Anhand der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente lässt sich feststellen, dass der VASP-POD-Assay eine sensitive Methode zur Erfassung der Aktivität humaner Thrombozyten ist. Mithilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion kann der hemmende Effekt zahlreicher Vasodilatoren auf Thrombozytenaktivität quantitativ in-vitro erfasst werden. VASP, das Zielantigen dieser Reaktion, spielt eine Schlüsselrolle. Der Phospho¬rylierungszustand dieses Proteins beeinflusst die Thrombozytenaktivierung bzw. Hemmung der Thrombozytenaktivität. Die Phosphorylierung von VASP wiederum bedingt sowohl eine intrazelluläre NO/cGMP- als auch PGI2/cAMP-Signalkaskade. Die cAMP bzw. cGMP abhängigen Signalkaskaden können durch VASP-Phorylierung an Serin 157 und Serin 239 quantifiziert werden. Die Verwendung von mit Meerretich¬peroxidase konjugierten Antikörpern erlaubt eine quantitative Messung von Phospho-VASP Anteil am Gesamt-VASP. Diese markiert den phosphorylierten Serinrest des VASP. Ebengenanntes Verhältnis von Phospho-VASP zum Gesamt-VASP korreliert wiederum mit Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die thrombozyten¬aggregationshemmende Wirkung von vasodilatierenden Substanzen – wie z.B. NO und PGI2 – kann durch die Messung der VASP-Phosphorylierung mithilfe VASP-POD-Assay quantifiziert werden. Diese Substanzen entfalten ihre Wirkung durch intrazelluläre Erhöhung von zyklischen Nukleotiden (cAMP und cGMP). Die thrombozytäre VASP-Phosphorylierung unter Wirkung von NO bzw. PGI2. wurden in-vitro in unterschiedlichen Bedingungen – sowohl in gewaschenen Thrombozyten als auch in Vollblut – ermittelt. Somit ist P-VASP als biochemischer Marker für das Monitoring der NO/cGMP- bzw. PGI2/cAMP-Signalkaskade in humanen Thrombozyten geeignet. Eine Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen kann außerdem mithilfe von VASP-POD-Assay ermittelt werden. In einem vereinfachten Modell des humanen, geschlossenen Kreislaufsystems wurden gewaschene Thrombozyten und Endothelzellen mit verschiedenen Substanzen, die endotheliale NO-Synthese stimulieren und somit die NO-Bioverfügbarkeit erhöhen, inkubiert. Die Erhöhung der extrazellulären NO-Bioverfügbarkeit korreliert mit dem intrazellulären Anstieg des P-VASP Anteils am Gesamt-VASP in Thrombozyten. Durch die Messung der intrathrombozytären VASP-Phosphorylierung in VASP-POD-Assay kann man indirekt Rückschlüsse auf die Wirkung dieser Substanzen auf die Thrombozytenaktivität und die Interaktion zwischen humanen Thrombozyten und Endothelzellen ziehen. Zur Verifizierung der Empfindlichkeit dieser Analysenmethode wurde der VASP-Phosphorylierungsgrad von Thrombozyten gesunder Probanden mit der an Diabetes Mellitus erkrankten Probanden verglichen. Die gesteigerte Thrombozytenaktivität von erkrankten Probanden kann unter Verwendung dieses Verfahrens (VASP-POD-Assay) diagnostiziert und quantifiziert werden. VASP-Assay ermöglicht eine schnelle, leichte und reproduzierbare Quantifizierung der Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen. Somit wird das gesetzte Ziel der Entwicklung dieser Messmethode erreicht, nämlich die Früherkennung gestörter Interaktion zwischen humanen Thrombozyten und Endothel¬zellen und folglich die pathologische Veränderung des Funktionszustandes humaner Thrombozyten bei Diabetes Mellitus in Frühstadium. Unter Berücksichtigung des thrombozytenaggregationshemmenden Effekts des P-VASP kann die Stimulation zur Phosphorylierung von VASP einerseits als protektive Maßnahme und andererseits als möglicher Angriffspunkt der zukünftigen Medikation betrachtet werden. / Cyclic nucleotide plays a big role in thrombocyte regulation. Techniques for screening and monitoring of cyclic nucleotide have to be established. Here we develope an assay based on VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) - phosphorylation for the monitoring of intracellular cyclic nucleotide levels. Two phosphorylation sites are specifically phosphorylated by these kinases (Serin 239 and Serin 157).

Garnet structured cubic LLZO crystal (Li56La24Zr16O96) is one of the most promising solid electrolytes for next-generation solid-state lithium-ion batteries. Ab initio molecular dynamics simulations have been employed to study the impacts of lithium vacancy defect and doping concentration on the lithium ionic conductivity and stability of LLZO. The number of lithium atoms in a unit cell of LLZO has been reduced from 56 to 53, where 56 lithium atoms represent the structure of stoichiometric LLZO, i.e., Li7La3Zr2O12. Similarly, the effect of Al and Ga doping on the conductivity and stability of LLZO material was also investigated. Our computational results confirm that both the defects help in enhancing the conductivity of LLZO and the concentration of defect introduced controls the trade-off between the conductivity and stability. Overall, this study provides a valuable insight into the enhancement of conductivity of cubic LLZO garnet material along with structural stability.

Recurrent airway obstruction (RAO) affects middle-age horses, inducing bronchoconstriction and airway inflammation. β2-agonists like salbutamol are used as treatment, promoting airway smooth muscle (ASM) relaxation and bronchodilation. In addition to ASM, inflammatory cells express the β2-adrenoreceptors (β2-AR). In other species, β2-agonists promote peripheral blood lymphocyte (PBL) cytokine expression towards a pro-inflammatory phenotype. RAO horses are a good model for evaluating chronic changes in human asthma. However, little is known about the effect of β2-agonist stimulation on equine PBL inflammatory response. The aims of this study were to develop an indirect method to evaluate the response of equine PBLs to β2-agonist stimulation, and to compare it between cells from RAO and non-affected horses. Isolated PBLs were activated with ConA and stimulated with salbutamol. Response to agonist binding was indirectly determined using flow cytometric methodology and verified by Western blot. Activated PBLs from RAO horses demonstrated a significant response to β2-agonist binding whereas cells from non-affected horses did not. Response of PBLs from RAO horses was attenuated when pre-treated with a β2-antagonist but unaffected following pre-treatment with a β1-antagonist, indicating that the response of PBLs from these horses to salbutamol binding was mainly through the β2-AR. Preliminary investigation of bronchoalveolar lavage (BAL) lymphocytes from RAO horses demonstrated that they also responded to β2-agonist binding, while cells from non-affected horses did not. These findings represent a novel tool for further investigation of the role of β2-agonist binding in diseases like asthma and RAO, and support the use of this model for future studies. / Master of Science

Shigella is a causative agent of bacillary dysentery in humans. The ability of Shigella to disseminate in the intestinal epithelium is crucial for disease establishment. This process of cell-to-cell spread involves actin-based motility, which allows movement of Shigella through the cytoplasm, and the ability of Shigella to form filopodia-like membrane protrusions that are engulfed by adjacent cells. Compared to the process of Shigella actin tail assembly, which requires recruitment and activation of host actin modulators such as N-WASP and Arp2/3, the mechanism of how Shigella moves from an infected cell into neighboring cells and what host factors are involved remain poorly characterized. In this dissertation, I investigate whether members of the Ena/VASP family, as key actin regulators, or Inverse-BAR (I-BAR) family proteins, as coordinators of membrane curvature and actin dynamics, are required in dissemination of S. flexneri in a cell monolayer. Ena/VASP family proteins regulate cell migration, adhesion, shape, and cell-cell interaction. The members of the family include Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein (VASP), Ena-VASP-like (Evl), and Mammalian enabled (Mena). We have previously shown that Mena, despite its localization to the actin tail, has no role in S. flexneri actin-based motility. Here, I investigate the role of Mena, Evl, and VASP in S. flexneri dissemination. I determine that the presence of VASP or Evl restricts cell-to-cell spread of S. flexneri. I further show evidence that the conserved EVH1 domain and phosphorylation of VASP regulate the ability of Shigella to spread. I-BAR proteins, including IRSp53 and IRTKS, contain a conserved domain that directly binds to membrane lipids and induces convex membrane deformation. This unique property and the ability of these proteins to bind F-actin and actin modulators are necessary for the formation of actin pedestals by pathogenic E. coli and filopodia. Using cells with reduced levels of IRTKS or IRSp53, I examine the role of these proteins in cell-to-cell spread and show that neither IRTKS nor IRSp53 is required for S. flexneri spread. Collectively, these results advance our understanding of host proteins that participate in S. flexneri dissemination.

Protein interactions as mediated by catalytic or non-catalytic protein domains contribute to cellular signal transduction processes by covalent protein modification of or non-covalent binding to interaction partners. Ena/VASP homology 1 (EVH1) domains are found in different signal transduction proteins as N-terminal non-catalytic adaptor modules of ~ 115 amino acids sharing a common fold. By targeting their host proteins to subcellular sites of action they are involved in several signalling cascades which include protein phosphorylation and cytoskeletal reorganisation. In this study, protein interactions of the two EVH1 domain containing proteins VASP and Spred2 were studied according to their involvement in different and non-overlapping signal transduction pathways of the cell. EVH1 domains were first described in the Ena/VASP protein family with the Vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP being its founding member. As a cytoskeleton-associated protein VASP not only interacts with different proteins of the actin network but it is also a substrate for cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. However the full complement of protein kinases targeting VASP as their substrate is still unknown. Here we used mouse cardiac fibroblast (MCFB) cells in order to study the phosphorylation status of VASP and identify new candidate protein kinases involved after serum stimulation of these cells. Using phosphosite-specific antibodies we found that serum stimulation induces a phosphorylation of VASP at Ser-157 in a time-dependent manner reaching its maximum after 90 min of stimulation. We developed an interaction graph model of possible candidate protein kinases involved. Using a pharmacological perturbation analysis with different combinations of specific protein kinase inhibitors and activators we excluded any contribution of cGMP-dependent protein kinase and Rho kinases to this process and identified a combined action of classical isoforms of PKCs and PKA in serum-stimulated VASP phosphorylation at Ser-157 positioning PKC upstream of PKA in this signalling pathway. We hypothesise that PKC receives an external stimulatory signal upon serum stimulation of MCFB cells which is passed either directly or indirectly to PKA which finally phosphorylates VASP at Ser-157. A new EVH1 domain has been described recently in the Spred proteins (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) which are inhibitors of the Ras/Raf/MAP kinase pathway. Our laboratory has been involved in the elucidation of the atomic structure of the human Spred2 EVH1 domain by protein NMR spectroscopy (PDB 2JP2; 2007). A positively charged binding interface of this EVH1 domain suggests an interaction with negatively charged ligands; however no interaction partners of this domain have been described so far. In the second part of this study, we used different genetic and biochemical screening methods to search for ligands of the Spred2 EVH1 domain. A bacterial two-hybrid system was established using a physically well characterized interaction of the VASP EVH1 domain with a panel of its ActA binding peptides as positive controls to screen a human brain cDNA expression library at different stringencies for candidate Spred2 EVH1 interaction partners. However none of the clones isolated could be genetically and physically validated to support Spred2 EVH1 specific interactions. An in-vitro screening of a 9-mer phage display peptide library using purified GST-Spred2 EVH1 fusion protein was performed together with a Fyn-SH3 fusion protein as a positive control. In contrast to the Fyn-SH3 domain the majority of phages isolated with the Spred2 EVH1 domain either carried no inserts or inserts with stop codons suggesting a highly non-specific interaction of the phage coat protein with the latter domain but neither the Fyn-SH3 domain nor the GST moiety. Isolation of a 13-mer proline-rich sequence was particularly surprising in this context. In order to address possible interactions of the Spred2 EVH1 domain with non-peptidergic ligands protein-lipid interaction assays were performed. Quantitative binding studies to purified Spred2 EVH1 using a liposome sedimentation assay however excluded any interaction of candidate phospholipids of the phosphatidyl inositol phosphate class with the Spred2 EVH1 domain. A natively folded and thus binding-competent conformation of the purified proteins used was assessed independently by 1H protein NMR spectroscopy. In summary the cumulative evidence of our genetic and biochemical screening experiments suggests that the still elusive Spred2 EVH1 ligand(s) may be formed of hydrophobic peptide epitopes larger than nine amino acids in size and carrying negative charge(s). A phosphorylation of Spred2 EVH1 binding epitopes by a post-translational modification should be seriously considered in future experiments. / Proteininteraktionen, wie sie durch katalytisch oder nicht-katalytisch wirksame Proteindomänen vermittelt werden können, spielen eine wesentliche Rolle in zellulären Signaltransduktionsprozessen durch die kovalente Modifikation oder nicht-kovalente Bindung von Interaktionspartnern. Ena/VASP Homologie 1 (EVH1) Domänen finden sich als N-terminale, nicht-katalytische, etwa 115 Aminosäuren große und konserviert gefaltete Adaptormodule in vielen verschiedenen Signaltransduktionsproteinen. Indem sie ihre jeweiligen Wirtsproteine an deren subzellulärem Wirkort verankern helfen, sind sie an vielen verschiedenen Signalkaskaden wie z.B. Proteinphosphorylierungen oder Umbauprozessen des Zytoskeletts beteiligt. In dieser Arbeiten wurden Proteininteraktionen der beiden EVH1 domänen-haltigen Proteine VASP and Spred2 untersucht, die in nicht überlappenden Signaltransduktionswegen der Zelle vorkommen. EVH1 Domänen wurden zuerst innerhalb der Ena/VASP-Proteinfamilie beschrieben, deren Gründungsmitglied das Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein VASP ist. Als zytoskelett-assoziiertes Protein wechselwirkt VASP nicht nur mit verschiedenen Aktin-bindenden Proteinen, sondern ist auch ein Substrat der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen. Der vollständige Satz jener Proteinkinasen, die VASP als eines ihrer Substrate aufweisen, ist immer noch unbekannt. Hier haben wir kardiale Mausfibroblasten (MCFB) Zellen verwendet, um nach Serum-Stimulation dieser Zellen den Phosphorylierungsstatus von VASP zu bestimmen und daran beteiligte, neue Kandidaten-Proteinkinasen zu identifizieren. Mit Hilfe von Phosphorylierungsstellen-spezifischen Antikörpern konnten wir zeigen, dass eine Serum-Stimulation eine zeitabhängige Phosphorylierung von VASP an Serin 157 induziert, die ein Maximum 90 min nach Stimulation erreicht. Wir entwickelten ein Interaktionsgraphen-Modell möglicher Kandidaten-Proteinkinasen, die an diesem Prozess beteiligt sein könnten. Mit Hilfe pharmakologischer Perturbationsexperimente auf der Grundlage spezifischer Proteinkinase-Inhibitoren und Aktivatoren konnten wir einerseits eine Beteiligung der löslichen cGMP-abhängigen Proteinkinase und von Rho-Kinasen an diesem Prozess ausschliessen und anderseits die gemeinsame Beteiligung der klassischen Proteinkinase C Isoform(en) und der cAMP-abhängigen Proteinkinase nachweisen. In diesem Signalweg liegt dabei die Proteinkinase C stromaufwärts vor letzterer. Nach unserer Interpretation der Daten wird die PKC nach Serum-Stimulation der MCFB-Zellen aktiviert und aktiviert ihrerseits direkt oder indirekt die cAMP-abhängige Proteinkinase, die schliesslich VASP als proximales Substrat am Serin 157 phosphoryliert. Eine neue EVH1 Domäne wurde kürzlich in den Spred Proteinen (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) beschrieben, die neue Inhibitoren im Ras/Raf/MAP-Kinase-Signalweg darstellen. Unser Labor war an der NMR-gestützten Aufklärung der atomaren Struktur der Spred2 EVH1 Domäne beteiligt (PDB 2JP2; 2007). Die positiv geladene Bindungsfurche dieser EVH1 Domäne legt eine Interaktion mit anionischen Liganden nahe. Interaktionspartner für diese Domäne sind bisher jedoch nicht beschrieben worden. Im zweiten Teil dieser Arbeit verwendeten wir verschiedene genetische und biochemische Suchverfahren zur Identifizierung möglicher Spred2 EVH1 Liganden. Ein bakterielles Two-Hybrid-System mit der Spred2 EVH1 Domäne als Köderprotein wurde dazu etabliert unter Verwendung der physikalisch gut charakterisierten Wechselwirkung der VASP EVH1 Domäne mit ihren ActA Bindungspeptiden als eines positiven Kontroll-Interaktionspaars und zum verschieden stringenten Durchmustern einer humanen cDNA Expressionsgenbank aus Gehirn eingesetzt. Keiner der isolierten Klone ließ sich jedoch genetisch oder nach Sequenzierung in Hinblick auf eine Spred2 EVH1 spezifische Wechselwirkung validieren. Mittels gereinigtem GST-Spred2 EVH1 Protein wurde daher eine 9-mer Peptid-Genbank im Phage-Display-Verfahren durchgemustert unter Verwendung eines Fyn-SH3 Fusionsproteins als positiver Kontrolle. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit letzterer trugen die mit der Spred2 EVH1 Domäne isolierten Phagen überwiegend keine Inserts oder solche mit Stop-Codons, was eine unspezifische Wechselwirkung mit den Phagen-Hüllenproteinen dieser Domäne nicht jedoch der Fyn-SH3 Domäne oder des GST-Partners nahelegt. Die Isolierung einer 13-mer großen prolin-reichen Bindesequenz war in diesem Zusammenhang besonders überraschend. Um eine mögliche Wechselwirkung von Spred2 EVH1 mit nicht-peptidergen Liganden zu untersuchen, wurden Protein-Phospholipid-Interaktionsassays durchgeführt. Mittels quantitativer Bindungsstudien unter Verwendung der isolierten Domäne konnte eine Interaktion mit Kandidaten-Phospholipiden aus der Klasse der Phosphatidylinositolphosphate in einem Liposomen-Sedimentationsassay ausgeschlossen werden. Eine native Faltung und damit prinzipiell bindungskompetente Konformation(en) der gereinigten Proteine konnten mittels 1H Protein-NMR-Spektroskopie sichergestellt werden. Zusammengenommen lassen unsere Experimente vermuten, dass es sich bei den noch immer nicht dingfest gemachten Spred2 EVH1 Liganden um hydrophobe, negative geladene, mehr als neun Aminosäuren umfassende Peptidepitope handeln könnte. Bei deren Identifizierung in zukünftigen Experimenten sollte mit ihrer Phosphorylierung durch post-translationale Modifikationen gerechnet werden.

This project involves controlling and characterizing the morphology of the active layer in a special type of organic photovoltaics (OPVs), consisting of porphyrin-fullerene composites, with emphasis on electron exchange interactions between the two components. The Vienna Ab Initio Simulation Package (VASP) is applied to model a variety of donor-acceptor complexes containing fullerene and porphyrin in terms of their stabilities as well as their geometric, electronic, and charge transfer features. The goal is to identify supramolecular chain structures with highest occupied molecular orbitals (HOMOs) and lowest unoccupied molecular orbitals (LUMOs) that may serve as electron (hole) transfer channels in a photovoltaic device. A stable structure, involving the planar adsorption of a porphyrin unit on a C60 hexagon, has been identified. The results for fullerene have been extended to phthalocyanine–fullerene dyads where the fullerene-derived unit Phenyl-C61-butyric acid methyl ester (PCBM) is connected to a porphyrin analogous electron donor through two oxygen-linked benzene rings. In both cases, the HOMO is located on the porphyrin segment, the LUMO on the fullerene component. As a fullerene, PCBM is a material of very high electron affinity, but it has better solubility properties than fullerene. It is often used in plastic solar cells or flexible electronics in conjunction with electron donor materials such as P3HT or other polymers. The results of our work contribute to the ongoing effort of using computational modeling to identify fullerene-based materials of potential relevance for organic photovoltaics.

Orientadores: Karin Spat Albino Barcellos Silveira, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T03:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernusso_VanessaAline_M.pdf: 2366309 bytes, checksum: d89f227d922fcfaba6696c0e1af0fdae (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) e Zyxin são proteínas reguladoras de actina que controlam a adesão célula-célula. Zyxin dirige a montagem da actina através da interação e recrutamento da VASP a sítios específicos da adesão. A fosforilação da VASP ou da Zyxin altera suas atividades nas junções aderentes. PKA fosforila VASP em serina 157, regulando, assim, importantes funções celulares de VASP. VASP interage com ABL e é substrato da oncoproteína BCR-ABL. A presença da proteína BCR-ABL promove a oncogênese em pacientes com leucemia mieloide crônica (LMC) devido à ativação constitutiva da atividade tirosina quinase. Apesar de já descrita alteração da expressão de VASP e Zyxin em diferentes tumores epiteliais, o papel de VASP e Zyxin na LMC, na via de sinalização BCR-ABL e a participação destas proteínas na hematopoiese são desconhecidos. Desta maneira, demonstramos aqui ausência de p-VASP ser157 em células de medula óssea de pacientes com LMC, em contraste com a presença de p-VASP ser157 em doadores saudáveis. Pacientes com LMC em remissão, responsivos a inibidores de tirosina quinase, apresentam p-VASP ser157, enquanto os pacientes resistentes não expressam p-VASP ser157. Utilizando células K562 inibidas para VASP ou Zyxin, observamos que VASP e Zyxin modulam as proteínas anti-apoptóticas BCL-2 e BCL-XL da via de sinalização do BCR-ABL. Em adição, células K562 silenciadas para a VASP apresentam diminuição na atividade de FAK y925 e demonstramos que VASP interage com FAK. A expressão de VASP e Zyxin e de suas formas ativas aumenta durante a diferenciação megacariocítica e a inibição de VASP implica em diminuição na expressão do marcador CD61. Identificamos no presente estudo a participação de VASP e Zyxin na via do BCR-ABL, regulando a expressão de proteínas efetoras anti-apoptóticas e, também, na diferenciação megacariocítica. Desta maneira, a expressão alterada da atividade de VASP nos pacientes com LMC pode contribuir para a patogênese da doença, seja afetando a diferenciação celular ou a adesão das células leucêmicas / Abstract: VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) and Zyxin are actin regulatory proteins that control cell-cell adhesion. Zyxin directs actin assembly by interacting and recruiting VASP to specific sites of adhesion. The phosphorylation of VASP and Zyxin modifies their activity in cell-cell junctions. PKA phosphorylates VASP at serine 157 regulating VASP cellular functions. VASP interacts with ABL and VASP is a substrate of BCR-ABL oncoprotein. The presence of BCR-ABL protein drives oncogenesis in patients with chronic myeloid leukemia (CML) due to a constitutive activation of tyrosine kinase activity. It has been described an altered expression of VASP and Zyxin in different types of tumor; however the function of VASP and Zyxin in CML, in BCR-ABL pathway and in hematopoiesis remains unknown. We describe here the absence of p-VASP ser157 in CML bone marrow cells, in contrast to p-VASP ser157 expression in healthy donors. Patients responsive to tyrosine kinase inhibitors present p-VASP ser157, while resistant patients do not have p-VASP ser157. In K562 cells we observed that VASP and Zyxin modulate anti-apoptotic proteins BCL-2 and BCL-XL. VASP depletion in K562 cells decreases FAK y925 activity and VASP interacts with FAK. Expression of VASP, p-VASP, Zyxin and p-Zyxin increases during megakaryocyte differentiation and VASP inhibition affects this differentiation through reduced CD61 expression in VASP depleted cells. We identify here the participation of VASP and Zyxin in BCR-ABL pathway affecting anti-apoptotic proteins and, also, in megakaryocyte differentiation. Then, the altered expression of VASP activity in CML patients may contribute to CML pathogenesis, affecting cellular differentiation or leukemic cell adhesion / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

L’angioplastie coronaire est la première forme de revascularisation coronaire. Elle présente cependant 2 limites qui restreignent encore son utilisation : la thrombose et la resténose de stent. La thrombose de stent est un événement précoce associé à une mortalité élevée. Les plaquettes y jouent un rôle déterminant. Le développement de tests fonctionnels plaquettaires permettant d’analyser le niveau de réactivité plaquettaire sous traitement a permis de mettre en évidence les limites de celui-ci sur le plan biologique. Nous avons démontré l’impact clinique de l’utilisation de ces tests dans la prédiction et la réduction du risque de thrombose de stent chez des patients traités par angioplastie coronaire. La resténose est quant à elle une complication tardive de l’angioplastie coronaire avec implantation d’un stent non-actif. Sa physiopathologie repose sur des mécanismes de lésion et de régénération endothéliale. Des marqueurs endothéliaux circulants ont récemment été développés. Nous avons montré qu’ils pouvaient permettre d’évaluer la lésion et la régénération endothéliale induite par une angioplastie coronaire. Les cellules endothéliales circulantes s’élèvent transitoirement après l’angioplastie et ce de façon variable en fonction de la réactivité plaquettaire sous traitement démontrant les interactions étroites entre ces différents acteurs. Dans le même temps, on observe une mobilisation de progéniteurs d’origine médullaire suite à l’angioplastie. Nos travaux suggèrent un rôle clé de la régénération endothéliale dans la cicatrisation vasculaire après angioplastie. En effet, il apparait que la proportion de progéniteurs de profil de différenciation endothélial en réponse à l’angioplastie coronaire détermine la survenue d’une resténose intra-stent. Ces données ouvrent la voie à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologie menant à la resténose mais aussi à des perspectives thérapeutiques intéressantes. / Percutaneous coronary intervention is the most commonly used revascularization technique. However it has 2 main complications limiting its widespread: stent thrombosis and in stent restenosis. Stent thrombosis is an early event associated with a high mortality rate. Platelets are key in its physiopathology. The availability of platelet function tests allowing to determine platelet reactivity levels under therapy showed a variable ant platelet effect following aspirin and clopidogrel intake. We further demonstrated that tailoring anti platelet therapy according to platelet function tests results decrease the rate of stent thrombosis following PCI without increasing bleedings. In stent-restenosis is a late complication of PCI with bare metal stents. The pathophysiology of in-stent restenosis is dependent on the lesion and regeneration of the endothelium. Circulating endothelial biomarkers have recently been developed. We have demonstrated that this marker allow to evaluate the lesion and regeneration of the endothelium following PCI. We evidenced a transient increase in circulating endothelial cells following PCI which is dependent on the level of platelet reactivity inhibition demonstrating the interaction between platelets and the endothelium. At the same time, PCI induces mobilization of progenitor cells which is detectable early after the intervention. Our work suggests that these progenitor cells have a key role in endothelial regeneration after PCI. We evidenced for the first time that the proportion of endothelial progenitor cells among progenitor cells mobilized after PCI determine the occurrence of in stent restenosis. Altogether these data give critical inside into vascular regeneration after PCI in human and on the mechanisms associated with in stent restenosis thus providing new potential therapeutic target.

Compte tenu des enjeux technologiques qui sous-tendent la découverte de nouvelles classes de matériaux ultra-durs, des efforts de recherche considérables ont été destinés durant les deux dernières décades à la synthèse et à la caractérisation de composés légers prometteurs tels que les nitrures et boronitrures de carbone. Cependant, malgré de nombreuses tentatives de synth ese et les progrès indiscutables réealisés dans ce domaine, seuls des echantillons amorphes (mal caract eris es du point de la cristallographie) ont pu être obtenus dans différents laboratoires de recherche. En particulier, plusieurs problèmes sont soulevés de par la nature polymorphe des echantillons produits, conduisant de ce fait a une caractérisation spectroscopique peu précise. Par conséquent l'établissement de relations entre composition et propriétés de structure électronique est fourni sur une base théorique dans cette Thèse afin d'approfondir les caractéristiques des formes cristallines des matériaux. Comme on pouvait s'y attendre cette tâche complexe est vite devenue un défi compte tenu du manque de données expérimentales pour les structures cristallines susceptibles de servir de point de départ aux calculs. Il devint alors essentiel de proposer des phases modèles (hypothétiques) aux echelles bi- et tri-dimensionnelles pour etablir des tendances comparatives sur les stabilités, propriétés électroniques et mécaniques des nitrures et boronitrures de carbone. En particulier, les etudes systématiques des systèmes cristallins binaires CNx (où x=0,36 et 1,33) d'une part et ternaires BC2N d'autre part ont été menées et présentées comme une force de proposition vis a vis des expérimentateurs. Grâce aux enormes progrès de la technologie moderne des ordinateurs, il a été possible de mener ces etudes au moyen de méthodes ab initio en testant et sondant différentes approches de l' etude du solide. En fait, l'un des premiers objectifs du travail de Thèse a été de valider le meilleur schéma calculationnel au sein de la théorie de la fonctionnelle de la densité, DFT, susceptible de reproduire et/ou de predire la dureté et la stabilité d'une grande variété de matériaux ultra-durs. Les calculs des propriétés de cohésion et les enthalpies standard de formation ont été entreprises afin d'expliquer la stabilité thermodynamique des differentes compositions iso-electroniques, nommement C3N4, C11N4 et BC2N. La dureté a été également etudiée au moyen de l'analyse des modules d' elasticité et de compressibilité. L'examen des propriété de structure electronique a été réalisé par le calcul des densités d'etats, de la structure de bandes d' energie, des cartes de densité electronique et des populations de recouvrement. L'étude des déplacements chimiques par RMN du 13C de clusters moléculaires a permis de fournir un moyen de discrimination entre systèmes ayant des caractéristiques structurales très voisines. C'est notamment le cas des structures hexagonale et orthorhombique de C3N4 graphitique. Enfin, les seuils d'ionisation K de C, B et N ont été calculés (spectroscopie electronique par perte d' energie "EELS") pour les différentes structures cristallines afin de fournir des spectres de référence susceptibles d'aider à la détermination des compositions des echantillons polymorphes. Les résultats démontrent que les nitrures de carbone etudiés sont des matériaux ultra-durs ayant des propriétés mécaniques exceptionnelles. En particulier, les phases de la composition riche en carbone, C11N4, montrent des energies de cohésion supérieures et se présentent comme plus dures que l'analogue iso- electronique C3N4. Néanmoins la possibilité de déposer des stoechiométries monophasiques serait pénalisée pour les deux compositions compte tenu de leurs energies de formation fortement positives. L'introduction d'atomes de bore (boronitrues de carbone) conduit à une légère diminution des amplitudes des modules d' elasticité et de compressibilité. Mais les valeurs calcul ees restent supérieures à celles de BN cubique, le second meilleur matériau ultra-dur connu après le diamant. Néanmoins les phases tri-dimensionnelles BC2N analysées présentent des enthalpies de formation nettement exothermiques, ce qui est en faveur d'une préparation (par dépôt de couches minces par exemple) plus aisée de phases "BCN" par rapport aux nitrures binaires CNx pour lesquels les enthalipies de formation H_0f > 0. Par conséquent en consid erant l'ensemble des syst emes modèles, les phases "BCN" a liaisons hybridées essentiellement sp3 (tri-dimensionnelles) se présentent comme les meilleurs candidats pour de nouveaux matériaux ultra-durs a base d' eléments légers susceptibles d'être synth etis es par les moyens actuels. Ces observations sont appuyées par des résultats expérimentaux récemment obtenus.

Nous étudions dans cette thèse l'influence de la protéine VASP sur la dynamique et les propriétés mécaniques des réseaux d'actine à l'origine de la motilité cellulaire. Dans une première partie, nous utilisons un système biomimétique du mouvement constitué de billes. Incubées dans un mélange minimal de protéines soutenant la polymérisation, ces billes forment un réseau d'actine appelé " comète " les propulsant vers l'avant, semblable à celui qui sous-tend la membrane du front de migration des cellules en mouvement. Grace à des formes mutantes de VASP, nous explorons la contribution à son activité des domaines qui la composent. Dans nos conditions, nous montrons également que VASP agit au travers d'un mécanisme de coopération avec le complexe Arp2/3 qui est à l'origine de la formation des réseaux d'actine. Enfin, nous étudions les modalités de recrutement de VASP par les activateurs de la famille WASP/WAVE en mutant les sites potentiels de recrutement de VASP. Dans une seconde partie, nous nous intéressons, en collaboration avec deux équipes de recherche, au rôle de VASP dans la mécanique des réseaux d'actine. Nous caractérisons en rhéologie couplée à des observations en microcopie confocale les mécanismes moléculaires de VASP dans la réorganisation de l'architecture des réseaux d'actine, en lien avec leurs propriétés mécaniques, puis, nous étudions en AFM par nano indentation l'augmentation de rigidité des réseaux d'actine formés en présence de VASP.