Made available in DSpace on 2015-12-06T22:55:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) / O perfil de resistência a antimicrobianos e análise da diversidade genética foi analisado em 32 amostras de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) isoladas de infecção humana (n = 21) e das fezes de bovinos saudáveis (n = 11) e em 12 amostras de E. coli de origem humana isoladas de sítios extraintestinais, exceto uma delas isolada de diarréia. As amostras foram isoladas no Estado de São Paulo. Multiresistência (resistência a ≥3 grupos de antimicrobianos) foi observada tanto nas amostras de STEC (21/32 - 65,6%) como nas demais E. coli estudadas (8/12 - 66.7%). As amostras de STEC foram resistentes à tetraciclina (100%), seguida à estreptomicina (78,1%) e trimetoprim-sulfametoxazol (56,2%). Onze amostras de STEC resistentes a ampicilina carreavam a enzima β-lactamase TEM (blaTEM) e foram sensíveis a todas as cefalosporinas e quinolonas analisadas. As amostras de E. coli associadas a infecções intestinais e extraintestinais foram resistentes a um maior número de grupos de antimicrobianos. Foi observado resistência à estreptomicina (91,7%), tetraciclina (75%) e trimetoprim-sulfametoxazol (66,7%). Resistência à ampicilina (58,3%) foi também identificada. Três amostras de E. coli mostraram resistência a cefalosporinas de terceira geração, uma delas isolada de infecção intestinal carreava blaCTX-M-14 e blaTEM-1 e outra amostra isolada de secreção traqueal carreava blaCTX-M-15 e blaOXA-1. Cinco das 12 amostras de E. coli mostraram resistência à quinolonas. O gene da integrase associada ao integron classe 1 (intI1) foi encontrado em 6 (28,6%) das 21 amostras de STEC isoladas de humanos pertencentes ao sorogrupo O111 e em uma amostra isolada de bovino (9,1%) pertencente ao sorogrupo O118. Oito das 12 amostras de E. coli associadas a infecções intestinais e extraintestinais apresentaram intI1 e pertenciam a vários sorotipos. As amostras intI1 positivas carreavam plasmídeos com uma diversidade de tamanho, mas perfil plasmidial similar foi observado em algumas delas. O ensaio de hibridização indicou que intl1 estava localizado em plasmídeos em 5 das 7 amostras de STEC e em 6 das 8 demais amostras de E. coli. Análise dos integrons por PCR-RFLP revelou perfil idêntico em 4 amostras de STEC e em uma E. coli extraintestinal. Esses integrons tinham tamanho uniforme e continham o cassete gênico aadA1. O agrupamento filogenético mostrou que a maioria das amostras de STEC pertencia ao grupo B1, enquanto os grupos A, B2 e D foram observados entre as demais amostras de E. coli em 33,3%, respectivamente. Quatro amostras de E. coli isoladas de infecções extraintestinais foram denominadas como típicas E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). Entre as 44 amostras de E. coli estudadas 54,5% apresentaram serino-proteases autotransportadoras (SPATE). A toxina vacuolizante Vat foi identificada somente em 3 das 12 E. coli associadas a infecções intestinais e extraintestinais, e essas amostras apresentaram fímbria tipo 1, fator necrosante citotóxico, Alfa hemolisina e a adesina de membrana externa, Iha (100%, 8,3%, 8,3% e 25%, respectivamente). A tipagem por PFGE das amostras de STEC O111 e O118 mostrou uma diversidade de perfis, mas a maioria das amostras foi agrupada em um mesmo grupo (80% a 97% de similaridade). Por outro lado, a tipagem molecular confirmou que a maioria das amostras de E. coli associadas a infecções intestinais e extraintestinais era epidemiologicamente não relacionada (similaridade genética ≥80%), exceto 2 amostras de E. coli isoladas do mesmo paciente, no mesmo dia, e que apresentaram padrões de PFGE com similaridade de 93,3%. Os plasmídeos das amostras de E. coli associadas a infecções intestinais e extraintestinais carreando genes de resistência e/ou virulência, acarretaram um custo biológico de pequeno a neutro por geração, quando inseridos às amostras laboratoriais de E. coli. Em conclusão, apesar da aquisição de genes ter interferido pouco na capacidade das amostras de E. coli laboratoriais em se multiplicarem e consequentemente se disseminarem, a presença de integrons e de outros elementos genéticos móveis tanto em amostras de STEC como entre as amostras de E. coli extraintestinais é preocupante, principalmente em relação as amostras de E. coli extraintestinais considerando a provável aquisição de resistência a outros antimicrobianos, como recentemente descrito aos carbapenens. / Phenotypic and genotypic characterization of resistance to antimicrobials and genetic diversity were analyzed in 32 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) strains isolated from human infections (n = 21) and cattle feces (n = 11), and 12 human extraintestinal E. coli strains, except one isolated from diarrhea. The E. coli strains were isolated in Sao Paulo State. Multiresistance (resistance to ≥3 antimicrobial groups) was observed in both STEC (21/32 – 65.6%) and ExPEC strains (8/12 - 66.7%). The STEC strains were resistant to tetracycline (100%) followed by streptomycin (78.1%) and trimethoprimsulfamethoxazole (56.2%). The eleven STEC strains resistant to ampicilin possessed β-lactamase TEM (blaTEM) enzyme and all strains were susceptible to third-generation cephalosporins, and also to quinolones. On the other hand, E. coli strains associated with intestinal and extraintestinal infections were resistant to a larger number of antimicrobial groups than STEC. Resistance was observed to streptomycin (91.7%), tetracycline (75%) and trimethoprimsulfamethoxazole (66.7%). Resistance to ampicillin (58.3%) was also identified. Three E. coli strains were non-susceptible to third-generation cephalosporins, one isolated from diarrhea carried blaCTX-M-14 and blaTEM-1 whereas other, isolated from tracheal secretion, carried blaCTX-M-15 and blaOXA-1. Five of the 12 E. coli strains showed resistance to quinolones. Integrase associated with class 1 integron (intI1) was detected in six (28.6%) of the 21 human STEC strains belonging to O111 serogroup and in one (9.1%) bovine strain belonging to O118 serogroup. Eight of the 12 E. coli strains associated with intestinal and extraintestinal infections presented intI1 and belonged to various serotypes. The intI1-positive isolates carried plasmids showing a diversity of sizes, but similar plasmid profiles were observed in some strains. Southern blot hybridization assay with intI1-specific probe indicated that intl1 was located on plasmids in five out of the seven STEC strains and in six out of the eight E. coli strains. Analysis of integrons by PCR-RFLP revealed identical profiles in 4 STEC strains and in one extraintestinal E. coli strain. These integrons had a uniform size and contained a single gene cassette aadA1. The phylogenetic grouping showed that most of the STEC strains belonged to B1 group, while groups A, B2 and D (33.3%), respectively were observed among the other E. coli isolates. Four E. coli strains isolated from extraintestinal infection were classified as typical extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). Among 44 E. coli strains studied, 54.5% presented the Spate protease autotransporter. The Vat vacuolating toxin was identified only in 3 of the 12 E. coli strains associated with intestinal and extraintestinal infections, and these strains presented type-1 fimbriae, cytotoxic nectrotizing factor, alpha-hemolysin and the IrgA homologue adhesin, Iha (100%, 8.3%, 8.3% e 25%, respectively). PFGE analysis of O111 and O118 STEC strains showed a diversity of profiles, but most of the strains were grouped in the same cluster (80% to 97% of similarity). On the other hand, PFGE analysis revealed that most E. coli strains associated with intestinal and extraintestinal infections were epidemiologically unrelated, and were not grouped in any cluster with significant similarity (≥80%), except 2 E. coli strains, isolated at the same day from the same patient, and that presented PFGE patterns with similarity of 93.3%. The plasmids of the E. coli strains associated with intestinal and extraintestinal infections carrying resistance and/or virulence genes, resulted in a low or neutral biological cost per generation, when inserted into laboratory E. coli strains. In conclusion, despite the acquisition of genes has shown a low interference in the ability of laboratory E. coli strains to grow and consequently to spread, the presence of integrons and other mobile genetic elements in both STEC and E. coli associated with extraintestinal infections is worrisome, mainly in relation to extraintestinal E. coli strains considering the probable acquisition of resistance to other antimicrobials, as recently reported to carbapenems. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O consumo crescente de carne de aves requer uma contínua atenção na provisão de alimentos seguros para o consumidor. Entre os agentes emergentes de relevância para a Saúde Pública destaca-se a Escherichia coli produtora de Shiga toxina (STEC), causadora de severa colite hemorrágica e síndrome urêmica hemolítica. Apesar da importância deste microrganismo na carne de ruminantes, sua presença em carne de aves tem sido pouco investigada. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de STEC em carcaças de aves congeladas comercializadas na cidade de Xanxerê/SC. Um total de 246 carcaças adquiridas em oito supermercados da cidade, de acordo com a disponibilidade na gôndola, foi submetido à rinsagem individual com água peptonada tamponada 1% e submetida à enumeração de coliformes totais e Escherichia coli e pesquisa de STEC pelo protocolo descrito na ISO/TS 13136:2012(E). Após 24 horas de incubação de uma alíquota da rinsagem a 36°C, foi realizada a pesquisa de genes de virulência (stx1, stx2 e eae) por PCR multiplex. Das carcaças amostradas, a maioria era frango “in natura” (57%), seguidos de galinha (16%), galeto (15%), frango temperado (11%) e frango caipira (2%). A enumeração de coliformes totais no líquido de rinsagem resultou em mediana de 5,2 UFC.g-1 (variando de 1 a 2.836,1 UFC.g-1) e de Escherichia coli foi 0,6 UFC.g-1 (variando de 1 242 UFC.g-1), demonstrando uma qualidade higiênico-sanitária satisfatória do produto. Todos os líquidos de rinsagem originados das 246 carcaças avaliadas foram negativos para os genes stx1 e stx2, indicando ausência de STEC nas amostras. Em 12 carcaças (4,88%) foi confirmada a presença de E.coli eae+, indicando a presença do patotipo enteropatogênico (EPEC). Conclui-se que as carcaças de aves comercializadas em Xanxerê apresentam um padrão higiênico sanitário adequado e ausência de STEC considerando uma prevalência detectável de 1,5% na amostra analisada. Por outro lado, detectou-se a presença de EPEC, a qual deve ser investigada para caracterizar as cepas encontradas em termos de potencial importância para a saúde do consumidor. / The increasing consumption of poultry meat requires continued attention in the provision of safe food for the consumer. Emerging agents of relevance to Public Health include Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), which causes severe hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. Despite the importance of this microorganism in beef, its presence in poultry meat has been few investigated. The present study aimed to evaluate the occurrence of STEC in frozen poultry carcasses marketed in the city of Xanxerê/SC. A total of 246 carcasses purchased from eight city supermarkets, according to on-shelf availability, was submitted to individual rinsing with 1% buffered peptone water and submitted to enumeration of total coliforms and Escherichia coli and STEC detection by the protocol described in ISO / TS 13136: 2012 (E). After 24 hours of incubation at 36 ° C an aliquot of the rinsing, virulence gene (stx1, stx2 and eae) were investigated by multiplex PCR. Of the carcasses sampled, the majority were fresh poultry meat (57%), followed by chicken (16%), young chicken (15%), seasoned poultry meat (11%) and “caipira”type chicken (2%). The enumeration of total coliforms in the rinsing liquid resulted in a median of 5.2 CFU.g-1 (ranging from 1 to 2836.1 CFU.g-1). The median of Escherichia coli was 0.6 CFU.g-1 (ranging from 1 to 242 CFU.g-1), demonstrating a good sanitary and hygienic quality of the product. All rinse liquids from the 246 carcasses tested were negative for the stx1 and stx2 genes, indicating absence of STEC in the samples. In 12 carcasses (4.88%) the presence of E.coli eae + was confirmed, indicating the presence of the enteropathogenic pathotype (EPEC). It is concluded that the poultry carcasses marketed in Xanxerê have an good hygienic sanitary standard and absence of STEC considering a detectable prevalence of 1.5% in the sample analyzed. On the other hand, we detected the presence of EPEC, which should be further investigated to characterize the strains in terms of potential importance for consumer health.

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS

As Escherichia coli produtoras da toxina Shiga (STEC) são importantes patógenos humanos, causando desde diarréias até a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Há diversos sorotipos associados a SHU, tais como O157:H7 e O113:H21. No Brasil o sorotipo O113:H21 ainda não aparece associado a SHU, embora seja frequentemente isolado de carcaças e fezes bovinas. Nosso grupo já investigou comparativamente as redes de coexpressão gênica (RCG) de STEC EH41 (associado à SHU) e Ec472/01 (isolado de fezes bovinas). A análise comparativa do perfil transcricional de EH41 e Ec472/01 revelou que somente EH41 expressa um conjunto de genes que inclui o regulador transcricional dicA. A maioria destes genes está situada em um único módulo transcricional e podem estar associados a fatores de virulência. Assim, este trabalho centrou-se numa abordagem de biologia de sistemas, integrando análises genômica e fenotípica da resposta de enterócitos Caco-2 à EH41 e Ec472/01. A análise genômica baseou-se no estudo temporal de RCG para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade desses dois isolados. As alterações fenotípicas ocorridas nas células Caco-2 ao longo da exposição a cada um dos isolados de STEC foram visualizadas através de MEV. A análise genômica mostrou que o mecanismo molecular da resposta de Caco-2 durante a interação com EH41 ou Ec472/01 é claramente distinto. Nas redes do grupo Caco-2/EH41 as alterações topológicas incluíram a perda do status scale free e a sua recuperação, com o estabelecimento de uma nova hierarquia de genes na rede. Esses resultados se enquadram no modelo de redes para transição saúde-doença: a nova rede representa a resposta adaptativa da célula ao patógeno, o que não significa um retorno à normalidade. Já no grupo Caco-2/Ec472 as redes, após a perda do status scale free, não recuperam esse status até o final do período estudado, o que sugere um estado de transição mais prolongado para reorganização da hierarquia da rede. Mais ainda, através da caracterização dos módulos transcricionais, foi possível compreender dinamicamente os mecanismos moleculares envolvidos na resposta diferencial de Caco-2 aos dois isolados aqui estudados. STEC EH41 induz rapidamente a resposta inflamatória e apoptótica a partir da primeira hora de interação enterócito-bactéria. Por outro lado, células Caco-2 em contato com Ec472/01 ativam, a partir de uma hora, a fagocitose e, a partir da segunda hora, expressam moduladores da homeostase imune. A análise fenotípica das células Caco-2 mostrou, de forma nítida, uma maior destruição dos microvilos dos enterócitos em contato com EH41 do que com Ec472/01. Integrando os resultados genômicos e fenotípicos pode-se concluir que EH41 induz em Caco-2 - em comparação com Ec472/01 - maiores e mais rápidas alterações na expressão gênica global, além de uma resposta inflamatória e apoptótica excessiva, levando assim a alterações morfológicas mais pronunciadas nas células Caco-2. Em seu conjunto, esses resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das STECs associadas à SHU. Assim, as perspectivas de desenvolvimento deste trabalho deverão incluir a investigação de fatores de virulência e vias moleculares envolvidas na indução das respostas imunes que podem conduzir à SHU / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O113:H21 strains are associated with human diarrhea and some of these strains may cause hemolytic uremic syndrome (HUS). In Brazil O113:H21 strains are commonly found in cattle but, so far, were not isolated from HUS patients. Previously, our group conducted comparative gene co-expression network (GCN) analyses of two O113:H21 STEC strains: EH41, isolated from a HUS patient in Australia, and Ec472/01, isolated from bovine feces in Brazil. Differential transcriptome profiles for EH41 and Ec472/01 revealed a gene set exclusively expressed in EH41, which includes the dicA putative virulence factor regulator. GCN analysis showed that this set of genes constitutes an EH41 specific transcriptional module which may be associated to virulence factors. Therefore, in the present work a system biology approach was conducted to investigate the differential Caco-2 response - genomic and phenotypic - to EH41 (Caco-2/EH41) or to Ec472/01 (Caco- 2/Ec472) along enterocyte-bacteria interaction. The genomic analysis was based on temporal GCN data in order to gain a better understanding on the molecular mechanisms underlying the capacity to cause HUS. The phenotypic alterations in Caco-2 during enterocyte-bacteria interaction were assessed by scanning electronic microscopy (SEM). The genomic analysis showed that the molecular mechanism of Caco-2 response to EH41 or to Ec472/01 during enterocyte-bacteria interaction is clearly different. The GCN topological analyses for Caco-2/EH41 group revealed loss of the scale-free status after one hour of interaction, persistence of this condition along the second hour and establishment of a new gene hierarchy thereafter. These events resemble the network mechanism of health-disease transition. The new established network represents an adaptive cell response to the pathogen and not the return to a \"normal\" state. Conversely, the networks for Caco-2/Ec472 group showed a slow and progressive loss of the scale-free status without its restoration at the end of the time interval here studied. Through transcriptional module characterization it was possible to reveal the dynamic of the molecular mechanism involved in the Caco-2 differential responses to the STEC isolates. EH41 induces a rapid inflammatory and apoptotic response just after the first hour of enterocyte-bacteria interaction. Instead, the Caco-2 response to Ec472/01 is characterized by phagocytosis activation at the first hour, followed by the expression of immune response modulators after the second hour. SEM phenotypic analysis of Caco-2 cells along enterocyte-bacteria interaction showed more intense microvilli destruction in cells exposed to EH41, when compared to cells exposed to Ec472/01. The integration of genomic and phenotypic data allowed us to conclude that EH41, comparatively to Ec472/01, induces greater and precocious global gene expression alterations in Caco-2, what is related to excessive inflammatory and apoptotic responses. These responses are associated with the pronounced morphological alterations observed by SEM in Caco-2 cells exposed to EH41. Altogether, these results contribute for a better understanding of the molecular mechanism involved in STEC pathogenicity associated to HUS. Therefore, the future perspectives for the development of the present work should include the investigation of virulence factors and molecular pathways involved in the induction of immune responses leading to HUS