Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-02T15:19:11Z No. of bitstreams: 1 Michelle Casal Fernandes.pdf: 12707205 bytes, checksum: 040075e6235acdaf47b50c64d61e086a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-02T15:19:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michelle Casal Fernandes.pdf: 12707205 bytes, checksum: 040075e6235acdaf47b50c64d61e086a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, representa um sério problema de Saúde Pública na América Latina, cujo tratamento clínico é insatisfatório. Nesse contexto, muitos esforços têm sido dirigidos para o desenvolvimento de novas drogas visando o tratamento desta doença negligenciada. Na medicina popular, produtos naturais ricos em naftoquinonas têm sido utilizados no combate de diferentes doenças parasitárias. Nosso grupo vem investigando a atividade de naftoquinonas e derivados sobre formas tripomastigotas de T. cruzi. No presente estudo, dentre 32 hidroxinaftoquinonas que tiveram sua atividade tripanocida avaliada, o composto 1C foi o mais ativo (IC50/24h=77,3 ±6,8 μM). Estudos prévios do nosso grupo com outra classe de derivados de naftoquinonas apontaram para a naftoquinona triazólica (NT) como um composto promissor, sendo esta mais ativa que a droga padrão benznidazol. Nesta dissertação, o mecanismo de ação de NT foi estudado, sendo observados danos ultraestruturais em epimastigotas como a ruptura dos reservosomos, blebbing da membrana flagelar, desorganização do Golgi, aparecimento de estruturas membranares concêntricas no citosol e parasitos anormais com múltiplos flagelos. Diferentemente do tratamento com outras naftoquinonas, NT não induziu alterações na mitocôndria, dado este confirmado pela análise do potencial de membrana mitocondrial (Δm) por citometria de fluxo. Pela mesma técnica, ainda foram demonstrados o efeito de NT no bloqueio da mitose e no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). O principal fenótipo induzido pelo tratamento com essa naftoquinona foi o aparecimento de perfis de retículo endoplasmático envolvendo organelas, que juntamente com o aumento da marcação com monodansilcadaverina (MDC) observado, sugere a autofagia como parte do mecanismo de ação tripanocida da NT. O T. cruzi apresenta-se em três diferentes formas evolutivas e durante seu ciclo de vida é exposto a condições físico-químicas adversas como variações no pH e escassez de nutrientes. A avaliação do efeito de tais condições se constituiu em um dos objetivos deste estudo. Análises por citometria de fluxo demonstraram que epimastigotas submetidos a estresse de pH e escassez nutricional apresentaram um aumento na produção de EROs, sendo também observada uma queda do Δm apenas após estresse de pH. A microscopia eletrônica de transmissão revelou um inchaço mitocondrial com desorganização das cristas, presença de estruturas membranares concêntricas citosólicas e no interior de organelas, perfis de retículo endoplasmático envolvendo estruturas subcelulares, perda de eletrondensidade dos reservosomos com invaginação da sua membrana e intensa vacuolização citoplasmática. Estes fenômenos característicos de autofagia, reforçados pela ausência de ruptura de membrana plasmática, de fragmentação do DNA e pelo aumento na marcação de MDC, indicam que esta via participa da resposta do protozoário aos diferentes tipos de estresses induzidos. / Chagas’ disease, caused by the protozoa Trypanosoma cruzi, represents a severe Public Health problem in Latin America, being its clinical treatment unsatisfactory. In this framework, several efforts have been directed for the development of novel drugs for the treatment of this negllected disease. In the folk medicine, natural products containing naphthoquinones have been employed for the treatment of different parasitic illnesses. Our research group has been investigating the activity of naphthoquinones and derivatives against T. cruzi bloodstream trypomastigotes. In the present study, among 32 hydroxinaphthoquinones, evaluated for their trypanocidal activity, compound 1C was the most effective (IC50/24h=77,3 ± 6,8 μM). Previous studies by our group with another naphthoquinones class of derivatives, pointed to the triazolic naphthoquinone (NT) as a promising compound, being more active than the reference drug benznidazol (IC50/24h=103,6 ± 0,6 μM). In this work, the mechanism of action of NT was also studied, being many ultrastructural damage described in epimastigotes such as the rupture of the reservosomes membrane, blebbing in the flagellar membrane, Golgi disruption, the formation of concentric membranous structures in the cytosol and the appearance of abnormal parasites with multiple flagella. Differently from the treatment with other naphthoquinones, NT did not induce mitochondrial alterations, data confirmed by mitochondrial membrane potential (Δm) by flow cytometry. By the same technique, it was also demonstrated the effect of NT on mitosis blockage and in the increase in reactive oxygen species (ROS) production. The main phenotype induced by the treatment with this naphthoquinone was the appearance of endoplasmic reticulum profiles surrounding organelles associated with the increase in monodansylcadaverine (MDC) labeling observed, suggests that autophagy is involved in the trypanocidal effect of NT. T. cruzi presents three different evolutive forms, and during its life cycle is exposed to adverse physico-chemical conditions such as pH variation and the shortage of nutrients, being the evaluation of the effect of these conditions one of the goals of this study. Flow cytometric analysis demonstrated that epimastigotes submitted to pH stress and nutritional scarcity presented an increase in ROS generation, being also observed a decrease in Δm detected only after the pH stress. The transmission electron microscopy revealed the mitochondrial swelling with crists disorganization, the formation of membranous concentric structures in the cytosol or inside organelles, the appearance of endoplasmic reticulum profiles surrounding subcellular structures, loss of reservosome electrondensity with the invagination of its membrane, and the intense citoplasmic vacuolization. Such characteristic phenomena of autophagy, reinforced by the absence of the plasma membrane rupture, DNA fragmentation and increase in MDC labeling, indicate that this pathway participates in the protozoa response to different types of induced stresses.

MAIA, Allan Rodrigo Soares. Detecção do DNA de Trypanosoma cruzi por PCR-MULTIPLEX em sangue de pacientes com suspeita de doença de chagas crônica e em dejetos de triatomíneos utilizados para xenodiagnóstico. 2012. 132 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-10T13:57:06Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_arsmaia.pdf: 16319469 bytes, checksum: 8f535bd4a6023cd28e1ae58d18a5c058 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-16T13:39:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_arsmaia.pdf: 16319469 bytes, checksum: 8f535bd4a6023cd28e1ae58d18a5c058 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-16T13:39:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_arsmaia.pdf: 16319469 bytes, checksum: 8f535bd4a6023cd28e1ae58d18a5c058 (MD5) Previous issue date: 2012 / A doença de Chagas é causada pelo parasito intracelular Trypanosoma cruzi e afeta em torno de 17 milhões de pessoas na América Latina. A fase crônica da doença caracteriza-se por baixo nível de parasitemia e alto nível de anticorpos Anti-T.cruzi e o diagnóstico é feito preferencialmente utilizando-se métodos sorológicos, incluindo imunofluorescência indireta (IFI), hemaglutinação indireta (HAI) e imunoensaio enzimático (ELISA). São testes que apresentam alta sensibilidade, mas sofrem de baixa especificidade, e um variável número de indivíduos apresenta testes sorológicos inconclusivos. Nos últimos anos, muitos estudos têm usado a tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar sequências de DNA de T. cruzi em sangue de pacientes chagásicos crônicos. A alta especificidade da PCR tem apontado para sua aplicação como método confirmatório no diagnóstico de pacientes com provas sorológicas inconclusivas. O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise comparativa entre a PCR e os métodos convencionais mais utilizados para o diagnóstico - sorologia e xenodiagnóstico, na detecção da infecção por T. cruzi, em indivíduos com doença de Chagas crônica. Sangue de 67 pacientes chagásicos crônicos, ambos os sexos, provenientes do ambulatório de doença de Chagas do Hospital Universitário Walter Cantídio, da Universidade Federal do Ceará, foram avaliados para T. cruzi, utilizando testes sorológicos (IFI, HAI e ELISA), PCR-Multiplex e xenodiagnóstico. Além disso, foi avaliado também a PCR-Multiplex em dejetos de triatomíneos provenientes do xenodiagnóstico destes pacientes. De acordo com o resultado dos testes sorológicos, os pacientes foram classificados em 3 grupos: 1°. Sorologia positiva (quando 2 ou 3 resultados dentre os 3 testes sorológicos foram positivos), 2°. Sorologia inconclusiva ou indeterminado (apenas 2 resultados foram negativos) e 3°. Sorologia negativa (quando os 3 resultados foram negativos). Dentre as 59 amostras com sorologia positiva foram obtidos 18 (30,5%) resultados positivos de PCR-Multiplex em sangue periférico e 41 (69,5%) resultados negativos. Nos PCR-Multiplex em dejetos de triatomíneos foram obtidos 20 (33,9%) resultados positivos e 39 (66,1%) resultados negativos. As 2 amostras com sorologia inconclusiva foram negativas na PCR-Multiplex, tanto em sangue periférico como em dejetos de triatomíneos. As amostras com sorologia negativa (n=6) apresentaram 2 resultados positivos (33,3%) na PCR-Multiplex em sangue e 4 resultados negativos (66,7%). Nos dejetos de triatomíneos, as 6 amostras com sorologia negativa foram negativas na PCR-Multiplex. Estes resultados mostraram que o ensaio da PCR-Multiplex em amostras de sangue periférico e em dejetos de triatomíneos, empregando iniciadores para regiões diferentes, no caso, DNA nuclear e DNA do cinetoplasto, podem ser aplicados para o diagnóstico da doença de Chagas crônica (mesmo com diferentes metodologias de extração de DNA total). Os dados mostraram também que a PCR-Multiplex em dejetos de triatomíneos é mais sensível que o ensaio do xenodiagnóstico.

CANUTO, J. A. Efeitos da Violaceína sobre as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi. 2016. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:37Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T12:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / The World Health Organization estimates that about 7 to 8 million people are infected with Trypanosoma cruzi in the world. Treatment of Chagas disease has limited efficacy and side effects that limit tolerability and patient compliance. The search for new therapeutic alternatives from bioactive substances has grown significantly in recent years. Violacein (VIO), a bacterial pigment produced by Chromobacterium violaceum has shown several biological actions, among them, antiulcer action, antitumor, antiviral, and antiparasitic. In this paper, we studied the effects of VIO on the evolutionary forms of Trypanosoma cruzi. Epimastigotes were cultured in LIT at 28 ° C in the presence of VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250 ; 500; 1000μM) for 24, 48 and 72 hours. The trypomastigotes were obtained after infection in LLC-MK2 cells resuspended in DMEM 2% FBS and incubated with VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31,25μM ) for 24h. amastigotes were cultivated on circular coverslips within culture plates containing LLC-MK2 cells and treated with violacein (4.97 and 9.94 mM). Cytotoxicity on LLC-MK2 mammalian cells was assessed using the MTT reduction assay, after incubation with VIO (3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250; 500μM ) for 24h. The evaluation of the process of cell death was made from the marking epimastigotes with 7AAD and Annexin V-PE after treatment with VIO (51.39 and 102,78μM). To determine the production of reactive oxygen species, epimastigotes were incubated with VIO (51.39 and 102,78μM). In determining the effect on the mitochondrial membrane potential, it was used Rhodamine 123 marker in epimastigotes treated with VIO (102,78μM). In epimastigotes, the substance showed trypanocidal action, with IC50 value of 51.39; 104.7 67,78μM and 24, 48 and 72h of treatment, respectively. In trypomastigotes, the IC 50 was 4,97μM in 24 hours. The analysis of amastigotes reduced the percentage of infected cells and the survival rate of these, at 24 and 48 hours at concentrations of 4.97 and 9.94 uM. In determining the cytotoxic effect on LLC-MK2, there was obtained an IC50 of 47,91μM. The analysis of the mechanisms of cell death allowed to infer that the VIO cause death in parasites predominantly by apoptosis. It was observed the production of reactive oxygen species (ROS), which can contribute to the aforementioned type of death. It was also observed a reduction in the mitochondrial membrane potential in the treated groups. All experiments were performed in triplicate (n = 3). For comparison of the experimental groups, the ANOVA was used, with post-test Dunnett, using p <0.05 as significance criterion. Thus, VIO presented trypanocidal effects on all of the evolutionary cycle of the parasite forms, suggesting involvement of reactive oxygen species and changes in mitochondrial membrane potential in the process of cell death by apoptosis. / A Organização Mundial de Saúde estima que aproximadamente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo Trypanosoma cruzi no mundo. O tratamento da doença de Chagas apresenta eficácia limitada e efeitos colaterais que limitam a tolerabilidade e a adesão dos pacientes. A busca de novas alternativas terapêuticas a partir de substâncias bioativas cresceu bastante nos últimos anos. A violaceína (VIO), um pigmento bacteriano produzido por Chromobacterium violaceum tem mostrado diversas ações biológicas, dentre elas, ações antiulcerogênica, antitumoral, antiviral e antiparasitária. No presente trabalho, estudamos os efeitos da VIO sobre as formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. As formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT, a 28°C, na presença de VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000μM) por 24, 48 e 72h. As formas tripomastigotas, foram obtidas após infecção em células LLC-MK2, ressuspensas em meio DMEM 2% de SBF e incubadas com VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25μM) por 24h. Formas amastigotas foram cultivadas em lamínulas circulares no interior de placas de cultura contendo células LLC-MK2 e tratadas com violaceína (4,97 e 9,94 μM). A citotoxicidade sobre células de mamíferos LLC-MK2 foi avaliada por meio do ensaio de redução do MTT, após incubação com VIO (3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500μM) por 24h. A avaliação do processo de morte celular foi feita a partir da marcação de formas epimastigotas com 7AAD e Anexina V-PE após tratamento com VIO (51,39 e 102,78μM). Para a determinação da produção de espécies reativas de oxigênio, formas epimastigotas foram incubadas com VIO (51,39 e 102,78μM). Na determinação do efeito sobre o potencial de membrana mitocondrial, foi utilizado o marcador Rodamina 123 em formas epimastigotas tratadas com VIO (102,78μM). Em formas epimastigotas, a substância demonstrou ação tripanocida, com valor de CI50 igual a 51,39; 104,7 e 67,78μM em 24, 48 e 72h de tratamento, respectivamente. Em formas tripomastigotas, a CI50 foi de 4,97μM em 24h. A análise sobre formas amastigotas reduziu o percentual de células infectadas e o índice de sobrevivência destes, nos tempos de 24 e 48h, nas concentrações de 4,97 e 9,94 μM. Na determinação do efeito citotóxico sobre LLC-MK2, obteve-se uma CI50 de 47,91μM. A análise dos mecanismos de morte celular permitiu inferir que a VIO causa morte nos parasitos predominantemente por apoptose. Foi observado a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que podem contribuir para o tipo de morte supracitado. Foi ainda observada a redução do potencial de membrana mitocondrial nos grupos tratados. Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3). Para comparação dos grupos experimentais, foi utilizado o teste estatístico ANOVA, com pós-teste de Dunnet, utilizando p<0,05 como critério de significância. Dessa forma, a VIO apresentou efeitos tripanocida em todas as formas do ciclo evolutivo do parasito, sugerindo envolvimento de espécies reativas de oxigênio e alterações no potencial de membrana mitocondrial no processo de morte celular por apoptose.

MENEZES, R. R. P. P. B. Efeito tripanocida do (-)-alfa-bisabolol sobre a cepa y de Trypanosoma cruzi. 2017. 140 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-22T13:04:55Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_rrppbmenezes.pdf: 4168282 bytes, checksum: 729abccf6685a2e429ae740a5713d070 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-22T13:05:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_rrppbmenezes.pdf: 4168282 bytes, checksum: 729abccf6685a2e429ae740a5713d070 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T13:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_rrppbmenezes.pdf: 4168282 bytes, checksum: 729abccf6685a2e429ae740a5713d070 (MD5) Previous issue date: 2017 / Chagas disease is a major public health problem, and the drugs available possess limited efficacy and great toxicity. In this way, there is a pungent need of new drugs. The aim of this work was to evaluate the trypanocidal effect of (-)-α-bisabolol (BIS) over the life forms of Trypanosoma cruzi and investigate its selectivity and mechanism of action. BIS cytotoxicity over mammalian cells was evaluated over LLC-MK2 cells, using MTT assay. BIS caused cytotoxic effect only at 1000 and 500 µM, with CC50 = 528 ± 34 µM. Then the antiparasitic effect was investigated over epimastigote, which demonstrated a progressive and time- and concentration-dependent effect, with IC50/24h = 285 ± 20 µM; IC50/48h = 144.7 ± 8.6 µM; IC50/72h = 97.33 ± 3.25 µM; e IC50/96h = 59.8 ± 4.5 µM. Over trypomastigotes, BIS caused effect at all tested concentrations, with LC50 = 20 ± 3.84 µM. Using CC50 and LC50 values, selectivity index was estimated at 26.5. BIS also presented antiamastigote activity, with decrease on the percentage of infected cells, the number of amastigotes per infected cells and survival index. Besides, BIS caused its effects even when incubated by few time periods, as shown by growth recovery experiments. By flow cytometry, it was demonstrated that BIS trypanocidal effect was associated with apoptosis induction, increase on reactive oxygen species and loss of mitochondrial transmembrane potential. Also, swelling of reservosomes was present al late stages. Scanning electronic microscopy evaluation showed parasites with loss of typical format and with membrane pores. Finally, the interaction of BIS with tcGAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from T. cruzi) was evaluated by both theoretical and experimental methods. Docking simulation demonstrated possible interaction between tcGAPDH and BIS, which it was confirmed by enzymatic assay. In conclusion, it was demonstrated that BIS possess antiparasitic effect over Trypanosoma cruzi strain Y life forms, with possible induction of apoptosis and oxidative stress. Also, inhibition on tcGAPDH appears to be associated with this effect. / A doença de Chagas constitui um importante problema de saúde pública, e os fármacos disponíveis para tratamento apresentam eficácia limitada e efeitos colaterais importantes. Assim, há necessidade de novas estratégias terapêuticas eficazes e seguras. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial tripanocida do (-)-α-bisabolol (BIS) sobre as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi e investigar sua seletividade e mecanismo de ação. A citotoxicidade de BIS foi avaliada em células LLC-MK2 pelo método do MTT. BIS causou efeito citotóxico nas duas maiores concentrações testadas, com CC50 = 528 ± 34 µM. Foi investigado o efeito de BIS sobre epimastigotas, que demonstrou efeito progressivo e dependente de tempo e concentração, com IC50/24h = 285 ± 20 µM; IC50/48h = 144,7 ± 8,6 µM; IC50/72h = 97,33 ± 3,25 µM; e IC50/96h = 59,8 ± 4,5 µM. Em tripomastigotas, BIS causou efeito em todas as concentrações, com LC50 = 20 ± 3,84 µM. A partir dos valores de CC50 e LC50 obtidos, foi estimado índice de seletividade de 26,5. BIS também apresentou efeito antiamastigota, com redução do percentual de células infectadas, da contagem média de amastigotas/células infectadas e do índice se sobrevivência. Além disso, foi observado efeito antiparasitário em pequenos períodos de tempo, através do ensaio de recuperação de crescimento. Por citometria de fluxo, foram observadas alterações sugestivas de morte celular por apoptose, com aumento das espécies reativas de oxigênio citoplasmáticas e redução do potencial transmembrânico mitocondrial. Adicionalmente, foi observado hipertrofia de reservossomos de forma tardia. Por microscopia eletrônica de varredura, foram observadas algumas alterações ultraestruturais, como alteração no formato típico e aparecimento de poros. Finalmente, foi avaliado o potencial de inibição da enzima tcGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de T. cruzi). O estudo de docking demonstrou possível interação entre BIS e o sítio catalítico de tcGAPDH. A confirmação foi realizada por ensaio colorimétrico. Em conclusão, o (-)-α-bisabolol apresenta efeito antiparasitário sobre as formas evolutivas de T. cruzi, com possível indução de apoptose e stress oxidativo. Além disso, a inibição da enzima tcGAPDH parece estar associada ao efeito biológico encontrado.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000002.pdf: 934978 bytes, checksum: 6130fb3c5d45076149e34df39e1d2d14 (MD5) Previous issue date: 2006 / (...) nos propomos analisar a relação entre a resposta imune celular de pacientes chagásicos, após estímulo in vitro de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com os antígenos recombinantes CRA (Cytoplasmatic Repetitive Antigen) ou FRA (Flagellar Repetitive Antigen) de Trypanosoma cruzi, e as formas clínicas crônicas da doença de Chagas. O grupo de pacientes chagásicos consistiu de 36 indivíduos (...). Um grupo de 19 indivíduos não chagásicos (NC) foi incluído como um grupo controle. PBMC foram isoladas por centrifugação através de um gradiente de densidade de Ficoll-Paque. As células foram estimuladas com Fitohemaglutinina, Concanavalina, CRA, FRA ou com antígeno solúvel de Epimastigota (Ag-Epi) por 24h, 72h ou 6 dias. Culturas sem estímulo foram utilizadas como controles negativos. A proliferação celular foi avaliada após estímulo por 6 dias de cultivo através da quantificação de 3 H-timidina incorporada. As citocinas foram detectadas em sobrenandantes de cultura obtidos após 24h (TNF-a e IL-4), 72h (IL-10) e 6 dias (IFN-g) através de ELISA de captura. Os resultados mostraram que apesar de apresentarem índices de estimulação baixos, as células dos pacientes chagásicos estimuladas com os antígenos recombinantes apresentaram maiores respostas proliferativas quando comparados com as dos indivíduos NC. Porém, não foi possível estabelecer um padrão de resposta linfoproliferativa entre os pacientes portadores das formas clínicas FC e FI da doença. Com relação às citocinas secretadas no sobrenadante de cultura após estímulo com antígenos de T. cruzi, os resultados mostraram que CRA, bem como Ag-Epi, foram capazes de estimular a produção de TNF-a e IFN-g em pacientes chagásicos quando comparado aos indivíduos NC. Porém, os níveis dessas citocinas mostraram-se similares entre os pacientes chagásicos portadores das formas clínicas FC e FI. Apesar de não apresentarem a capacidade de diferenciar as formas clínicas da doença de Chagas através do ensaio de linfoproliferação e da detecção de citocinas de sobrenadante de cultura por ELISA, os antígenos poderiam ser utilizados em estudos sobre a imunopatogênese da doença, investigando papéis imunorregulatórios antígeno-específicos. Além disso, esses antígenos poderiam dar continuidade ao desenvolvimento de marcadores de evolução de prognóstico das formas clínicas severas da doença de Chagas através da avaliação de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-23T18:34:17Z No. of bitstreams: 1 livia_a_uehara_ioc_bcm_0025_2010.pdf: 1818827 bytes, checksum: 724191daedddb70c3dec8a0449f18b96 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-23T18:34:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 livia_a_uehara_ioc_bcm_0025_2010.pdf: 1818827 bytes, checksum: 724191daedddb70c3dec8a0449f18b96 (MD5) Previous issue date: 2010 / instituro / A cruzipaína é a cisteína peptidase mais abundante do Trypanosoma cruzi, o qual é o agente etiológico da doença de Chagas. A cruzipaína é um importante fator de virulência do T. cruzi envolvida em várias etapas cruciais na interação com células de mamíferos. Essa enzima é expressa em níveis variáveis em todas as formas evolutivas e cepas do parasito, sendo abundantemente expressa nas formas epimastigotas, encontradas apenas no inseto vetor. Esse dado nos levou a investigar se a cruzipaína poderia estar envolvida na interação do T. cruzi com células do hospedeiro invertebrado. Para tal, foram analisados os efeitos do pré-tratamento do T. cruzi com um painel de diferentes inibidores de cisteína peptidases ou anticorpos anti-cruzipaína na adesão do parasito ao epitélio intestinal médio posterior dissecado de Rhodnius prolixus. Paralelamente, foi analisado o índice de adesão ao epitélio do T. cruzi que superexpressa a chagasina (pCHAG), um inibidor endógeno da cruzipaína. A taxa de adesão dos parasitos tratados com os inibidores de cisteína peptidase (iodoacetamida, leupeptina, antipaína ou E-64 a 10 µM, ou cistatina a 1 µg/mL) foi em média 70% inferior em comparação aos parasitos não tratados, com exceção do Ca074me (um inibidor de catepsina B) que não mostrou alteração significativa. O tratamento de parasitos com a cistatina apresentou um efeito dose-dependente sobre a taxa de adesão em relação aos parasitos não tratados. Além disso, o tratamento de epimastigotas com anticorpos anti-cruzipaína (1:1000) induziu uma redução significativa de 64% na adesão. Os parasitos pCHAG apresentaram baixa capacidade de ligação ao epitélio intestinal dissecado de R. prolixus, enquanto o pTEX ( plasmídeo sem o gene inserido) não apresentou mudanças significativas na taxa de adesão em relação ao controle. Nós também comparamos a habilidade de vários isolados de T. cruzi na adesão ao intestino do R. prolixus. A cepa G, que naturalmente apresenta baixíssimos níveis de cruzipaína ativa, apresentou baixa capacidade de interação em comparação às cepas Dm28c, Y e CL Brener. Os intestinos pré-tratados com cruzipaína ativa não produziram uma redução significativa no índice de adesão às células epiteliais do inseto vetor em relação ao controle indicando que o envolvimento da cruzipaína no processo de interação é independente de interação ligante-receptor. A cruzipaína ativa na concentração de 1,5 µg/µL restaurou parcialmente (30%) o nível de adesão do T. cruzi pCHAG ao epitélio intestinal dissecado de R. prolixus em relação a parasitos pCHAG. Ensaios de colonização in vivo revelaram que parasitos pCHAG são virtualmente incapazes de colonizar a ampola retal de R. prolixus. Além disso, a expressão da cruzipaína em células de T. cruzi teve um aumento drástico após a passagem em R. prolixus. Coletivamente, nossos resultados sugerem que a cruzipaína participa ativamente da interação entre T. cruzi e células epiteliais do hospedeiro invertebrado, através de um mecansimo distinto ao de ligante-receptor. / Cruzipain is the most abundant cysteine peptidase of Trypanosoma cruzi, which is the causative agent of Chagas’ disease. The cruzipain is an important virulence factor of T. cruzi, involved in several crucial steps in the interaction with mammalian cells. This enzyme is expressed at variable levels in all developmental forms and strains of the parasite, being abundantly expressed in epimastigotes forms, found only in the insect vector. This finding led us to investigate whether cruzipain could be involved in the interaction of T. cruzi with invertebrate host cells. To this end, we have analyzed the effects of the treatment of T. cruzi with a panel of different cysteine peptidase inhibitors or anti-cruzipain antibodies on the parasite adhesion to Rhodnius prolixus posterior dissected midgut. In parallel, we have analyzed the adhesion rate of T. cruzi that superexpresses chagasin (pCHAG), an endogenous cruzipain inhibitor. The adhesion rate of parasites treated with cysteine peptidase inhibitors (iodoacetamide, leupeptin, antipain or E-64 at 10 µM or cystatin at 1 µg/mL) was, in average, 70% lower compared to untreated parasites, except for Ca074me (an inhibitor of cathepsin B) that showed no significant change. Parasites treated with cystatin showed a dose-dependent effect. Furthermore, epimastigotes treated with anti-cruzipain (1:1000) presented a significant reduction of 64% in adhesion. pCHAG parasites showed low ability to bind to intestinal epithelium. We also compared the ability of several T. cruzi isolates to adhere to R. prolixus. The G strain, which naturally possesses low levels of active cruzipain, adhered to a lesser extent in comparison to Dm28c, Y and CL Brener strains. The intestines pre-treated with active cruzipain did not produce a significant reduction in the adhesion rate to epithelial cells of the insect vector as compared to control, suggesting that the involvement of cruzipain in the interaction process is independent of a ligant-receptor interaction. The active cruzipain at 1,5 µg/µL partially restored (30%) the adherence level of T. cruzi pCHAG to Rhodnius prolixus posterior dissected midgut in comparsion to pCHAG parasites. In vivo infection assays, revealed that pCHAG parasites were virtually unable to colonize R. prolixus rectum. Furthermore, the expression of surface cruzipain in T. cruzi cells was drastically enhanced after the passage in R. prolixus. Collectively, these results suggest that cruzipain mediates actively the interaction between T. cruzi and epithelial cells of the invertebrate host through a distint mechanism of the ligant-receptor.

VINHOTE, Juliana Freire Chagas. Ação tripanocida de um mastoparano de Polybia paulista e seu possível mecanismo de ação. 2015. 102 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:49:04Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_jfcvinhote.pdf: 3086851 bytes, checksum: 510ccb49556caa8453f40a064b20996e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:51:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_jfcvinhote.pdf: 3086851 bytes, checksum: 510ccb49556caa8453f40a064b20996e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T16:51:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_jfcvinhote.pdf: 3086851 bytes, checksum: 510ccb49556caa8453f40a064b20996e (MD5) Previous issue date: 2015 / Chagas disease, a neglect ed disease, is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and is endemic in several countries. In Brazil, only benznidazole is used for treating the disease. In this context, the therapeutic potential of toxins is increasingly gaining gro und and stirring interest in the scientific community. The poisons of invertebrates have become intriguing as a source of bioactive substance. The mastoparan, the most widely described class of peptides isolated from the venom of wasps, already shows diffe rent biological activities. Thus, isolated peptides have attracted scientific interest as a source of molecular model for the possible development of new drug therapies. This study investigated the effect of mastoparan peptide (MP) isolated from the venom of a Polybia paulista wasp on the Y strain of T. cruzi and its possible mechanism of action. Epimastigote forms of T. cruzi were grown, treated with various concentrations of MP, and incubated for 24, 48, and 72 hours. Trypomastigote forms of T. cruzi obta ined by LLCMK2 cells infected were subcultured, treated with various concentrations of MP, and incubated for 24 hours. To investigate the involvement of reactive oxygen species (ROS) in the mastoparan cytotoxic effect on T. cruzi epimastigotes, plates were incubated with IC50 of 24 MP; an analysis of fluorescence emission was performed via flow cytometry after adding dichlorofluorescein (DCF). The mastoparan effect on the mitochondrial membrane potential of epimastigotes was tested with rhodamine 123. Cytot oxicity was assessed on RAW 264.7 cells, and the viability of macrophages was determined using the microculture tetrazolium (MTT) assay. In the study of molecular docking, the three dimensional structure of the mastoparan was originally obtained from the p rimary sequence specific program. After analyzing the binding sites of the peptide and T. cruzi glyceraldehyde 3 - phosphate dehydrogenase (TcGAPDH) enzyme, the crystal structure of the TcGAPDH - chalepina complex was used for comparison. The mastoparan inhibi ted the growth of T. cruzi epimastigotes, with an IC50 of 102 μg/ml, 53.95 μg/ml, and 58.51 μg/ml for 24, 48, and 72 hours of incubation, respectively. In the analysis of the ROS generation, there was a significant increase in the relative fluorescence int ensity compared to the control group. The peptide change had the potential of mitochondrial membrane of the parasite. For trypomastigotes, the IC50 was 8.83 μg/ml after 24 hours of incubation. The cytotoxicity of mastoparan evaluated in macrophages did not induce significant cell death in the different concentrations studied. In the docking study, coupling mastoparan was evidenced in TcGAPDH, showing different binding sites residue of the enzyme's active center amino acids and comparing the similar position occupied by the molecule in TcGAPDH - chalepina. It follows that the mastoparan showed trypanocidal activity involving the involvement of oxidative stress and changes in membrane potential without displaying cytotoxic cells; the macrophages seem to inhibit TcGAPDH T. cruzi. Therefore, the mastoparan stands out as an important bioactive molecule against parasites. / A doença de Chagas, considerada uma doença negligenciada, é uma infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi e endêmica em diversos países. No Brasil, apenas o Benzonidazol é usado para o tratamento da doença. Nesse contexto, o potencial terapêutico das toxinas vem cada vez mais conquistando espaço e despertando grandes interesses da comunidade científica. Os venenos de invertebrados têm apresentado grande interesse como fonte de substâncias bioativas. Os mastoparanos, a classe mais amplamente descrita de peptídeos isolados a partir da peçonha de vespas, ja evidenciaram diferentes atividades biológicas. Assim, os peptídeos isolados têm despertado interesse científico como fonte de modelos moleculares para o possível desenvolvimento de novas terapias farmacológicas. Este estudo investigou o efeito do peptideo mastoparano (MP) isolado do veneno da vespa Polybia paulista sobre cepa Y de Trypanosoma cruzi e seu possível mecanismo de ação. Formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas, tratadas com diferentes concentrações de MP e incubadas durante 24, 48 e 72 horas. Formas tripomastigotas de T. cruzi obtidas através de infecção de células LLCMK2 foram subcultivadas, tratadas com diferentes concentrações de MP e incubadas durante 24 horas. Para investigar a participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no efeito citotóxico do mastoparano sobre formas epimastigotas de T.cruzi, placas foram incubadas com a CI50 de 24h de MP e a análise da emissão de fluorescência foi realizada em citometria de fluxo após adição de DCF. O efeito de mastoparano sobre o potencial de membrana mitocontrial das formas epimastigotas foi realizado pelo ensaio com rodamina 123. A citotoxicidade foi avaliada sobre celulas Raw 264.7 e a viabilidade dos macrófagos foi determinada utilizando o ensaio com MTT. No estudo de Docking molecular, obteve-se inicialmente a estrutura tridimensional do mastoparano a partir da sequência primária em programa específico. Após análise dos sítios de ligação entre peptídeo e enzima TcGAPDH, a estrutura cristalográfica do complexo TcGAPDH-chalepina foi utilizada para comparação. O mastoparano inibiu o crescimento das formas epimastigotas de T. cruzi, apresentando uma CI50 de 102 µg/mL, 53,95 µg/mL e 58,51 µg/mL para 24, 48 e 72 horas de incubação respectivamente. Na análise da produção de espécies reativas houve um aumento significativo na intensidade relativa de fluorescência, quando comparado ao grupo controle. O peptideo alterou o potencial da membrana mitocondrial do parasita. Para as formas tripomastigotas a CI50 foi 8,83 µg/mL após 24h de incubação. A citotoxidade do mastoparano avaliada em macrófagos não induziu morte celular significativa nas diferentes concentrações estudadas. No estudo de docking, foi evidenciado o acoplamento do mastoparano na TcGAPDH, demonstrando os diferentes sítios de ligação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da enzima e comparando a semelhança na posição ocupada pela molécula chalepina na TcGAPDH. Conclui-se que o mastoparano apresentou atividade tripanocida envolvendo a participação do estresse oxidativo e alteração do potencial de membrana sem apresentar citotóxica em células de macrófagos e parece inibir a TcGAPDH de T. cruzi. Portanto, o mastoparano se destaca como importante molécula bioativa contra os parasitas.

The surface molecules (procyclins) of procyclic forms of African trypanosomes (Trypanosoma brucei spp.) are complex mixtures of lipid-anchored glycoconjugates. The procyclins are expressed differentially during the parasite life cycle within the tsetse fly vector. It has been hypothesised that these surface molecules are involved in interactions with molecules of the tsetse fly and may influence differentiation, cell death and tissue tropism. To understand procyclin functions it is necessary to identify and characterise them. This thesis presents a study of the biochemical and immunochemical characteristics of the major surface molecules of Trypanosoma simiae and Trypanosoma congolense, animal pathogens of the subgenus Nannomonas that share the same developmental cycle and tropism within the tsetse vector. Organic solvent extraction, reverse-phase high performance liquid chromatography and enzyme-linked imnunosorbent assay using surface binding monoclonal antibodies were used to isolate membrane molecules of procyclic culture forms (PCF) of both trypanosome species. Gel electrophoresis of the purified molecules revealed two predominant molecular species from each parasite that were broadly similar yet showed different apparent molecular masses and staining characteristics. The molecules were shown to be glycosylphosphatidylinositol-lipid anchored glycoconjugates, comprised mainly of carbohydrates. Each moiety displayed surface-disposed carbohydrate epitopes that were recognised on the surface of both species of trypanosomes by monoclonal antibodies specific for procyclic parasites of the subgenus Nannomonas. The epitopes were previously shown to be displayed on the glutamic acid-alanine rich protein (GARP) of T. congolense, yet neither this protein (as detected either immunologically or by mass spectrometry) nor its encoding gene (as detected by Southern blot analysis) was present in T. simiae. The results indicate that although T. congolense and T. simiae share common carbohydrate surface epitopes, these are displayed on biochemically different molecules. I hypothesise that the surface disposed carbohydrate structures and not the polypeptide moieties are involved in parasite-tsetse interactions since these species have the same developmental cycles in the insect vector. In an attempt to obtain primary sequence information for the T. simiae PCF surface molecules, I identified and characterised an unique open reading frame. This was shown to be expressed as a protein in PCF and is likely a membrane-associated molecule of the subgenus Nannomonas. / Graduate

This study aims to functionally characterize two enzymes, HGPRT and XPRT, of an essential purine salvage pathway in the infection stage of Trypanosoma brucei. Localization, in vivo function and in vitro activity of these enzymes were characterized. Effect of acyclic nucleoside phosphonates, putative inhibitors of HGXPRT, on the viability of bloodstream form of T. brucei was evaluated.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6489_dissertação final Maria Augusta Dario.pdf: 2504051 bytes, checksum: 0df5dafa721b780da5475f34c2c60ab7 (MD5) Previous issue date: 2013-06-06 / Estudos moleculares têm sido utilizados para caracterização dos diferentes isolados de Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, que apresenta populações complexas. No estado do Espírito Santo, Brasil, foram obtidos isolados de T. cruzi provenientes de triatomíneos silvestres, no período de junho de 2010 a maio de 2012 e o DNA de 89 amostras foi extraído. Foi realizada a amplificação da região intergênica do gene de calmodulina e para o gene TcSC5D. As amostras foram sequenciadas e analisadas pelo software Mega 5.05. Setenta e oito amostras foram amplificadas para a região intergênica do gene de calmodulina, sendo que destas, 66 amostras foram sequenciadas, identificando as linhagens TcIII (9,1%), TcIV (7,6%), TcII (19,7%) e TcII-like (63,6%). Sessenta e duas amostras foram amplificadas e sequenciadas para o gene TcSC5D, identificando linhagens TcI (1,6%), TcII (82,2%), TcIII (8,1%) e TcIV (8,1%). Neste estudo foi possível observar que a população de T. cruzi que circula nas espécies de triatomíneos do ES é heterogênea, predominando a linhagem TcII e em menor proporção TcI, TcIII e TcIV. Sabe-se muito pouco sobre os animais reservatórios silvestres onde essas populações circulam na mata Atlântica, dificultando a correlação destas nesse ambiente. A caracterização molecular permitiu identificar linhagens do protozoário procedentes da floresta, porém capazes de se adaptar a ciclos de transmissão domiciliar da doença de Chagas. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, caracterização molecular, triatomíneos, mata Atlântica, Espírito Santo.