staurosporine visible en biopuce. / The development of alternative methods of in vivo cultures for the toxicological evaluation of chemical molecules has accelerated this last years, in order to limit the use of animals. Recommended by the OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), these alternative models are designed to mimic the physiological conditions using in vitro or in silico systems. Among the developed systems, microfluidic biochips have proven their contribution to the improvement of cellular functions, which allows relevant toxicological studies. This PhD thesis is based on the use of these biochips for hepatocytes culture and focus on the development of an analysis method for study these cultures under microscope over time using imaging. Image acquisition throughout the experiment enables to analyze, after image processing, the evolution and the behavior of cells in contact with chemical molecules and to evaluate toxicological responses. The first results of this work led to the optimization of the microfluidic cultures under the microscope used to get the image sequences, the selection of fluorescent probes and the development of an image processing system with CellProfiler. These works allowed the quantification and the characterization of some biological functions within the biochip such as the mitochondrial activity. Staurosporine, a well-known toxic, has been used to test the potential of this tool to evaluate the toxicity of molecules. The results showed the impact of dynamic culture on the hepatocytes behavior, and the staurosporine toxicity, in biochip cultures.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement de méthodes alternatives à la culture in vivo pour l'évaluation de la toxicité des molécules chimiques s'est accéléré ces dernières années, l'objectif étant de limiter l'utilisation d'animaux. Préconisés par l'OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), ces modèles alternatifs visent à mimer les conditions physiologiques en employant des systèmes in vitro ou in silico. Parmi les différents systèmes développés, les biopuces microfluidiques ont prouvé leur contribution à l'amélioration des fonctions cellulaires, ce qui permet des études toxicologiques pertinentes. Les travaux de ce doctorat sont basés sur l'emploi de ces biopuces pour cultiver des hépatocytes (cellules du foie) et portent sur la mise au point d'une méthode d'analyse d'images issues de ces cultures sous microscope au cours du temps. L'acquisition d'images tout au long de l'expérience permet de suivre, après traitement, l'évolution et le comportement des cellules au contact de molécules chimiques et d'évaluer les réponses toxicologiques. Les premiers résultats de ces travaux ont permis l'amélioration du procédé de culture microfluidique adaptée au matériel d'acquisition d'images, la sélection de sondes fluorescentes, et le choix d'un algorithme de traitement des images sur CellProfiler. Cela nous a permis de quantifier et caractériser certaines fonctions biologiques au sein de la biopuce comme l'activité mitochondriale. Le potentiel de cet outil pour évaluer la toxicité de molécule a été testé grâce à l'emploi d'un toxique connu : la staurosporine. Les résultats obtenus ont révélé l'impact de la mise en culture en dynamique sur le comportement des hépatocytes, et la toxicité de la staurosporine visible en biopuce.

La pollution de l'environnement, et particulièrement la pollution atmosphérique et son possible impact sur la santé humaine, suscite un intérêt grandissant dans les pays en voie de développement. Ce travail de thèse s'inscrit dans cette thématique et constitue une étude pionnière en Afrique, et au Bénin plus particulièrement. Nos résultats ont montré que l'essence utilisée à Cotonou était de piètre qualité, caractérisée par l'absence d'additifs et par une forte concentration en benzène, et pouvait être à l'origine de la dégradation de la qualité de l'air de la ville. De même, l'analyse d'échantillons de particules (PM₂․₅ et PM>₂․₅) prélevés dans le quartier de St Michel à Cotonou, a mis en exergue un taux anormalement élevé de particules en suspension dans l'air. La caractérisation physicochimique de ces particules a montré la présence d'un cocktail de composés chimiques (ions, métaux, COVs, paraffines, HAPs, etc.), en proportion plus élevées dans les particules fines PM₂․₅. L'appareil respiratoire constituant la principale voie d'exposition de l'Homme à ces particules atmosphériques, leur potentiel toxique a été évalué au travers d'une étude in vitro menée sur des cellules épithéliales bronchiques humaines (BEAS-2B). Il a été ainsi démontré les propriétés cytotoxiques des deux échantillons de particules ainsi que leur capacité à induire l'expression génique des enzymes de métabolisation des composés organiques et à générer un stress oxydatif. Le déclenchement du processus inflammatoire via l'induction de l'expression génique et la sécrétion protéique de cytokines et l'apparition de modifications dans la voie de l'acide arachidonique (leucotriènes, prostaglandine, thromboxane) ont été notés. Enfin l'approche comparative des PM₂․₅ prélevées au niveau de trois villes d'Afrique de l'Ouest a permis de mettre en évidence des caractéristiques proches au Bénin, en Côte d'Ivoire et au Sénégal et la contribution des émissions du trafic routier dans la pollution de l'air. / Air pollution and its adverse health effects have shown a growing interest in developing countries. This study deals with this subject and is one of the first conducted in African countries, particularly in Benin. Our results showed that the quality of gasoline used in cotonou was poor, characterized by the absence of additive and a high concentration of benzene. Thus, it could be responsible for the degradation of the city air quality. Therefore, particulate matter samples (PM₂․₅ and PM>₂․₅) were collected in St Michel neighborhood at Cotonou and results showed very high levels of particles in the ambient air. Physicochemical characterization of these particles revealed a presence of various chemicals compounds (ions, metals, VOCs, paraffins, PAHs, ect.) in higher proportion in PM₂․₅ than PM>₂․₅. The respiratory system, the main way of exposure to these airborne particles, was investigated through an in vitro study assessing the toxic potential of PM on human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). It has been demonstrated that the two types of particules have cytotoxic properties and ability to induce gene expression of organic compounds metabolizing enzymes and to generate oxidative stress. These particles have triggered the inflammatory process through the induction of gene expression and protein secretion of cytokines, and changes in the arachidonic acid pathway (leukotrienes, prostaglandin, and thromboxane). Finally, comparative approach for PM₂․₅ sampled in three West African cities highlighted the closeness of particles characteristics in Benin, Côte d'Ivoire and Senegal, and a significant contribution of road traffic emissions in the air pollution.

L’abeille fait partie des organismes non-cibles pour lesquels le risque présenté par les pesticides est évalué avant leur mise sur le marché. Actuellement, la procédure d’évaluation du risque chez l’abeille est remise en cause, notamment à cause du décalage qui existe avec l’état des connaissances scientifiques. Ce travail se focalise sur le cas précis de l’exposition des abeilles aux pesticides lors de pulvérisations. Le but étant d’identifier les points d’amélioration et de proposer des alternatives pertinentes à la procédure actuelle régissant l’homologation des produits phytopharmaceutiques.Tout d’abord, nous avons pu montrer qu’une grande variabilité de la DL50 pouvait exister en fonction des pesticides. Ceci nous a amené à proposer l’utilisation d’une nouvelle valeur toxicologique critique plus protectrice (BMD5). Dans un deuxième temps, c’est l’exposition des abeilles aux pesticides pulvérisés qui nous a intéressés. La surface d’exposition d’une abeille a été déterminée, permettant ainsi le calcul d’une dose d’exposition par individu sur la base des doses par hectare. Puis, le cas particulier d’une exposition aux pesticides via les ailes a été étudié révélant sa potentielle importance dans les scénarios d’exposition. Enfin, nous avons montré que l’abeille métabolise rapidement les pesticides contrairement à ce que le séquençage de son génome peut laisser penser.Ce travail apporte de nouveaux éclairages concernant l’évaluation du risque présenté par les pesticides chez l’abeille et souligne l’importance d’une évaluation pertinente à la fois de la toxicité des pesticides et de l’exposition pour l’établissement de rapports de risque pertinents. / The honey bee is both an animal of production and a polylectic pollinator. It is partly because of this double status that the honey bee is one of the non-target organisms for which the effects of pesticides are evaluated before they are placed on market. Today, the procedure of risk assessment in the honey bee is reconsidered, in particular because of the gap that exists with the scientific knowledgeThis work is focused on the special case of exposure of the honey bee subjected to pesticide sprays. The intended aim is to identify points that can be improved and to propose relevant alternatives to the current registration procedure of plant protection products. First, we showed that a great variability of the DL50 exists according to pesticides. This led us to propose the use of a more protective critical toxicicty value as reference (BMD5). Second, we were interested in the exposure to pesticides when the honeybee is subjected to pesticide sprays. The exposure surface area of a bee was determined allowing the calculation of an individual dose of exposure on the basis of field rates (g/ha). Then, we focused on the specific case of an exposure to pesticides through the wings and reveal its potential importance in the exposure assessment. Finally, we showed that the honey bee has a fast pesicide metabolism contrary to what the sequencing of its genome can let think. This work provides new insights concerning the pesticide risk assessment in honey bees and highlights the importance to perform a relevant assessment of the pesticide toxicity and exposure for the calculation of pertinent the hazard quotients.

Résumé : Depuis l'interdiction en 2013 des tests sur les animaux par le Règlement cosmétique n°1223/2009, différentes méthodes in vitro ont été développées. Toutefois, selon un consensus scientifique, aucune méthode ne peut couvrir à elle seule l’ensemble des événements clés (KE) définis pour la sensibilisation cutanée.Après un état de l’art des méthodes alternatives relatives à la sensibilisation cutanée, nous avons sélectionné et comparé 3 tests pour ensuite déterminer la meilleure stratégie à suivre. Dans le but de proposer un nouveau test intégré, nous avons adressé l’ensemble des KEs au sein d’un même type cellulaire. La cellule dendritique (DC) jouant un rôle clé dans le développement de la dermatite de contact allergique (DCA), notre choix s’est porté sur la lignée humaine pro-monocytaire THP-1. Nous avons étudié comme événements initiaux (KE1) les formes réactives à l’oxygène (FRO) et le glutathion (GSH), la voie Nrf2-Keap1 (voie centrale de détoxication) et l’expression génique pour le KE2, ainsi que les modifications phénotypiques pour le KE3.Nous avons montré que les allergisants forts induisent une production précoce des FRO associée à une réduction du GSH. Ils activent également la voie Nrf2-Keap1 et induisent l’expression des marqueurs de surface cellulaire CD54 et CD86, ainsi qu’une production de cytokines spécifiques (IL-8, IL-18,...).Pour conclure, ce travail a permis de proposer un test intégrant l’ensemble des mesures biologiques comme différents KE au sein d’un même type cellulaire. / Abstract : Since the animal testing ban in 2013 by Cosmetics Regulation n°1223/2009, various in vitro methods have been developed. However, according to a scientific consensus, no single method can stand-alone to cover the different key events (KE) defined for skin sensitization.After a state of the art of alternative methods relating to skin sensitization, we selected and compared 3 tests to determine the best strategy to follow. In order to propose a new integrated test, we wanted to address all KE within the same cell line. Because dendritic cell (DC) plays a key role in the development of allergic contact dermatitis (ACD), we have chosen the pro-monocytic human line THP-1. We have studied as initial events (KE1), reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH), Nrf2-Keap1 pathway (central detoxification pathway) and gene expression for KE2 as well as phenotypic modifications for KE3.We have shown that strong allergens are correlated with early production of FRO associated with GSH reduction. They also activate the Nrf2-Keap1 pathway and induce the expression of CD54 and CD86 cell surface markers as well as production of specific cytokines (IL-8, IL-18, etc.).To conclude, this work propose a new assay integrating all the biological measures as different KEs within the same cell.

Les scandales sanitaires ayant émaillé le médicament ont mis la sécurité d’utilisation au cœur des préoccupations des acteurs de santé. Tout au long de son cycle de vie, le médicament est susceptible d’exposition à des conditions de stress pouvant conduire à sa dégradation et potentiellement, à la modification du rapport bénéfice/risque. Ce problème est d’autant plus marqué en milieu hospitalier où les médicaments en post – AMM sont manipulés pour des besoins spécifiques des patients. Quid de la maîtrise des modifications de leurs microenvironnements ? Etendre son espace de connaissances est admis comme étant le meilleur moyen pour circonscrire ces phénomènes. Dans le cadre de ce projet doctoral, une stratégie d’étude du cycle de vie des médicaments en post – AMM a été mise en place afin de renforcer leur sécurité d’utilisation. Compte tenu de la place prépondérante des formes solides dans l’arsenal thérapeutique, le ticagrelor, un récent antiagrégant plaquettaire (AAP) présenté sous forme de comprimés, a été choisi pour cette étude. La première étape a consisté à l’utilisation des conditions de stress pour évaluer sa stabilité intrinsèque et l’élucidation structurale des produits de dégradations grâce au couplage LC-HR-MSn donnant accès aux compositions élémentaires. Les voies de dégradation ont été proposées et la sécurité des produits a été évaluée grâce à l’approche in silico. Par ailleurs, compte tenu de l’utilisation des AAP en association, dans la seconde partie de ce travail, l’extension de l’espace de connaissances du ticagrelor a permis d’envisager une stratégie de préformulation avec l’aspirine à l’état solide en utilisant des techniques complémentaires comme la LC-HR-MSn, la DSC, la DRX ou l’ATG. La formation d’un simple eutectique a été observée avec le mélange des deux principes actifs. Nous avons démontré que la dégradation du ticagrelor est liée à la décomposition de l’aspirine, modulée par les conditions environnementales. Le modèle d’étude du ticagrelor ouvre clairement des perspectives sur la maîtrise de la sécurité en l’élargissant à d’autres médicaments et pourra contribuer à leur recyclage approprié. / Tragedies caused by the misuse of pharmaceuticals have put the drug safety at the core of the concerns of healthcare providers. Throughout its life cycle, a drug may be subjected to environmental stresses, which can lead to its degradation. Thorough understanding about the susceptibility of a drug to degrade is an essential step to avoid it. This problem is in particular relevant in a hospital setting, where commercial drugs are usually applied to specific cases without a clear understanding of its limitations. As part of this PhD project, a life cycle study strategy for a commercial drug has been implemented in order to increase its safety in use. Given the prominence of solid forms in the therapeutic arsenal, ticagrelor, a recent antiplatelet agent (APA) in tablet form, was chosen for this study. The first step was devoted to the evaluation of the intrinsic stability and the structural elucidation of the degradation products making use of LC-HR-MSn, providing access to the elemental composition. Degradation pathways have been proposed and the safety of the products has been evaluated via an in silico toxicological approach. Furthermore because antiplatelet agents are often used in combination therapy, in the second part, a preformulation strategy with aspirin in the solid state has been studied using the complementary techniques LC-HR-MSn, DSC, PXRD, and TGA. The mixture of the two active pharmaceutical ingredients gave rise to a simple eutectic. We have demonstrated that the degradation of ticagrelor in these mixtures is closely related to the stability of aspirin, which is modulated by environmental conditions. The ticagrelor study provides a model for the safety management of other drugs and can contribute to their appropriate recycling.

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