In Saccharomyces cerevisiae nimmt die membrangebundene RING-Ub-Ligase Doa10 eine bedeutende Rolle in der Proteinqualitätskontrolle (PQC) des Endoplasmatischen Retikulums (ER) und des Nukleus ein. Doa10 katalysiert dabei die Verknüpfung K48- verbundener Ub-Ketten auf Proteine, die entweder in der ER-Membran oder löslich im Cytosol oder dem Nukleoplasma vorliegen. Diese Markierung leitet die Degradation dieser Proteine ein. Interessanterweise kooperiert Doa10, im Gegensatz zu anderen RING-Ub-Ligasen, mit zwei Ub-konjugierenden Enzymen (E2), um ihre Substrate zu prozessieren. In dieser Arbeit wird veranschaulicht, wie die beiden hochspezialisierten E2 Enzyme Ubc6 und Ubc7 sequentiell agieren, um Doa10 Substrate zu modifizieren. Zuerst wird ein einzelnes Ub-Molekül Ubc6-abhängig an ein Substrat konjugiert (Initiation). Von diesem Rest ausgehen katalysiert Ubc7 die Ausbildung einer K48-verbundenen Ub-Kette (Elongation). Die Fähigkeit von Ubc6 nicht nur Lysine, sondern auch hydroxylierten Aminosäuren wie Serin und Threonin mit Ub-Molekülen zu verknüpfen, erweitert das Substratspektrum von Doa10 und ermöglicht die Prozessieren von Proteinen, die keine zugänglichen Lysinreste exponieren. Weiterhin wird gezeigt, dass ein Überangebot von Ubc6 den Doa10-abhängigen Substratabbau beeinträchtigt. Dies weist darauf hin, dass die Generierung eines effizienten Poly-Ub-Signals einer streng kontrollierten Koordination beider E2 Enzyme am Doa10-Ligase-Komplex unterliegt. / In Saccharomyces cerevisiae, the membrane-bound RING-type Ub ligase Doa10 is a key player of Protein Quality Control (PQC) in the endoplasmic reticulum (ER) and the nucleus. Doa10 promotes lysine 48-linked poly-ubiquitylation of proteins that either reside in the ER membrane or are soluble in the cytosol or the nucleus and thereby labels them for degradation. Strikingly, in contrast to other RING Ub ligases, which typically employ a single Ub conjugating enzyme (E2) for substrate ubiquitylation, the Doa10 ligase requires two of such enzymes for client processing. This study demonstrates that the highly specialized E2 enzymes Ubc6 and Ubc7 act in a sequential manner on Doa10 client proteins. In a first step Ubc6 attaches a single Ub molecule to a substrate (priming), which is followed by the elongation of this moiety with K48-linked Ub chains by Ubc7 (elongation). The ability of Ubc6 to conjugate Ub not only to lysine but also to hydroxylated amino acids like serine and threonine broadens the substrate range of Doa10 and allows processing of proteins, which do not expose accessible lysine residues. Overproduction of Ubc6 was shown to impair Doa10 dependent substrate degradation. Apparently, the generation of a productive K48-linked poly-Ub signal requires a tightly coordinated activity of the individual E2 enzymes at the Doa10 ligase complex.

Die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD) ist Teil des Qualitätskontrollsystems am ER, um der Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER entgegenzuwirken. Hierbei werden ERAD-Substrate mit Hilfe von E3-Ligasen wie z.B. HRD1 ubiquityliert und anschließend durch den p97-Ufd1-Npl4 Komplex aus der ER-Membran extrahiert. Im Zytosol werden diese extrahierten Proteine vom 26S Proteasom abgebaut. Für die Retrotranslokation von ERAD- Substraten werden zudem die Membranproteine Derlin-1 und VIMP benötigt, welche mit p97 assoziieren und einen Proteinkomplex bilden. HERP ist ein ER-lokalisiertes Protein, dessen Synthese durch den UPR (unfolded protein response) als Antwort auf die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER induziert wird. Dies deutet auf eine Rolle von HERP im ERAD hin. Interessanterweise besitzt HERP eine sogenannte UBL-Domäne. Für andere Proteine mit UBL-Domäne konnte eine Interaktion dieser Domäne mit dem Proteasom nachgewiesen werden. Daher kann angenommen werden, dass HERP ebenfalls mit dem Proteasom interagiert und dies zur ER- Membran rekrutiert, wo es für den Abbau von ERAD-Substraten benötigt wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von HERP innerhalb des UPR zu ermitteln. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass HERP essentiell für den Abbau des ERAD-Modell- Substrates CD3-delta ist. Somit hat HERP tatsächlich eine Rolle im ERAD. Außerdem wird eine direkte Interaktion von HERP mit der E3-Ligase HRD1 nachgewiesen. Es wird zudem gezeigt, dass HERP und HRD1 einen Proteinkomplex mit p97, Derlin-1 und eventuell auch mit VIMP bilden. Dieser ERAD Komplex ist folglich sowohl für die Ubiquitylierung als auch die Retrotranslokation von ERAD-Substraten verantwortlich und garantiert somit die effiziente Prozessierung von Proteinen aus dem ER. Zudem wird gezeigt, dass die UBL-Domäne von HERP im Gegensatz zu anderen UBL- Domänen nicht mit dem Proteasom interagiert. Somit kann nicht mehr davon ausgegangen werden, dass Proteasombindung eine Gemeinsamkeit aller Proteine mit UBL-Domäne ist. Dagegen wird eine Interaktion der UBL-Domäne von HERP mit dem deubiquitylierenden Enzym USP7 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass auch Deubiquitylierung eine wichtige Rolle im ERAD-Prozess spielt. / ER-associated protein degradation (ERAD) is part of the ER quality control system dealing with the accumulation of misfolded proteins in the ER. This process requires polyubiquitylation of ERAD substrates involving E3 ligases, such as HRD1, and their subsequent extraction from the ER membrane by the p97-Ufd1-Npl4 complex. Retrotranslocation of substrates into the cytosol for degradation by the 26S proteasome also involves the membrane proteins Derlin-1 and VIMP, which are associated with p97 to form a protein complex. The ER-resident protein HERP was shown to be upregulated by the unfolded protein response pathway (UPR) upon the accumulation of misfolded proteins in the ER. It was therefore considered to function in ERAD. Interestingly, HERP contains a UBL domain. In other proteins this domain facilitates an interaction with the proteasome, suggesting that HERP might recruit the proteasome to the ER membrane for efficient ERAD. The aim of this study was to investigate the function of HERP within the UPR. The findings presented here demonstrate that HERP is essential for the degradation of a model ERAD substrate. Thus, HERP indeed has a role in ERAD. Moreover, the data show that HERP directly interacts with the E3 ligase HRD1 and the two proteins form a common protein complex with p97, Derlin-1 and possibly also with VIMP. This suggests that both ubiquitylation and retrotranslocation of ER proteins are performed by one protein complex, enabling an efficient processing of ERAD substrates. This study also demonstrates that the UBL domain of HERP does not share the proteasome binding property of other UBL domains, suggesting that proteasome binding cannot be considered a general feature of all UBL domains. Instead, the HERP UBL domain is able to interact with the deubiquitylating enzyme USP7. Therefore, deubiquitylation might also be an important aspect in the proteasome-dependent degradation of misfolded ER proteins.