The plasma membrane (PM) of live cells has a striking phospholipid asymmetry between bilayer leaflets, yet the purpose of this fundamental structure remains elusive. It is also unknown whether and how this phospholipid asymmetry impacts on the lateral organization of the PM, such as microdomains or lipid rafts that are thought to facilitate specific protein-protein interactions. Here, we generated asymmetric giant unilamellar vesicles (GUVs) and found that microdomain formation is inhibited by outer leaflet very long acyl chain (24:0) sphingomyelin (SM), the primary sphingolipid species in mammalian cells. Interestingly, although cholesterol is believed to associate favourably with SM, molecular dynamic (MD) simulations of asymmetric membranes indicate a strong preference for cholesterol in the inner leaflet when 24:0 SM is in the outer leaflet, as well as, interdigitation of 24:0 SM acyl chain across the centre of the bilayer. We thus hypothesized that the outer leaflet-localized 24:0 SM interdigitates across the leaflets of the bilayer and facilitates cholesterol enrichment in the inner leaflet. Indeed, we obtained evidence that, in asymmetric unilamellar vesicles with 24:0 SM exclusively in the outer leaflet, 75-80% of cholesterol was partitioned into the inner leaflet, which was correlated with the disappearance of microdomains in GUVs. Importantly, in live cell PM, where 24:0 sphingolipids are the predominant species and exclusively in the outer leaflet, cholesterol was similarly enriched in the cytoplasmic leaflet. SM with shorter acyl chains such as 16:0, a minor species in mammalian cells, failed to generate cholesterol asymmetry and promoted microdomains in both symmetric and asymmetric GUVs. Furthermore, we generated live mammalian cells with either 16:0 or 24:0 SM and analyzed submicron domains in these cells, using density-dependent FRET of GPI-anchored proteins. Indeed, 16:0 SM cells are capable of forming submicron domains. The 24:0 SM cells, by contrast, are nearly devoid of submicron domains, as are unmodified control cells. Moreover, we silenced ceramide synthase 2 (CerS2), the enzyme that generates very long acyl chain sphingolipids. We found that silencing CerS2 alters diffusional properties of membrane proteins, consistent with enhanced microdomain formation. Together, our results establish a surprising and central role of very long acyl chain sphingolipids in regulating membrane lateral organization, including in the native plasma membrane, by creating cholesterol asymmetry. We propose that sphingolipid asymmetry functions to dynamically regulate microdomains in live cells.

In Bakterien werden Phospholipide auf der cytoplasmatischen Seite der Plasmamembran synthetisiert. Damit ein gleichmäßiges Wachstum und somit die Stabilität biogener Membranen, d.h. Membranen, an bzw. in denen Lipidsynthese stattfindet, gewährleistet ist, muss zumindestens die Hälfte neu synthetisierter Lipide auf die entgegengesetzte Membranhälfte gelangen. Aus früheren Untersuchungen ist bereits bekannt, dass dieser transversale Phospholipidaustausch, auch als Flip-Flop bezeichnet, sehr schnell, kopfgruppenunabhängig und möglicherweise proteinabhängig ist. Dennoch sind die genauen Mechanismen dieser Prozesse noch weitgehend unverstanden. Um die oben erwähnten grundlegenden Phospholipidtransportprozesse zwischen beiden Membranhälften genauer untersuchen zu können, wandten wir einen neuartigen, sogenannten stopped-flow BSA back-extraction Assay an. Mit Hilfe dieses Assays, waren wir in der Lage, die transversale Bewegung und die Verteilung von kurzkettigen, fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga über beide Membranhälften in ex vivo-Membranen zu charakterisieren. Der stopped-flow BSA back-extraction Assay basiert auf der Technik der stopped-flow-Spektroskopie und der Tatsache, dass BSA in der Lage ist, kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Lipidanaloga aus der äußeren Leaflet von (biologischen) Membranen zu extrahieren. Wir entschieden uns für invertierte Membranvesikel der Plasmamembran (IIMV) vom E.coli Wildtypstamm MG1655 als Untersuchungsobjekt, einerseits, weil diese Vesikel nur eine Membran besitzen und zum Anderen, weil IIMV sich sehr gut als Modell für den Flip-Flop von Phospholipiden nutzen lassen. Wir beobachteten, dass kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga der beiden am häufigsten in E.coli vorkommenden Phospholipide, Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerol (PG), sehr schnell, d.h. mit Halbwertzeiten von weniger als drei Minuten, über die Membran von IIMV verteilten. Weiterhin verhielten sich kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga von den E.coli-fremden Phospholipiden, Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylserin (PS), ähnlich wie die Analoga von PE und PG. Überraschenderweise, fanden wir heraus, dass alle oben genannten Phospholipidanaloga im Gleichgewichtszustand nicht gleichmässig über beide Membranhälften verteilt waren. Inwiefern Proteine an dieser transversalen Bewegung der Phospholipidanaloga beteiligt sind, sollten Messungen des Flip-Flop von Analoga an unbehandelten und mit Proteinase K inkubierten Vesikeln zeigen, die aus einem Detergenzextrakt von IIMV rekonstituiert wurden. Zunächst konnten wir zeigen, dass die schnelle Bewegung der Phospholipidanaloga über die Membran von rekonstituierten, nicht mit Proteinase K behandelten Vesikeln (Proteoliposomen) erhalten blieb. Nach Inkubation mit Proteinase K wurde jedoch der Flip-Flop von PE- und PG-Analoga vollständig inhibiert. Untersuchungen an rekonstituierten Serien von Proteoliposomen mit ansteigendem bakteriellen Proteingehalt zeigten, dass in Proteoliposomen ohne bakterielle Proteine kein Flip-Flop stattfand und somit nur 50% der fluoreszenten Analoga extrahiert wurden. In Proteoliposomen, die bakterielle Proteine enthielten, stieg das Ausmass der Extrahierbarkeit der untersuchten Analoga mit steigendem Proteingehalt. Diese Daten zeigten sehr deutlich, dass die transversale Bewegung von Phospholipiden über die innere Membran von E.coli durch Proteine vermittelt wird. Schlussfolgernd aus unseren Analysen konnten wir zeigen, dass die transversale Bewegung von Phospholipidanaloga über die Membran von IIMV sehr schnell, proteinabhängig, bidirektional und kopfgruppenunbhängig ist. Zur Identifizierung der molekularen Grundlagen der proteinvermittelten, schnellen Transversalbewegung von Phospholipiden über IIMV-Membranen, nutzen wir Ionenaustauschchromatografie. Zur unserer Überraschung mussten wir feststellen, dass in keiner der rekonstituierten Fraktionen eine nennenswerte Anreicherung der Flippaseaktivität auftrat. Möglicherweise sind mehrere Proteine, mit unterschiedlichen Nettoladungen, oder aber auch Untereinheiten, die sich nicht durch Anionenaustauscher trennen liessen, am Flip-Flop von Phospholipiden beteiligt. Weitergehende Analysen mit anderen Proteinfraktionierungsmethoden sind notwendig, um den oder die Flippasekomplex(e) zu identifizieren. / In the plasma membrane of bacteria, phospholipids are synthesized on the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane. To ensure balanced growth and thus, stability of biogenic membranes, half of the newly synthesized lipids must move to the opposing leaflet. It is known that this phospholipid transmembrane movement (flip-flop) is rapid, head-group independent and possibly protein mediated. However, the exact mechanism of this process remains elusive. To investigate these fundamental transbilayer phospholipid transport processes in biogenic membranes, a novel stopped-flow BSA back-exchange assay was utilized to characterize the transmembrane movement and transbilayer distribution of fluorescent labeled, short-chain phospholipid analogues in ex vivo membranes. This approach is based on stopped-flow fluorescence spectroscopy, and the fact that BSA is able to extract fluorescent labeled, short-chain phospholipid analogues from the outer leaflet of (bio)membranes. We chose isolated inverted inner membrane vesicles (IIMV) derived from E.coli wild type MG1655, both for their simple membrane organization and for their suitability as a simple model organism for phospholipid flip-flop. We observed that fluorescent-labeled, short-chain analogues of the major phospholipids in E.coli, phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), rapidly redistributed across the IIMV bilayer with half-times of less than three minutes. Furthermore, fluorescent, short-chain phospholipid analogues of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS), which are not naturally occurring phospholipids in E.coli membranes, behaved similar to the PE and PG analogues. To analyze the relevance of proteins for the transmembrane movement of fluorescent analogues, we measured flip-flop of phospholipid analogues in reconstituted and/or untreated and proteinase K treated vesicles generated from protein detergent extracts of IIMV. The amount of extractable fluorescent phospholipids analogues correlated with the amount of protein reconstituted into the proteoliposomes, strongly indicating, that protein concentrations below 100 µg/ml were not sufficient to equip every vesicle with proteins that facilitate the transmembrane movement of the fluorescent analogues. We found that the rapid transbilayer movement of phospholipid analogues across the membrane was maintained in untreated reconstituted vesicles. However, the flip-flop of fluorescent PG and PE analogues was eliminated in proteinase K treated vesicles. In conclusion, our analysis showed that the transmembrane movement of the phospholipid analogues across the membrane of IIMV was protein-mediated, very rapid, bi-directional and head-group independent. To identify the molecular basis of the protein-mediated, rapid transmembrane movement of phospholipids across IIMV membranes, we used ion exchange chromatography (IEC) to separate the IIMV proteins. To our surprise, we did not observe an enhanced flip-flop activity in any of the fractions, indicating that at least two proteins with possibly opposite net charges or several subunits, which were not separable by AEC, are involved. Further analysis using different protein separation techniques will be necessary to identify the putative flippase complex.