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Identification of PUB22 Targets and Functional Characterization in PAMP-Triggered Immunity / Identifizierung von PUB22 Zielproteinen und deren funktionelle Charakterisierung in der PAMP-vermittelten ImmunantwortStegmann, Martin January 2013 (has links) (PDF)
The three closely related PUB proteins PUB22, PUB23 and PUB24 were described as important regulators for PTI signaling and plant immunity. To find cellular targets regulated by the action of the PUB triplet we performed a yeast two-hybrid screen to identify candidate target proteins of PUB22. We could identify Exo70B2 as a target protein of PUB22, which is ubiquitinated by the E3-ubiquitin ligase and consequently degraded in response to flg22 perception. The importance of Exo70B2 for immunity was shown by reverse genetics, demonstrating that exo70B2 mutants are impaired in PTI signaling and plant immunity.
Exo70B2 is one of 23 homologs of the yeast Exo70p in Arabidopsis thaliana, which is a subunit of an octameric protein complex, termed the exocyst. The exocyst complex is required for the tethering of post-Golgi vesicles to specific target membranes and thus an important component of intracellular vesicle trafficking. The elucidated function of Exo70B2 and its requirement for PTI signaling is a novel finding and similar functions had not yet been described for the exocyst complex or subunits thereof in plants. Additional target proteins of PUB22 are also predicted to be involved in vesicle trafficking processes, suggesting that PUB22 has specialized to regulate trafficking protein complexes required for PTI signaling.
Furthermore, the presented work suggests a mechanism for the regulation of Exo70B2 ubiquitination by PUB22. PUB22 was shown to be intrinsically instable due to its autocatalytic ubiquitination activity. Flg22 treatment induced the rapid post-translational stabilization of PUB22. This potentially enables the ligase to efficiently interact with Exo70B2, resulting in its polyubiquitination and 26S-proteasome-dependent turnover. / Die drei E3-Ubiquitin-Ligasen vom Pflanzen U-box Typ (PUB), PUB22, PUB23 und PUB24, wurden als wichtige Regulatoren der Pathogen-assozierten Molekülmuster (PAMP)-vermittelten Signaltransduktion und der damit verbundenen pflanzlichen Immunantwort beschrieben. Es wurde ein Hefe Zwei-Hybridscreen mit PUB22 durchgeführt, um die zellulären Vorgänge besser zu verstehen, welche durch die drei PUB Proteine reguliert werden. Mit Hilfe des Screens konnte Exo70B2 als ein Zielprotein von PUB22 identifiziert werden. Exo70B2 wird von PUB22 ubiquitiniert und nach Erkennung von flg22 durch das 26S-Proteasom abgebaut. In weiterführenden Experimenten konnte die Bedeutung von Exo70B2 für die pflanzliche Abwehrreaktion gezeigt werden. Mutanten von exo70B2 zeigten verminderte PAMP-vermittelte Signaltransduktion und eine beeinträchtigte Immunreaktion.
Exo70B2 ist eines von 23 Arabidopsis Homologen des Exo70p Proteins aus Hefe. Exo70p ist eine Untereinheit des oktameren Exozystkomplexes, welcher für das Andocken von post-Golgi Vesikeln an spezifischen Zielmembranen benötigt wird. Der Exozystkomplex stellt demnach eine wichtige Komponente des intrazellulären Vesikeltransports dar. Die aufgeklärte Funktion von Exo70B2 und seine Bedeutung für die PAMP-vermittelte Signaltransduktion wurde bisher noch nicht für den Exozystkomplex oder einzelner seiner Untereinheiten im pflanzlichen System beschrieben. Demnach tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zur Erkenntnis neuer Funktionen des Exozystkomplexes der Pflanze bei. Zusätzliche Zielproteine von PUB22 werden ebenfalls mit der Beteiligung an intrazellulären Vesikeltransportprozessen in Verbindung gebracht. Dies legt die Vermutung nahe, dass sich PUB22 auf die Regulation von Vesikeltransportprozessen spezialisiert hat, die für die PAMP-vermittelte Signalübertragung benötigt werden.
Des Weiteren schlagen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit einen Regulationsmechanismus für die PUB22-vermittelte Exo70B2-Ubiquitinierung vor. Es konnte gezeigt werden, dass PUB22 intrinsisch instabil ist, was auf seine autokatalytische Ubiquitinierungsaktivität zurückzuführen ist. Nach Behandlung mit flg22 konnte eine rapide posttranslationale Stabilisierung von PUB22 beobachtet werden. Dies erlaubt möglicherweise die Interaktion mit Exo70B2, was zur Polyubiquitinierung und zum 26S-Proteasom-vermittelten Abbau des Zielproteins führt.
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Neuroligin: Charakterisierung eines neuronalen Transmembranproteins / Neuroligin: Characterization of a neuronal transmembrane proteinNeeb, Antje Jennifer 06 November 2003 (has links)
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Die Funktion der HRD-Ubiquitinligase bei der Protein- Dislokation aus dem Endoplasmatischen RetikulumMehnert, Martin 13 May 2013 (has links)
Fehlgefaltete Proteine des sekretorischen Weges werden aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol transportiert und dort durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Dieser Qualitätskontrollmechanismus wird als Endoplasmatisches Retikulum-assoziierte Proteindegradation bezeichnet (ERAD). In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae stellt die HRD-Ubiquitinligase eine zentrale Komponente dieses Abbausystems dar. Eine Untereinheit dieses Multienzymkomplexes ist das ER-ständige Membranprotein Der1, das über den Faktor Usa1 an die Ubiquitinligase Hrd1 rekrutiert wird und ausschließlich für den Abbau löslicher luminaler ERAD-Substrate notwendig ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von Der1 die Interaktion zu Usa1 und damit die Rekrutierung des Proteins zur HRD-Ligase vermittelt. Usa1 wirkt nicht nur als Rekrutierungsfaktor, sondern induziert auch die Der1-Oligomerisierung. Punktmutationen in den Transmembrandomänen von Der1 beeinträchtigen die Dislokation luminaler Substratproteine aus dem ER. Um weitere Hinweise für eine Beteiligung von Der1 beim Substrattransport zu erhalten, wurde die Methode des zielgerichtetem in vivo photocrosslinking für Der1 angewendet. Hierbei wurden bestimmte Positionen von Der1 mit dem photoreaktiven Aminosäureanalogon p-Benzoylphenylalanin markiert, was die Ausbildung von Quervernetzungen von Der1 zu Interaktionspartnern nach einer UV-Bestrahlung ermöglichte. Schließlich konnte auf diese Weise eine räumliche Nähe der luminal exponierten Bereiche von Der1 zum Substratrezeptor Hrd3 gezeigt werden, während die Transmembransegmente Quervernetzungen zu Hrd1 ausbildeten. Beide Bereiche von Der1 konnten zudem mit einem luminalen ERAD-Substrat quervernetzt werden. Anhand dieser Ergebnisse wurde somit erstmals eine direkte Beteiligung von Der1 insbesondere in den ersten Schritten der Substratdislokation gezeigt, was eine Funktion von Der1 als zentrale Komponente des Exportkomplexes nahelegt. / Newly synthesized proteins of the secretory pathway are subjected to an efficient quality control system in the endoplasmic reticulum. In order to prevent a harmful aggregation misfolded proteins are exported via a largely unknown mechanism into the cytosol and degraded by the ubiquitin-proteasome system in a process termed ER associated degradation (ERAD). In the yeast Saccharomyces cerevisiae the HRD-ligase constitutes a central component of ERAD. A subunit of this multi-enzyme complex is the small multispanning membrane protein Der1, which is exclusively required for the degradation of misfolded ER luminal proteins but dispensable for the turnover of membrane-bound substrates. In this study a short conserved motif in the cytosolic carboxyterminus of Der1 was identified that mediates the binding to the HRD-ligase. Moreover, co-immunoprecipitation experiments show that Der1 forms oligomers, which relies on its assembly into the degradation complex. Mutations in the transmembrane domains of Der1 block the export of soluble proteins across the ER-membrane. To further investigate the function of Der1 in substrate dislocation an in vivo site-specific photocrosslinking approach was applied. Various positions of Der1 were labelled with the photoreactive amino acid analogue p-benzoyl-phenylalanine followed by UV irradiation of living cells expressing these Der1 constructs. The crosslinking experiments reveal a spatial proximity of ER luminal exposed parts of Der1 to the substrate receptor Hrd3. By contrast, the membrane-embedded domains of Der1 reside adjacent to the ubiquitin ligase Hrd1. Intriguingly, both regions also form crosslinks to a client protein. In summary the data of this work imply that multimeric Der1 initiates the export of aberrant polypeptides from the ER-lumen by threading such molecules into the ER-membrane and routing them to Hrd1 for ubiquitylation.
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Funktionelle Charakterisierung des Hrd1-Proteins – einer Komponente der HRD-UbiquitinligaseFichtner, Susanne 26 June 2019 (has links)
In Eukaryoten werden sekretorische Proteine an zytoplasmatischen Ribosomen synthetisiert und in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie ihre biologisch aktive Struktur erhalten. Defekte Proteine, die durch Fehler in diesem Reifungsprozess entstehen, werden über den Prozess der „ER-assoziierten Protein Degradation“ (ERAD) abgebaut. Eine zentrale Komponente dieses Abbauweges ist die HRD‑Ligase, ein membranständiger Proteinkomplex, der das E3‑Enzym Hrd1 enthält. Einige publizierte Arbeiten lassen eine Beteiligung der Transmembrandomäne von Hrd1 an einem neuartigen Transportsystem für den Export von fehlgefalteten Proteinen aus dem ER vermuten.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die Bedeutung der Transmembranregion von Hrd1 für den Abbau von ERAD‑Substraten in dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden. Die Substitution von zwei Aminosäuren in der dritten Transmembranhelix von Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) hemmt spezifisch den Abbau von fehlgefalteten ER-luminalen Proteinen, während die Prozessierung membrangebundener Hrd1-Substrate weitestgehend unbeeinflusst blieb. Daher zeigt die Hrd1‑Variante wahrscheinlich eine Störung im Transport von luminalen ERAD‑Substraten durch die ER Membran. Biochemische Analysen zeigen keine starken Veränderungen bei der Zusammensetzung der HRD-Ligase durch die Hrd1‑Variante. Allerdings ließen sich bei Anwendung von zielgerichtetem in vivo photocrosslinking deutliche Veränderungen in der räumlichen Orientierung der Ligaseuntereinheit Der1 zu Hrd1E84L, H101L beobachten. Da Der1 ausschließlich für den Abbau ER-luminaler ERAD-Substrate benötigt wird ist anzunehmen, dass die korrekte Ausrichtung von Der1 zu Hrd1 innerhalb der ER-Membran eine Voraussetzung für den Transport von ERAD‑Substraten in das Zytoplasma ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals einen direkten Einfluss der Transmembranregion von Hrd1 auf den Abbau luminaler ERAD‑Zielproteine. / In eukaryotes, secretory proteins are synthesized on cytoplasmic ribosomes and transported into the endoplasmic reticulum (ER), where they obtain their biologically active structure. Defect proteins that arise from errors in this maturation process are degraded by the “ER-associated protein degradation” (ERAD) pathway. A central component of ERAD is the HRD-ligase, a membrane-bound protein complex that contains the ubiquitin ligase Hrd1. Some published work raised speculations on an involvement of this trans-membrane domain in a novel transport system for the export of misfolded proteins from the ER.
In the course of this work new insights for the importance of the transmembrane domain of Hrd1 for the degradation of ERAD substrates in the model organism Saccharomyces cerevisiae were obtained. The substitution of two amino acids in the third trans-membrane helix of Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) specifically impairs the turnover of misfolded ER-luminal proteins whereas the processing of membrane-bound Hrd1 substrates remained largely unaffected. The Hrd1 variant therefore displays most likely a defect in the transport of luminal ERAD substrates through the ER membrane. No major changes in the assembly of the HRD-ligase by the Hrd1 variant were detected. Still, in site specific in vivo photo-crosslinking assays substantial changes in the spatial orientation of the ligase subunit Der1 towards Hrd1E84L, H101L were detected. Der1 is exclusively required for the degradation of ER-luminal ERAD substrates. This implies that the proper alignment of Hrd1 and Der1 within the ER membrane is a prerequisite for the transport of ERAD substrates into the cytoplasm. This work shows for the first time a direct involvement of the trans-membrane region of Hrd1 in the degradation of luminal ERAD client proteins.
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