The continuing emergence of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis is threatening the ability to treat tuberculosis (TB) worldwide. The development of new anti-TB drugs requires new approaches and new drug targets. In this study, a mariner-based transposon, TnQuoVadis, was constructed to identify essential genes as potential drug targets. This transposon has an outward-facing anhydrotetracycline (ATc)-inducible promoter at each end. A mutant with TnQuoVadis inserted upstream of an essential gene may display normal growth in the presence of ATc, but exhibit no growth or severely diminished growth in the absence of ATc. TnQuoVadis was placed onto a vector with a temperature sensitive replication origin for more efficient mutagenesis of mycobacteria. In a preliminary genetic screen using the model organism Mycobacterium smegmatis, 13 mutants with ATc-dependent growth were identified. Identification of the insertion sites by cloning and sequencing indicated that there were nine genetic loci containing transposon insertions upstream of essential gene candidates in M. smegmatis. Further analysis of these genes indicated that many were previously known essential in both M. smegmatis and M. tuberculosis. These results demonstrate that TnQuoVadis and its delivery system can be utilized for the identification of essential genes in mycobacteria / Master of Science

Neste trabalho, foram desenvolvidas estratégias para modular a composição de elastômeros biodegradáveis da família dos polihidroxialcanoatos (PHA), produzidos por Pseudomonas, a partir de ácidos graxos ou óleos vegetais, para diversificar suas aplicações, sobretudo pela inserção de monômeros insaturados. A composição do PHA produzido variou com o tipo de ácido graxo fornecido e com sua proporção em misturas. Em genomas seqüenciados, detectaram-se dois genes fadH (codificador de 2,4-dienoilCoA hidratase) em P. aeruginosa e apenas um em outras Pseudomonas. Observou-se uma correlação entre o número de cópias de fadH no genoma e maior eficiência na oxidação de ácidos graxos insaturados. Mutantes afetados no metabolismo de ácidos graxos insaturados foram obtidos utilizando-se transposon, alguns destes mutantes apresentaram maior eficiência na incorporação de monômeros insaturados ao PHA. A clonagem e seqüenciamento de fragmentos de DNA interrompidos pelo transposon permitiram a identificação dos genes afetados nesses mutantes. / Different strategies were applied to modulate the composition of biodegradable elastomeric polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulated by Pseudomonas from fatty acids and plant oils, in order to improve the applications of this material, mainly by unsaturated monomer insertion. PHA composition varied both with fatty acid type and fatty acids ratio in mixtures supplied. Analysis of genome sequences revealed two fadH (encoding 2,4-dienoyl-CoA hydratase) copies in Pseudomonas aeruginosa and only one in other Pseudomonas species. The number of fadH copies in the genome was related to the higher oxidation of unsaturated fatty acids. Transposon-induced mutants affected on unsaturated fatty acids metabolism were obtained, some of them showing higher efficiency to incorporate unsaturated monomers do the PHA. Cloning and sequencing of transposon-disrupted DNA regions allowed to identify the genes affected in those mutants.

The work in this thesis is concerned with the study of bacterial adaptation on short and long timescales. In the first section, consisting of three chapters, I describe a recently developed high-throughput technology for probing gene function, transposon-insertion sequencing, and its application to the study of functional differences between two important human pathogens, Salmonella enterica subspecies enterica serovars Typhi and Typhimurium. In a first study, I use transposon-insertion sequencing to probe differences in gene requirements during growth on rich laboratory media, revealing differences in serovar requirements for genes involved in iron-utilization and cell-surface structure biogenesis, as well as in requirements for non-coding RNA. In a second study I more directly probe the genomic features responsible for differences in serovar pathogenicity by analyzing transposon-insertion sequencing data produced following a two hour infection of human macrophage, revealing large differences in the selective pressures felt by these two closely related serovars in the same environment. The second section, consisting of two chapters, uses statistical models of sequence variation, i.e. covariance models, to examine the evolution of intrinsic termination across the bacterial kingdom. A first collaborative study provides background and motivation in the form of a method for identifying Rho-independent terminators using covariance models built from deep alignments of experimentally-verified terminators from Escherichia coli and Bacillus subtilis. In the course of the development of this method I discovered a novel putative intrinsic terminator in Mycobacterium tuberculosis. In the final chapter, I extend this approach to de novo discovery of intrinsic termination motifs across the bacterial phylogeny. I present evidence for lineage-specific variations in canonical Rho-independent terminator composition, as well as discover seven non-canonical putative termination motifs. Using a collection of publicly available RNA-seq datasets, I provide evidence for the function of some of these elements as bona fide transcriptional attenuators.

Neste trabalho, foram desenvolvidas estratégias para modular a composição de elastômeros biodegradáveis da família dos polihidroxialcanoatos (PHA), produzidos por Pseudomonas, a partir de ácidos graxos ou óleos vegetais, para diversificar suas aplicações, sobretudo pela inserção de monômeros insaturados. A composição do PHA produzido variou com o tipo de ácido graxo fornecido e com sua proporção em misturas. Em genomas seqüenciados, detectaram-se dois genes fadH (codificador de 2,4-dienoilCoA hidratase) em P. aeruginosa e apenas um em outras Pseudomonas. Observou-se uma correlação entre o número de cópias de fadH no genoma e maior eficiência na oxidação de ácidos graxos insaturados. Mutantes afetados no metabolismo de ácidos graxos insaturados foram obtidos utilizando-se transposon, alguns destes mutantes apresentaram maior eficiência na incorporação de monômeros insaturados ao PHA. A clonagem e seqüenciamento de fragmentos de DNA interrompidos pelo transposon permitiram a identificação dos genes afetados nesses mutantes. / Different strategies were applied to modulate the composition of biodegradable elastomeric polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulated by Pseudomonas from fatty acids and plant oils, in order to improve the applications of this material, mainly by unsaturated monomer insertion. PHA composition varied both with fatty acid type and fatty acids ratio in mixtures supplied. Analysis of genome sequences revealed two fadH (encoding 2,4-dienoyl-CoA hydratase) copies in Pseudomonas aeruginosa and only one in other Pseudomonas species. The number of fadH copies in the genome was related to the higher oxidation of unsaturated fatty acids. Transposon-induced mutants affected on unsaturated fatty acids metabolism were obtained, some of them showing higher efficiency to incorporate unsaturated monomers do the PHA. Cloning and sequencing of transposon-disrupted DNA regions allowed to identify the genes affected in those mutants.

Die Gentherapie hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) besitzt das Potenzial, verschiedene erbliche, nur symptomatisch behandelbare, Erkrankungen dauerhaft zu heilen. Die Mehrheit der aktuell angewandten Verfahren dazu, basiert auf der Isolation von hämatopoetischen Stammzellen, der ex vivo Modifikation dieser Zellen durch retrovirale Vektoren und der Reinfusion der modifizierten Zellen in den immunsupprimierten Patienten. Dieser Ansatz ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden, unter anderem einem teilweisen Verlust des Rekonstitutionsvermögens der Stammzellen nach ex vivo Kultur oder der Gefahr der Transformation durch Integration des retroviralen Vektorgenoms. Darüber hinaus sind aktuelle Gentherapieansätze mit hohen Kosten und großem logistischem Aufwand verbunden, was den Zugang zu diesen Behandlungen für potentielle Patienten stark einschränkt. Die vorliegende Arbeit verfolgt einen neuen Ansatz zur Gentherapie von HSCs, der auf der Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark in den peripheren Blutstrom und der Transduktion dieser Stammzellen mit adenoviralen Vektoren basiert. Hierbei codieren die Vektoren sowohl ein Transgen als auch eine Integrationsmaschinerie. Der erste Teil der Arbeit belegt in einem humanen CD46-transgenen Mausmodell, dass adenovirale Vektoren der ersten Generation in der Lage sind, mobilisierte HSCs im Blut zu transduzieren und dass es den so transduzierten Stammzellen möglich ist, zurück ins Knochenmark zu migrieren und dort das Transgen zu exprimieren. Allerdings wurde im Verlauf von zwei Wochen ein Rückgang der Transgenexpression beobachtet. Um dies zu umgehen, wurde ein adenovirales Vektorsystem der dritten Generation genutzt, das eine hochaktive Sleeping Beauty Transposase, zum Zweck der Transgenintegration, codiert. Dieses System ermöglichte die stabile Genmodifikation mobilisierter hämatopoetischer Stammzellen nach intravenöser Injektion. Die Expression des Transgens konnte über längere Zeitspannen (bis 12 Wochen) beobachtet werden. Die modifizeirten Stammzellen waren darüber hinaus in der Lage, genmodifizierte Kolonien in vitro zu bilden und das hämatopoetische System letal bestrahlter Mäuse nach Knochenmarkstransplantation zu rekonstituieren. Es wurde somit gezeigt, dass HSCs nach in vivo Modifikation weiterhin funktional waren. / The gene therapy of hematopoietic stem cells holds the potential for curative treatment of several otherwise incurable inherited diseases. The majority of current gene therapy treatments relies on the collection of hematopoietic stem cells, their ex vivo modification with retroviral vectors and their transplantation into a myeloconditioned patient. This approach entails several disadvantages, including a reduction of stem cell engraftment potential after ex vivo culture and the potential danger of integrational mutagenesis. In addition, the high costs and complex logistics of this approach limit the access of patients to gene therapeutic regimens. This work explores an alternative approach to hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy, termed stem cell in vivo transduction. This approach is based on the mobilization of HSCs from the bone marrow into the peripheral blood and the transduction of the stem cells with adenoviral vectors delivering a transgene as well as a transgene integration machinery. In the first part of this work, it was shown that first-generation adenoviral vectors could be used for the transduction of mobilized HSCs in the periphery of human CD46-transgenic mice. Further, the transduced HSCs were able to home back to the bone marrow and express the transgene. However, over the course of 14 days, a loss of transgene expression in HSCs was observed. To ameliorate these shortcomings, helper-dependent adenoviral vectors encoding a hyperactive Sleeping Beauty transposase for transgene integration were used for stable gene modification of hematopoietic stem cells following intravenous vector administration in mobilized human CD46-transgenic mice. Using this improved vector platform, gene marking of bone marrow HSCs could be observed for extended periods of time (up to 12 weeks). Further, the functionality of the modified HSCs was demonstrated both in colony-forming progenitor assays as well as through the transplantation of gene-modified HSCs into lethally irradiated recipients. Transplantation of modified HSCsled to long-term multi-lineage reconstitution showing that gene-modified stem cells were fully functional. Subsequently the safety of systemic vector administration in mobilized hosts as well as of the Sleeping Beauty-mediated transgene integration was assessed in human CD46- transgenic mice. Lastly, the stem cell in vivo transduction approach was employed in NOG mice transplanted with human CD34+ cells, as well as in Macaca nemestrina non-human primates.

Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.

Pseudomonas putida produz PHA de cadeia média (PHAMCL) a partir de carboidratos e óleos vegetais. Genes de biossíntese de P3HB (poli-3-hidroxibutirato) de Ralstonia eutropha foram inseridos em P. putida IPT046 selvagem e mutantes PHA-. A expressão de phaC, codificador da PHA sintase, permitiu o acumulo de PHA com alto teor de 3HB, indicando que P. putida possui enzimas geradoras de 3HB. A expressão de phaB mostrou que seu produto canaliza 3HB e 3-hidroxihexanoato (3HHx) da <font face=\"Symbol\">&#946-oxidação para a PHA sintase. Ao expressar phaC em IPT461, afetado na PHA sintase, 30% de P3HB-co-3HHx-co-3HO foram produzidos a partir de carboidratos, mostrando que há vias metabólicas eficientes para suprir 3HAMCL, que são incorporados pela PHA sintase de R. eutropha. Usando transposon mini-Tn5, obtiveram-se mutantes deficientes na biossíntese de PHA a partir de glicose ou glicose e octanoato. Não se detectaram mutantes exclusivamente deficientes no acúmulo de PHA a partir de octanoato, indicando que diferentes produtos gênicos canalizam intermediários da <font face=\"Symbol\">&#946-oxidação para a síntese de PHA. / Pseudomonas putida produces medium-chain-length PHA (PHAMCL) from carbohydrates and plant oils. Recombinants harboring the P3HB (polyhydroxybutyrate) biosynthesis genes from Ralstonia eutropha were constructed on P. putida IPT046 wild type and PHA- mutants. Expression of phaC, encoding, PHA synthase, allowed the synthesis of PHA with high 3HB content, indicating that P. putida has enzymes to generate 3HB. Expression of phaB showed that its product channels 3HB and 3-hydroxyhexanoate (3HHx) from <font face=\"Symbol\">&#946-oxidation to the PHA synthase. When phaC was expressed on IPT461, affected in the PHA synthase, 30% P3HB-co-3HHx-co-3HO were accumulated from carbohydrates, showing that there are metabolic pathways efficient to supply 3HAMCL, which are incorporated by the R. eutropha PHA synthase. Using mini-Tn5 transposon, mutants deficient on PHA biosynthesis from glucose or glucose and octanoate were produced. No mutant deficient exclusively on PHA biosynthesis from octanoate was detected. Thus different gene products may channel intermediates from <font face=\"Symbol\">&#946-oxidation to PHA biosynthesis.

No description available.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477917 bytes, checksum: 4ab8f5cc2dd481acd067b02bd7abf32d (MD5) Previous issue date: 2012-01-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Colletotrichum is one of the most important genera of plant-pathogenic fungi in the world. The pathogenic species of this genus have hemibiotrophic lifestyle and cause diseases in several economically significant crops. Besides the economic importance, Colletotrichum has great significance as a model system for studying the molecular and cellular bases of fungal pathogenicity. The species C. graminicola, causal agent of corn anthracnose (Zea mays), has rare sexual stage and was the first species of the genus to have its genome completely sequenced. The transposable elements are ubiquitous and constitute a source of new mutations, being an important source of genetic variability. These elements are divided into two classes according to the presence or absence of an RNA intermediate in transposition. Elements of class I transpose via RNA intermediate, while class II elements transpose directly as DNA. The transposable elements can be applied as mutagenic agents aimed at the identification and labeling of genes and in phylogenetic and population studies. Given the importance of transposable elements in the generation of genetic variability and its applications in research, the aim of this study was to identify and characterize the class II transposable elements in the genome of C. graminicola. For this purpose, we used a bioinformatic approach combined with experimental activities. We identified 132 complete sequences of transposable elements in the sequenced genome of C. graminicola, which represent a significant proportion of the genome (0.47%). The elements were classified into six families according to similarity, all elements have characteristics of Tc1-mariner superfamily. Although some of these elements possess putative transposases with conserved DDE domain, all are interrupted by multiple stop codons. None of the elements identified has all the necessary features to be considered an active element. In silico analysis revealed evidence that these sequences are mutated by RIP (repeat point induced mutation) mechanism. TCg1 element was amplified by PCR from a Brazilian isolate and has imperfect terminal inverted repeats and the putative transposase sequence has three conserved domains characteristic of transposases: DDE, CENPB and HTH. However, this sequence is interrupted by stop codons and lacks the initiation codon and termination codon, therefore, is probably inactive. The genomic DNA from 49 different isolates were analyzed by hybridization with a probe derived from the inner region of TCg1 and different profiles were identified. The strategy allowed the efficient identification of a variety of Tc1-Mariner transposable elements degenerated by mutations characteristics of RIP in C. graminicola. It is unlikely that any of the identified elements is autonomous, however, these elements must have an important role in the genetic variability of this fungus. The TCg1 element is present in the genomes of different isolates of C. graminicola and has the potential to be used as a molecular marker in population analyzes. / Colletotrichum é um dos gêneros mais importantes de fungos fitopatogênicos em todo o mundo. As espécies fitopatogênicas desse gênero apresentam ciclo de vida hemibiotrófico e causam doenças em diversas culturas economicamente importantes. Além da importância econômica, Colletotrichum possui grande relevância como um sistema modelo para o estudo das bases celulares e moleculares da patogenicidade fúngica. A espécie Colletotrichum graminicola, agente causal da antracnose do milho (Zea mays), possui ciclo sexual raro e foi a primeira espécie do gênero a ter o seu genoma completamente sequenciado. Os elementos transponíveis são ubíquos e constituem uma fonte de novas mutações, sendo, portanto, uma importante fonte de variabilidade genética. Esses elementos são divididos em duas classes de acordo com a presença ou ausência de um intermediário de RNA na transposição. Os elementos da classe I se transpõem via intermediário de RNA, enquanto os elementos da classe II se transpõem diretamente como DNA. Os elementos transponíveis podem ser utilizados como agentes mutagênicos visando à identificação e etiquetagem de genes e em estudos filogenéticos e populacionais. Tendo em vista a importância dos elementos transponíveis na geração de variabilidade genética e as suas aplicações na pesquisa, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar elementos transponíveis da classe II no genoma de C. graminicola. Para tanto, foi utilizada uma abordagem de bioinformática (análises in silico) aliada às atividades experimentais. Foram identificadas 133 sequências completas de elementos transponíveis no genoma sequenciado de C. graminicola, que representam uma proporção relevante do genoma (0,47%). Os elementos foram classificados em 6 famílias de acordo com a identidade e apresentam características da superfamília Tc1-Mariner. Apesar de algumas transposases putativas codificadas por esses elementos possuírem domínio DDE conservado, todas estão interrompidas por vários códons de parada. Nenhum elemento identificado possui todas as características necessárias para um elemento autônomo. A análise in silico revelou evidências de mutações geradas pelo mecanismo de RIP (Mutação de ponto induzida por repetição). O elemento TCg1, amplificado por PCR a partir de um isolado brasileiro de C. graminicola, possui extremidades repetidas invertidas imperfeitas e a sequência putativa da transposase apresenta os três domínios característicos conservados: DDE, HTH e CENPB. Entretanto, essa sequência está interrompida por códons de parada e não foram localizados os códons de iniciação e de terminação, sendo, portanto, provavelmente inativa. O DNA genômico de 49 diferentes isolados foi analisado por hibridização com uma sequência derivada da região interna de TCg1 e apresentaram diferentes perfis. A estratégia utilizada permitiu uma identificação eficiente de uma variedade de elementos transponíveis Tc1-Mariner degenerados por mutações características de RIP em C. graminicola. É improvável que algum dos elementos identificados seja autônomo, entretanto, esses elementos devem possuir um importante papel na variabilidade genética desse fungo. O elemento TCg1 está presente no genoma de diferentes isolados de C. graminicola e possui potencial para ser utilizado como marcador molecular em análises populacionais.

Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.