Les recherches menées au sein de notre laboratoire ont montré que la Nicotinamide Phosphoribosyltransférase (Nampt) est surexprimée lors de l’activation de plusieurs cellules immunes. Cette surexpression est surprenante si l’on considère que cette enzyme intervient dans le métabolisme de base de toute cellule (immune et non immune) en participant à la synthèse du cofacteur NAD. Au cours de ce travail, nous avons essayé de comprendre quelle est la contribution de cette enzyme aux fonctions immunes. Puisque les souris génétiquement invalidées pour le gène de la Nampt meurent à un stade embryonnaire précoce nous avons invalidé ce gène de façon conditionnelle uniquement dans les lymphocytes T et B. Nos résultats suggèrent que la délétion de la Nampt dans les cellules T et B compromet leur survie. De plus, nous avons testé l’effet d’un inhibiteur spécifique de la Nampt sur la sécrétion de TNF par des macrophages et des cellules dendritiques. Nos résultats montrent que l’inhibition de la Nampt s’accompagne d’une diminution du taux de NAD intracellulaire et, parallèlement, d’une réduction de la quantité de TNF synthétisé. De même, nous avons montré qu’en augmentant le taux de NAD cellulaire il est possible d’augmenter la quantité de TNF produit, ce qui laisse supposer que la capacité de la cellule à synthétiser du TNF serait directement liée à son contenu en NAD. Cette régulation semble impliquer une étape post-transcriptionnelle puisque l’ARNm du TNF ne paraît pas être affecté par ces traitements. Puisque le taux de NAD peut influencer directement l’activité d’enzymes NAD-dépendantes, et en particulier l’activité des enzymes de la famille des sirtuines, nous nous sommes demandés si une sirtuine était impliquée dans la synthèse du TNF. Une approche pharmacologique et une approche génétique nous ont permis de montrer que SIRT6 serait capable d’augmenter la production de TNF à une étape traductionnelle. Cette conclusion semble être confirmée par le fait que des cellules dendritiques dérivées de souris invalidées pour le gène SIRT6 produisent moins de TNF en réponse à un stimulus microbien par rapport à des cellules sauvages. En conclusion nos observations suggèrent la Nampt, en affectant le niveau intracellulaire de NAD, joue un rôle important dans le contrôle de la production du TNF par les cellules de système immunitaire

Les Corynebacteriales sont un groupe de bactéries qui comprend des pathogènes de l’Homme, comme les agents de la tuberculose, de la lèpre et de la diphtérie. Ces bactéries se distinguent pas une enveloppe atypique formée de peptidoglycane, lié covalemment à un polymére sacharidique, l’arabinogalactane, lui-même estérifié par des acides mycoliques. Les acides mycoliques sont une classe d’acide gras α-hydroxylés β-branchés qui peuvent être retrouvés soit sous forme “libre”, où ils estérifient du tréhalose, soit sous forme “liés”, où ils estérifient l’arabinogalactane. Les acides mycoliques sont transférés sur leurs accepteurs par une classe d’enzymes spécifiques, les mycoloyltransférases. Les acides mycoliques sont les composants majeurs de la membrane externe des Corynebacteriales (“mycomembrane”). Récemment, il a été démontré que les acides mycoliques peuvent aussi être transférés sur des protéines.Jusqu’à récemment, l’utilisation de la spectrométrie de masse n’avait permis d’identifier que 3 protéines mycoloylées. PorA et PorH sont de petites protéines (45 et 57 résidus) qui forment un pore hétéro-oligomérique dans la membrane externe, alors que la fonction de ProtX (38 résidus) n’est pas connue. La mycoloyltransférase MytC est essentielle pour la mycoloylation des protéines.Dans le but de mieux comprendre la généralité et le rôle de la mycoloylation des protéines, une de nos objectifs était de déterminer si d’autres protéines sont mycoloylées chez C. glutamicum et, si c’est le cas, de les identifier. Pour ce faire, nous avons développé, chez cet organisme, une méthode de marquage métabolique dans laquelle un analogue d’acide gras est utilisé pour marquer les acides mycoliques. Si incorporé, cette sonde pourra réagir avec un conjugué azido-biotine, permettant alors la détection et/ou l’enrichissement des protéines lipidés. Nos résultats montrent que PorA, PorH et ProtX peuvent être marqués spécifiquement par cet analogue et que le marquage est dépendant de la présence de MytC et de Pks13, une enzyme clé dans la synthèse des acides mycoliques. Ces résultats indiquent donc qu’un analogue d’acide gras peut être utilisé pour caractériser des protéines mycoloylées potentielles. En effet, deux autres candidats, PorB et PorC ont été testés par cette approche et répondent positivement dans le test. Dans le cas de PorB et PorC, la mycoloylation semble favoriser l’association à l’enveloppe. / Corynebacteriales are a group of bacteria that comprise human pathogens, including the agents of tuberculosis, leprosy, and diphtheria. These bacteria are distinguished by an atypical envelope formed of peptidoglycan bonded to the arabinogalactan saccharide polymer, itself esterified with mycolic acids. Mycolic acids are a specific class of α-hydroxylated β-linked fatty acids, they are found either in a so-called "free" form where they esterify trehalose, or in a "linked" form, where they are covalently bound to arabinogalactan. Mycolic acids are transferred to their acceptors through a specific class of enzymes, mycoloyltransferases. Mycolic acids are the major components of the outer membrane of Corynebacteriales called mycomembrane. Recently, mycolic acids were also found covalently attached to proteins in C. glutamicum.So far, using mass spectrometry, only 3 proteins have been identified as mycoloylated. PorA and PorH are small proteins (45 and 57 residues) forming a hetero-oligomeric pore in the outer membrane whereas the function of ProtX (38 residues) is still unknown. The mycoloyltransferase MytC is essential for protein mycoloylation.In order to gain insights in the extent and function of protein mycoloylation, one of our objectives was to determine whether other proteins are mycoloylated in C. glutamicum and if so, identify them. To do so, we developed in this organism a metabolic labeling approach in which a fatty acid chemical reporter is used to label mycolic acids. If incorporated, this reporter could react with an azido-biotin conjugate, allowing the detection and/or enrichment of lipidated proteins. Our results show that PorA, PorH and ProtX can be specifically labeled with such a reporter, and that this labeling is strictly dependent on the presence of MytC and Pks13, the key enzyme allowing mycolic acids biosynthesis. These results hence indicate that fatty acid chemical reporter can be used to characterize putative mycoloylated proteins. Indeed, two other candidates, PorB and PorC, were tested for mycoloylation using this approach and found to positively respond in the click-chemistry assay. In the case of PorB and PorB, mycoloylation appears to favor association to the envelope.

L'induction par un hôte d'un stress oxydatif chez un parasite représente l'une des stratégies de défense chimique les plus répandues. Chez les Brassicacées, famille de plantes comprenant des espèces à fort intérêt agronomique comme le chou ou le colza, ou d'intérêt scientifique comme Arabidopsis thaliana, le stress oxydatif peut être généré soit par des formes actives d'oxygène libérées au niveau de la zone d'agression lors du burst oxydatif soit par des molécules issues du métabolisme secondaire de la plante telles que les isothiocyanates (ITC). Bien que fortement exposé à un tel stress lors de l'infection, Alternaria brassicicola, champignon pathogène nécrotrophe inféodé aux Brassicacées, est capable d'accomplir son cycle parasitaire et donc de s'y adapter. Cette thèse met en évidence que la tolérance du champignon aux stress oxydatif est partiellement dépendante du métabolisme du mannitol qui participe à la résistance des conidies lors du burst oxydatif in planta ou à la protection contre les dommages intracellulaires des FAO générées par les ITC lors des phases précoces de l'interaction. Les travaux réalisés montrent également que la charge fongitoxique des dérivés des glucosinolates peut être inhibée par leur conjugaison au glutathion via des Glutathion-Stransférases (GST) spécifiques. L'altération du métabolisme du mannitol ou l'inactivation de ces GST diminue significativement le pouvoir pathogène d'A. brassicicola et la régulation de ces voies métaboliques est donc à considérer dans l'optique de développer de nouvelles stratégies de protection des cultures.

Le Ga1NAc est présent dans un grand nombre de glycoprotéines, protéoglycanes et glycolipides. Il est le sucre immunodominant des antigènes de groupes sanguins et oncofoetaux qui sont des cibles thérapeutiques. Cependant, la synthèse par voie chimique de ces glycoconjugués à Ga1NAc est longue et coûteuse. In vivo, le Ga1NAc est incorporé par des Ga1NActransférases, enzymes spécifiques qui transfèrent le Ga1NAc de l'UDP-GaINAc sur un substrat accepteur. Mais la synthèse chimio enzymatique des glycanes est freinée par l'obtention difficile de quantités importantes d'UDP-Ga1NAc.<br />Nous avons mis au point un système de synthèse chimio enzymatique de glycoconjugués à Ga1NAc qui utilise 4 enzymes et des substrats simples comme le Ga1NAc, l'UTP et la créatine-P. Ce système permet la synthèse rapide et efficace de glycopeptides et d'oligosaccharides à GaINAc ; il a été utilisé pour glycosyler l'antigène MUC1 et nous avons pu évaluer la réponse immunitaire murine contre la petite glycoprotéine obtenue.<br />Le système de synthèse d'UDP-Ga1NAc peut accepter certains dérivés de Ga1NAc et permettre ainsi la synthèse d'analogues d'UDP-Ga1NAc. Ces molécules sont des sondes appréciables pour étudier l'interaction entre substrats et enzymes par les techniques physicochimiques comme la STDNMR.

L'étude des champignons saprophytes tel que Phanerochaete chrysosporium est fondamentale car ces organismes, capables de dégrader la lignine, ont un fort potentiel en biotechnologie. Il a été démontré que la bactérie Sphingobium sp. SYK-6 possède des enzymes (ligE, ligF et ligG) appartenant à la famille des glutathion transférases (GST) qui successivement réduisent le lien éther (rôle éthérase) entre les unités de la lignine et déglutathionylent le produit dérivé conjugué (rôle lyase). Ce travail expose les relations entre la structure et la fonction des LigE, F et G de Sphingobium sp. SYK-6 et de deux classes de GST du champignon saprophyte Phanerochaete chrysosporium : une potentiellement liée aux éthérases (GSTFuA) et une potentiellement reliée aux lyases (GST Xi). Les structures cristallographiques des GSTFuA1, 2 et 3 de P. chrysosporium ont été résolues. L'analyse des modèles a permis de révéler une nouvelle classe structurale de GST avec des propriétés uniques. Ces caractéristiques ont pu être reliées à la fonction de ligandine et au profil catalytique de cette nouvelle classe de GST. Parallèlement, les études structurales des LigE et F de Sphingobium sp. SYK-6 sont en voie d'achèvement. La structure cristallographique de la GSTX1 de P. chrysosporium présente des caractéristiques structurales spécifiques qui nous ont conduit à la proposer comme leader d'une nouvelle classe structurale nommée Xi. L'enzyme ne présente pas d'activité lyase vis-à-vis des substrats des LigG, mais en revanche possède une fonction hydroquinone réductase (GHR). Parallèlement, la LigG a été étudiée, et s'apparente structuralement et fonctionnellement la classe Oméga des GST / Phanerochaete chrysosporium is a very interesting saprophytic fungus because it decays wood, by degrading lignin while leaving cellulose which is a renewable source of energy. The soil bacterium Sphingobium sp. SYK-6 possesses enzymes (LigE, LigF and LigG) that cleave the beta-aryl ether linkage of lignin model compounds. LigE and LigF are glutathione dependent enzymes that reduce the ether bond (etherase activity) and LigG catalyzes the elimination of glutathione (lyase activity). This study presents the structure-function relationships of Lig enzymes and of two new classes of GST from P. chrysosporium : one potentially related to LigE (GSTFuA) and one potentially connected to LigG (GST Xi). The crystallographic structures of GSTFuA1, 2 and 3 from P. chrysosporium were solved. The analysis of the models reveals a new structural class of GST with unique properties. These characteristics could be connected to the ligandin function and to the catalytic pattern of this new class of GST. In parallel, structural studies of LigE and LigF from Sphingobium sp. SYK-6 are nearly completed. The crystallographic structure of the GSTX1 from P. chrysosporium exhibits specific structural properties which allowed us to define a new structural class (Xi) in the GST superfamily. The enzyme is a S-glutathionyl-(chloro)hydroquinone reductase (GHR) that does not present a lyase activity with LigG substrate. In parallel, high resolution structure of LigG was obtained; this enzyme can be related structurally and functionally to the GST Omega class

Chez les plantes vasculaires, le métabolisme des phénylpropanoïdes conduit à la synthèse de précurseurs de biopolymères structuraux tels que la lignine, ainsi que de nombreux composés antioxydants et anti-UV. Ce métabolisme phénolique est apparu lors de la colonisation des terres par les plantes et a été critique pour leur adaptation à ce nouvel environnement. Physcomitrella patens, une bryophyte phylogénétiquement proche des premières plantes terrestres, est un bon modèle pour l'étude de certains caractères ancestraux. P. patens est dépourvue de lignine. En combinant des approches phylogénomique, génétique et biochimique, ce travail démontre le rôle essentiel de deux BAHD hydroxycinnamoyl tranférases dans le métabolisme phénolique de la mousse et la formation de précurseurs de la cuticule, une couche hydrophobe qui recouvre les parties aériennes de la plante et lui confère une imperméabilité. Il suggère également que deux hydroxycinnamoyl transférases sont requises pour la formation des composés phénoliques solubles accumulés par la mousse. Une exploration préliminaire du métabolisme des flavonoïdes chez ce modèle révèle d’autre part le caractère incomplet et primitif de cette voie métabolique. / In vascular plants, the phenylpropanoid metabolism leads to the synthesis of precursors of structural biopolymers such as lignin and of essential antioxidants and UV screens. The phenolic pathway leading to these compounds appeared upon plant land colonization and is thought critical for their adaptation to this new environment. Physcomitrella patens is a bryophyte, an early-diverging land plant and thus a good model to reveal ancestral traits. P. patens is devoid of lignin. Combining phylogenomic, genetic and biochemical approaches, this work demonstrates the essential role of two BAHD hydroxycinnamoyl transferases in the moss phenolic metabolism and in the formation of precursors of the cuticle, a hydrophobic layer, covering and conferring impermeability to the aerial parts of the plant. It also suggests that two nonredundant hydroxycinnamoyl transferases are required for the formation of the soluble phenolic compounds accumulated in moss. A preliminary exploration of the flavonoid metabolism in this model in addition reveals primitive features of this metabolic route.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le bois représente une des ressources en polymères les plus abondantes de l’écosystème terrestre. Les champignons dégradant la matière lignocellulosique jouent un rôle important dans le cycle du carbone. Ils présentent un fort intérêt au niveau biotechnologique en particulier pour la production d’enzymes. Parmi les champignons saprophytes, ceux de la classe des Agaricomycota sont particulièrement intéressants puisqu’ils possèdent la capacité de dégrader les différents composés du bois : cellulose, hémicelloloses et lignine. De plus, ces champignons ont développé un système de détoxication impliquant des enzymes telles que les glutathion transférases (GST). Celles-ci sont impliquées dans la dégradation de composés potentiellement toxiques générés lors de la dégradation du bois mais également la dégradation de xénobiotiques. L’étude des systèmes extracellulaires et intracellulaires de Trametes versicolor impliqués dans les processus de décomposition du bois, décrite dans ce manuscrit, avait pour objectif d’identifier les facteurs moléculaires impliqués dans l’adaptation des champignons à leur environnement. Les approches pluridiciplinaires mises en œuvre lors de cette thèse ont permis d’identifier une variabilité phénotypique intraspécifique chez une dizaine de souches de T. versicolor, cette variabilité semblant être liée à la nature de l’essence ligneuse d’origine de ces souches. De plus, les travaux réalisés sur les GSTs apparteant aux classes oméga et GHR ont contribué à améliorer nos connaissances sur l’implication de cette famille multigénique dans l’adaptation des champignons xylophages à leur mode de vie / Wood is one of the most abundant polymer resources of the Earth’s ecosystem. Wood decaying fungi play an important role in the carbon cycle. They have a strong interest in biotechnology level in particular for the production of enzymes. Among the saprophytic fungi, those of the class of agaricomycota are particularly studied since they possess the ability to degrade varous compounds from wood : cellulose, hemicelluloses dand lignin. In addition, these fungi have developed a detoxification system involving enzymes such as glutathione transferases (GST). These latter are involved in degradation of wood but also in the degradation of xenobiotics. In this manuscript, the study of extracellular and intracellular system from Trametes versicolor, involved in wood decay process is described, the main goal being to identify the molecular factors involved in adaptation of the to their environment. Multidisciplinary approaches used in this PhD led to identification of an intraspecific phenotypic variability among ten strains of T. versicolor, this variability appearing to be related to the tree species where these strains have been isolated. Moreover, the work done on GSTs belonging to GHR and omega classes have improved our knowledge of the involvement of this gene family in adaptating the wood decayers to thrit lifestyle