Abstract Acute myocardial infarction is a life-threatening condition that occurs as a result of reduced blood flow in the cardiac muscle, eventually leading to tissue damage. In infarcted areas, cardiomyocytes have insufficient ability to proliferate and replace the injured cells, which is associated with a deficient pumping capacity. A strictly regulated combinatorial interplay of transcription factors, e.g., GATA4, NKX2-5, TBX5, and MEF2C, orchestrates cardiac type gene expression during the cardiomyocyte differentiation and maturation processes. The aim of the present study was to (i) characterize the protein-protein interaction of the cardiac transcription factors GATA4-NKX2-5, (ii) evaluate the chemical agents that modify the synergy of GATA4-NKX2-5 in vitro, (iii) examine the capacity of the lead compound to promote myocardial repair in vivo after myocardial infarction and other cardiac injuries and (iv) study the structural features of the compound important for metabolism and cytotoxicity. Integration of the experimental mutagenic data with computational modeling suggests that the structural architecture of the GATA4-NKX2-5 interaction resembles the protein structure of the conserved DNA binding domain of nuclear receptors. Fragment-based screening, reporter gene-based optimization and pharmacophore searching were utilized to identify the most potent lead compound targeting the GATA4-NKX2-5 interaction: N-[4-(diethylamino)phenyl]-5-methyl-3-phenylisoxazole-4-carboxamide. This compound presented anti-hypertrophic effects in vitro and cardioprotective effects in vivo. In addition, structural analysis of the lead compound revealed the signature molecular features for metabolism and cytotoxicity. Current drug treatments are able to delay, but not prevent the progress of the heart failure; therefore, modulators of protein-protein interactions of key transcription factors may represent a novel class of pharmaceuticals for cardiac remodeling and repair. / Tiivistelmä Sydäninfarkti on henkeä uhkaava verenkierron häiriö, joka syntyy veren virtauksen äkillisen vähentymisen seurauksena sydänlihaksessa aiheuttaen kudosvaurion. Vaurioituneen sydänlihaskudoksen kyky uusiutua tai korvata kuolleet sydänlihassolut uusilla on puutteellinen, ja tämän seurauksena sydämen pumppauskyky heikkenee. Transkriptiotekijöiden GATA4, NKX2-5, TBX5 ja MEF2C muodostamat ja koordinoimat proteiinikompleksit säätelevät sydänsolujen geenien ilmenemistä solujen elinkaaren aikana. Väitöskirjatyön tavoitteena oli (i) karakterisoida geeninsäätelytekijöiden GATA4-NKX2-5 molekyylirakenteet ja niiden keskinäinen vuorovaikutus, (ii) seuloa kemiallisia yhdisteitä, jotka muokkaavat GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin aikaansaamaa geeniaktivaatiota, (iii) tutkia johtoyhdisteen vaikutuksia in vivo sydäninfarktia ja painekuormitusta kuvaavissa eläinmalleissa, ja (iv) tutkia johtoyhdisteen molekyylirakenteen yhteyttä yhdisteen metaboliaan ja sytotoksisuuteen. Väitöskirjatyö osoittaa molekyylimallinuksen ja kokeellisten tulosten perusteella, että geeninsäätelytekijöiden GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin orientaatio matkii tumareseptoriperheen DNA domeenin tertiäärirakennetta. Molekyylifragmenttien, lusiferaasi-reportterikokeen ja farmakoforimallin avulla seulottiin ja optimoitiin sitoutumisvoimakkuudeltaan lupaavin GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin toimintaan vaikuttava johtoyhdiste: N-[4-(dietyyliamino)fenyyli]-5-metyyli-3-fenyyli-isoksatsoli-4-karboksamidi. Johtoyhdisteellä havaittiin solu- ja eläinmalleissa hypertrofiaa estäviä vaikutuksia in vitro ja sydäntä suojaavia vaikutuksia in vivo. Väitöskirjatyö osoitti lisäksi aktiivisten molekyylien rakenneominaisuuksia, jotka keskeisesti vaikuttavat yhdisteiden metaboliaan ja sytotoksisuuteen. Nykyinen lääkehoito hidastaa, mutta ei pysäytä sydänlihasvaurioon liittyvän kroonisen sydämen vajaatoiminnan etenemistä. Lääkevaikutuksen kohdentaminen sydämen keskeisten transkriptiotekijöiden yhteisvaikutukseen avaa uuden mahdollisen tutkimuslinjan sydänlihasvaurion estossa ja korjauksessa.

Abstract Lung cancers and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are the most common smoking-related lung diseases and both have high mortality rate. Tight junctions (TJ) are apical junctions between epithelial cells that regulate the permeability of epithelium and form the tight junction along with occludin. Dysfunction of the TJ and dysregulation of TJ proteins leads to a loss of cell-cell adhesion and a loss of cohesion as well as epitheliomesenchymal transition. These increase invasion of lung carcinomas and possibly predispose to the exacerbations in COPD. Therefore, the aim of this thesis was to study expression and regulation of claudins in different lung carcinomas and COPD. Carcinomas expressed claudins 1, 2, 3, 4, 5 and 7 in different variations. Claudin 5 expression was weak in all carcinoma types. Strong claudin 1, 4 and 7 expression was associated with better survival in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. Claudin 3 expression was associated with COPD in large airways. Claudins 3 and 4 was found to be stronger in small airways of smokers and COPD patients than in non-smokers. Transcription factor snail had prognostic value in lung carcinomas. Negative snail expression was associated with longer life expectancy in lung carcinoma patients. Negative snail expression was associated with up-regulated claudin 5 and 7 expression, while strong expression was associated with low claudin 1 and 3 expression. Transcription factors slug and twist were inversely associated with claudins 3 and 4 in small and large airways. Slug expression was higher in non-smokers than in COPD patients and smokers. Transcription factor knockdown increased claudin expression in normal bronchial cell line. Except for claudin 2 and 7, which were decreased. Adenocarcinoma-like cell line was not affected by snail knockdown and in squamous cell carcinoma-like cell line claudin 3, 4 and 7 expression was increased. Transcription factor snail knockdown inhibited invasion of cell lines. Twist knockdown increased transepithelial resistance in normal bronchial cell line indicating higher barrier function in cell layer. / Tiivistelmä Keuhkosyöpä ja keuhkoahtaumatauti ovat yleisiä tupakoinnin aiheuttamia keuhkosairauksia, joissa on korkea kuolleisuus. Tupakointi aiheuttaa muutoksia keuhkojen epiteelisoluissa ja solujen välisissä liitoksissa. Tiivisliitokset solujen välillä säätelevät epiteelin rakennetta ja läpäisevyyttä. Klaudiinit ovat proteiineja, jotka muodostavat tiivisliitoksen yhdessä okkludiinin kanssa. Tiivisliitos proteiinien toimintahäiriöt voivat johtaa solujen välisten liitosten katoamiseen ja epiteelin hajoamiseen sekä epiteelisolujen muuntumiseen mesenkymaalisten solujan kaltaisiksi. Nämä seikat lisäävät invaasiota keuhkosyövissä ja saattavat altistaa pahenemisvaiheisiin keuhkoahtaumataudissa. Väitöskirjassa tutkittiin klaudiinien ilmentymistä ja säätelyä keuhkosyövässä ja keuhkoahtaumataudissa. Klaudiinien1, 2, 3, 4, 5 ja 7 esiintyminen keuhkosyövän histologisissa alatyypeissä vaihteli. Klaudiinien 1, 4 ja 7 voimakas ilmentyminen voitiin yhdistää pidempään elinikään potilailla, joilla oli levyepiteeli- tai adenokarsinooma. Klaudiini 3:n ilmentyminen liittyi keuhkoahtaumatautiin suurissa hengitysteissä. Klaudiinien 3 ja 4 voimakas ilmeneminen pienissä ilmateissä oli yleisempää keuhkoahtaumatautipotilailla ja tupakoitsijoilla kuin tupakoimattomilla henkilöillä. Transkriptiotekijä snailin puuttuminen keuhkosyövässä liittyi potilaiden pidempään elinaikaan. Klaudiinien 5 ja 7 ilmeneminen oli voimakkaampaa, kun snailin määrä oli vähäinen. Klaudiinien 1 ja 3 ilmeneminen väheni snail:in ollessa voimakas keuhkosyövässä. Traskriptiotekijöiden (slug ja twist) ilmeneminen liittyi käänteisesti klaudiinien ilmentymiseen pienissä ja suurissa ilmateissä. Slugin ilmeneminen oli voimakkaampaa tupakoimattomilla henkilöillä kuin tupakoivilla tai keuhkoahtaumatautia sairastavilla. Transkriptiotekijöiden snail, slug ja twist toiminnan estäminen lisäsi klaudiinien määrää normaaleissa keuhkon epiteelisoluissa. Poikkeuksen muodostivat klaudiinit 2 ja 7, joiden määrä väheni kun snail:in toiminta oli estetty. Adenokarsinooma-soluissa snailin estolla ei ollut vaikutusta, ja levyepiteelisyövän soluissa klaudiinien 3, 4 ja 7 määrä kasvoi. Snail myös vähensi solujen invaasiota. Transkriptiotekijä twistin toiminnan esto normaaleissa keuhkoepiteelisoluissa nosti solumaton läpi kulkevan sähkön resistenssiä, mikä on osoitus tiiviistä solujen välisistä liitoksista.

Abstract Cardiovascular diseases are the leading causes of death in the developed countries and their incidence is not expected to decrease in the future. There is a lifetime risk of one in five of developing heart failure, which still has poor prognosis and current treatments only cover part of the pathophysiology behind this syndrome. Pathological processes contributing to heart failure include cardiac hypertrophy and remodeling, which involves neurohumoral activation, reactivation of fetal genes, impaired Ca2+ cycling, increased apoptosis, and increased fibrosis. Intracellular signalling pathways and transcription factors mediating the response to various extracellular stresses have a key role in the regulation of myocardial remodeling and they are investigated in order to develop new approaches for the treatment of heart failure. The aim of this thesis was to elucidate roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and transcription factor GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function in cell cultures, and in hearts ex vivo and in vivo. The main findings were that (i) Inhibition of p38α MAPK enhanced function of sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase and thus cardiac contractility by increasing phosphorylation of protein phosphatase inhibitor-1 and phospholamban, (ii) p38 MAPK isoforms p38α and p38β regulated promoter activity of B-type natriuretic peptide via distinct pathways, (iii) p38α and p38β MAPKs also had different effects on gene expressions related to fibrosis and hypertrophy, and (iv) p38 and ERK1/2 MAPKs mediated stretch-induced activation of GATA-4 by phosphorylation at Ser 105. GATA-4 also seems to be regulated by ubiquitination. This study provides novel data of p38 MAPK and GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function. Inhibition of p38α MAPK could be beneficial in the treatment of heart failure. Also GATA-4 is a potential target for treatment of cardiovascular diseases. / Tiivistelmä Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa, eikä niiden ilmaantuvuus tule vähenemään lähitulevaisuudessa. Elinikäinen riski sairastua sydämen vajaatoimintaan on 20 %, ja sydämen vajaatoiminnan ennuste on edelleen huono. Nykyisillä hoitomuodoilla voidaan puuttua vain osittain sydämen vajaatoiminnan patofysiologisiin mekanismeihin. Sydämen vajaatoiminnan kehittymiseen liittyvät sydänlihaksen liikakasvu ja uudelleenmuovautumisprosessi, johon liittyy neurohumoraalinen aktivaatio, sikiöaikaisten geenien uudelleenilmentyminen, häiriöt solunsisäisessä Ca2+-viestinnässä sekä lisääntynyt ohjelmoitu solukuolema ja sidekudoksen muodostuminen sydämeen. Solunsisäisillä viestinvälitysketjuilla sekä transkriptiotekijöillä, jotka vastaavat solunulkoisten ärsykkeiden välittämisestä solun sisällä, on keskeinen rooli edellämainittujen prosessien säätelyssä. Uusien lähestymistapojen kehittäminen sydämen vajaatoiminnan hoitoon edellyttää myös solunsisäisen viestinvälityksen ja geenien säätelyn mekanismien selvittämistä. Tämän väitöstyön tavoite oli selvittää p38 mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja transkriptiotekijä GATA-4:n merkitystä sydämen vajaatoiminnan patogeneesissä soluviljelymalleissa. Päälöydöksiä olivat: (i) p38α MAPK -isoformin estäminen paransi kalsiumia solulimakalvostoon pumppaavan SERCA2a:n toimintaa ja sydänlihassolun supistumiskykyä lisäämällä fosfolambaanin ja proteiinifosfataasi-inhibiittori-1:n fosforylaatiota. (ii) p38 MAPK isoformit p38α ja p38β säätelivät B-tyypin natriureettisen peptidin geenin promoottorialuetta erillisten reittien kautta. (iii) p38α ja p38β isoformit vaikuttivat myös eri tavoin sydämen sidekudoksen muodostumiseen ja hypertrofiaan liittyvien geenien ilmentymiseen. (iv) p38 ja ERK1/2 välittävät venytyksen aiheuttaman GATA-4:n aktivaation fosforyloimalla seriini-105 fosforylaatiopaikan. Lisäksi GATA-4:n toimintaa säädellään ubiquitinaation avulla. Tämä tutkimus tuo uutta tietoa p38 MAPK:n ja GATA-4:n rooleista sydämen vajaatoiminnan kehittymisessä. p38α-isoformin toiminnan estäminen voisi olla hyödyllinen hoitomuoto sydämen vajaatoiminnassa. Myös GATA-4 on potentiaalinen lääkehoidon kohde sydänsairauksien hoidossa.