Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Mycobacterium phlei est un micro-organisme Gram positif non pathogène. La paroi mycobactérienne provenant de M. ph/ei possède une activité anticancéreuse directe par induction de l'apoptose, de même qu'un effet immunostimulant. Ces activités semblent liées à la présence d'ADN compléxé à la paroi mycobactérienne. Cependant, les applications thérapeutiques de l'ADN mycobactérien dans le traitement systémique du cancer sont limitées du fait de la courte demi-vie de l'ADN qui est sensible aux dégradations enzymatiques. Ainsi, le but de cette étude consiste à développer un vecteur synthétique inerte pour l'ADN génomique de M. phlei puis à évaluer l'activité anticancéreuse de l'ADN mycobactérien une fois associé à un vecteur. Nous avons évalué l'activité cytostatique et la cytotoxicité de 5 types de vecteurs pharmaceutiques sur des cellules issues de mélanomes de souris (816-F1 ). Les liposomes anioniques composés de DPPC/DMPG montrent une activité cytostatique sans cytotoxicité directe. Les liposomes cationiques sont à la fois cytostatiques et cytotoxiques. Enfin, les liposomes composés de DPPC/DMPG/DSPE-PEG, les liposomes composés de DPPC/CHOL, les nanoparticules de lipides solides et les nanoparticules de chitosan ne présentent aucun effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire, ni d'effets cytotoxiques. Ces derniers sont donc sélectionnés pour le transport de l'ADN génomique de M. phlei. La formation d'un complexe ADN-lipide cationique (DOTAP) 5:1 (m/m) a permis l'incorporation de 10% de l'ADN dans les vecteurs neutres. Jusqu'à un rapport ADN-DOTAP 1 :1 (m/m), le lipide cationique ne modifie pas l'activité de base antiprolifératrice de l'ADN de M. phlei. L'ADN de sperme de hareng semble diminuer fortement la toxicité du DOTAP envers les cellules tumorales. Cependant, à un rapport 1 :1 (m/m) le DOTAP recouvre en partie sa toxicité une fois le complexe ADN-DOTAP associé au vecteur. Les liposomes cationiques ainsi que le chitosan fixent plus de 90% de l'ADN et permettent une plus grande protection vis à vis des DNases. L'efficacité antiprolifératrice de L'ADN génomique de M. phlei augmente fortement lorsqu'on l'associe sous forme de complexe ADN-DOTAP (5:1 ou 20: 1 (m/m)) aux liposomes neutres contenant du DMPG, ou aux liposomes DPPC/CHOL. De la même manière, l'association de l'ADN de M. phlei au chitosan sous forme de nanoparticules augmente significativement son activité anticancéreuse.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l'agent étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), code pour deux protéines de régulation, Tat et Rev, et quatre protéines accessoires, Vif, Vpr, Vpu et Nef. La protéine Vpu du VIH-1 augmente le relâchement des particules virales à partir de la surface des cellules infectées. De plus, Vpu augmente la production virale d'autres rétrovirus tels que MoMuLV et VISNA. Actuellement, la majorité des transferts de gènes sont effectués à l'aide de vecteurs rétroviraux dérivés de MoMuLV. Un des problèmes majeur limitant l'utilisation des vecteurs rétroviraux en thérapie génique est la faible production des virus recombinants. La première partie de cette étude indique que Vpu augmente la production virale des lignées d'encapsidation rétrovirales. En effet, Vpu induit une augmentation de la production virale de 40 et 13 fois pour les lignées d'encapsidation Damp et ivCRIP respectivement. Cette observation suggère que Vpu pourrait jouer un rôle important dans la génération de nouvelles lignées d'encapsidation en augmentant la production des vecteurs rétroviraux et donc l'efficacité du transfert de gènes. La protéine Vpr possède plusieurs fonctions qui contribuent à la réplication du VIH-1 in vitro et in vivo. L'une des fonctions importante de Vpr pour la réplication optimale du VIH-1 est l'induction d'un arrêt en G2 du cycle cellulaire qui favorise la production des protéines virales. Cette fonction précoce nécessite la présence de Vpr dans la particule virale. En effet, Vpr est incorporé en grande quantité dans les virions probablement via une interaction directe avec le domaine p6 de Gag. Cette caractéristique de Vpr permet de cibler des séquences d'acides aminés exogène à l'intérieur du VIH-1 sous forme de protéines de fusion. Une des application envisageable en thérapie génique serait de cibler des séquences protéiques en fusion avec Vpr capables d'interférer avec la réplication du virus. La deuxième partie de ce travail identifie les régions de Vpr comprenant les acides aminés 1 à 88 et 15 à 88 comme responsables de l'incorporation maximale de Vpr en fusion avec la chloramphénicol acétyle transférase (CAT). Les 88 premiers acides aminés de Vpr ont aussi été fusionnés aux 18 derniers acides aminés de Vpu pour générer la protéine de fusion VprIE. Lorsque produite constitutivement par des lymphocytes T CD4+ en culture de cellules, VprIE interfère efficacement avec la réplication du VIH-1. En effet, VprIE démontre un effet protecteur comparable à celui de la protéine anti-VIH-1 RevM10 actuellement en essais cliniques. Enfin, VprIE n'a pas permis l'apparition de souche résistante du VIH-1 capable de se répliquer en présence de la protéine de fusion. Ces résultats établissent les bases nécessaires à la génération de nouvelles protéines de fusion pouvant interférer plus efficacement avec la réplication du VIH-1. De plus, l'ensemble de ce travail indique qu'il est possible d'utiliser les fonctions des protéines Vpu et Vpr du VIH-1 pour des applications en thérapie génique.

Ce travail s'inscrit dans le cadre de recherche sur les maladies vectorielles de Lyme et Virus du Nil au sein de l'Agence de Santé Publique du Canada (ASPC) ayant pour finalité d'évaluer et de cartographier les risques sanitaires associés à ces maladies infectieuses liées au climat aux échelles municipales, provinciales et fédérale. Dans ce contexte, cette recherche vise à démontrer la faisabilité, la pertinence et les enjeux de recourir aux méthodes de réduction d'échelle pour obtenir à une haute résolution spatio-temporelle (100/30 m et 1 jour) avec au plus des marges d'erreur de 2 unités, des déterminants climatiques et microclimatiques (DCMC) en milieu hétérogène du Canada. Un cadre méthodologique d'application des méthodes de réduction d'échelle, Random Forest Regression (RFR), Thermal sharpening (TsHARP), Pixel block intensity modulation (PBIM), a été proposé pour estimer la température de surface (LST) de MODIS 1000 m à 100/30 m. Des expérimentations basées sur cette approche ont été effectuées sur trois sites au Québec à différentes époques. Les résultats, spatialement représentatifs, ont été validés avec les températures de l'air et celles prises par de Landsat 08 avec des marges d'erreur autour de 2°C. L'analyse des résultats démontre la capacité effective des méthodes de réduction d'échelle à discriminer la LST dans l'espace. Toutefois, dans le contexte du projet de l'ASPC, ces résultats sont non concluants à 100/30 m en l'absence d'une plus-value significative au plan spatial de LST. Cette analyse a conduit à discuter des enjeux temporels, spatiaux, méthodologiques et de gestion de gros volumes de données en lien avec la réduction d'échelle dans le contexte du projet. / This research is part of the Public Health Agency of Canada's (PHAC) research on Lyme and West Nile Virus vector-borne diseases, which aims to assess and map the health risks associated with these climate-related infectious diseases at the municipal, provincial and federal levels. In this context, this research aims to demonstrate the feasibility, relevance and challenges of using downscaling methods to obtain high spatial and temporal resolution (100/30 m and 1 day), with margins of error of no more than 2 units, of climatic and microclimatic determinants (CMDs) in a heterogeneous Canadian environment. A methodological framework for the application of downscaling methods, Random Forest Regression (RFR), Thermal sharpening (TsHARP), Pixel block intensity modulation (PBIM), has been proposed to estimate the surface temperature (LST) from MODIS 1000 m to 100/30 m. Experiments with our approach were carried out at three sites in Quebec at different times. The spatially representative results were validated with air and Landsat 08 temperatures with error margins around 2°C. The analysis of our results demonstrates the effective capacity of downscaling methods to discriminate LST in space. However, in the context of the ASPC project, these results are inconclusive at 100/30 m in the absence of a significant, expected increase in the spatial accuracy of LST. This analysis led to a discussion of the temporal, spatial, methodological and large data volume management issues related to downscaling in the context of the project.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le projet de séquençage du génome humain a incité les chercheurs à s'attaquer également aux génomes des bactéries. Considérées comme de véritables modèles pour la compréhension des mécanismes de la vie, plusieurs bactéries ont été étudiées. Le séquençage complet de leurs génomes a été proposé, nécessitant comme étape préparatoire la construction de plusieurs banques génomiques. Notre projet propose la construction d'une banque génomique de S. aureus, une bactérie pathogène très répandue, peu connue du point de vue de la génétique moléculaire et qui ne fait pas partie des micro-organismes pris comme modèles. Pour la construction de la banque génomique, l'ADN chromosomique de S. aureus a été digéré partiellement avec l'endonucléase de restriction Sau3AI. Les fragments plus grands de 9 kpb ont été séparés du reste du matériel par ultracentrifugation en gradient de sucrose. La fraction obtenue a été clonée dans des vecteurs plasmidiques tels que pUC18 et pBluescript II SK+ et ensuite électrotransformée dans des cellules DH5α. Les plasmides recombinants provenant de 3 000 clones ont été analysés, et nous avons retenu 800 clones porteurs de fragments chromosomiques d'au moins 9 kpb. Ils ont formé notre banque génomique, laquelle a été caractérisée et ensuite conservée à long terme. La taille moyenne des fragments insérés est de 9,85 kpb, et la probabilité de représentation du génome de S. aureus est de 94,2 %. La banque génomique construite a été utilisée pour localiser des clones contenant des fragments chromosomiques hybridant avec trois sondes disponibles. Il s'agit de sondes provenant de deux régions chromosomiques de S. aureus clonées et séquencées dans notre laboratoire. Les deux régions chromosomiques abritent des gènes respiratoires de la bactérie. Pour chaque sonde utilisée, nous avons trouvé dans la banque génomique un ou plusieurs clones hybridant avec la sonde. Les plasmides recombinants de cinq de ces clones ont été localisés par rapport à la carte de la région chromosomique respective et nous avons tracé leur carte de restriction. Ces plasmides contiennent des fragments qui élargissent la région chromosomique, déjà clonée dans notre laboratoire, de 2,6 à 6,3 kpb.

Aujourd'hui, la production de protéines thérapeutiques est effectuée principalement à partir de lignées de cellules d'ovaires de hamster chinois CHO. Ces cellules, contrairement aux systèmes bactériens et certains systèmes eucaryotes, sont capables d'effectuer toutes les modifications post traductionnelles nécessaires à la fonctionnalité de la protéine. Avec plusieurs centaines de protéines actuellement en essais précliniques, il est nécessaire de développer des méthodes de production de glycoprotéines efficaces et rapides dans les cellules CHO. Au cours de cette thèse deux nouveaux systèmes d'expression performants de protéines recombinantes dans les cellules CHO sont présentés. Ces systèmes reposent sur l'utilisation d'un virus épisomal (adenovirals) ou intégratif (lentivirus) comme vecteur de transfert et du système inductible au cumate pour le contrôle de l'expression des transgènes. Dans ce système inductible, la transcription débute lorsque le transactivateur au cumate (cTA) ou le transactivateur inverse au cumate (rcTA) se lie sur le promoteur inductible au cumate CR5. En présence de cumate, la liaison du cTA sur le promoteur CR5 est inhibée empêchant la transcription contrairement au rcTA dont la liaison avec le promoteur CR5 est possible seulement en présence de cumate. La première méthode consiste à infecter des cellules CHO exprimant le cTA (CHO-cTA) et le récepteur du coxackievirus et de 1'adenovirus (CAR) par un adenovirus de type 5 exprimant le transgène de la protéine d'intérêt dans ce cas-ci celui de l'alcaline phosphatase sécrétée (SEAP) sous le contrôle du promoteur CR5. Cette technique permet de produire à 30°C six jours suivant l'infection jusqu'à 63 ug/mL de SEAP dans des conditions de culture non optimisées. Des lentivirus ont également été utilisés pour l'expression stable de différents transgènes dans les cellules CHO exprimant le cTA ou le rcTA. Des lots de clones CHO ont été générés produisant à 30°C jusqu'à 65 ug/mL de SEAP dans les cellules CHO-cTA et 235 ug/mL d'une protéine de fusion CD200Fc, 160 ug/mL d'anticorps chimérique chB43 et 206 ug/mL d'érytliropoïétine EPO dans les cellules CHO-rcTA, sous des conditions de culture non optimisées. Ces résultats démontrent que l'utilisation de virus couplé à un système de contrôle performant de l'expression de transgènes permet de produire rapidement et en quantité importante une gamme variée de protéines thérapeutiques dans les cellules CHO.

Cette étude décrit les expositions aux chauves-souris signalées aux directions de santé publique du Québec et les interventions de prophylaxie post-exposition contre la rage humaine réalisées du I e ' octobre 2004 au 30 septembre 2006. Le taux de signalement et le taux de PPE annuels moyens sont respectivement de 12,3 et 4,8 par 100 000 personnes années. Les expositions où il n'y a pas eu de contact direct documenté sont 5 fois plus fréquentes et génèrent 3 fois plus de PPE que les expositions avec contact direct, malgré que celles sans contact représentent un risque plus faible. Une région a un taux de signalement 7,5 fois plus élevé que le taux provincial, ce qui fait soupçonner une sous déclaration des expositions au Québec. À partir de nos données et celles d'une étude en cours qui évalue la fréquence des expositions aux chauves-souris dans la population, il sera possible d'estimer la proportion des expositions pour laquelle des interventions sont faites.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine. La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe, progressive and orphan disease that is characterized by the absence of the functional muscle protein dystrophin. Gene therapy is currently investigated as a therapeutic approach to deliver dystrophin into muscles. Helper-dependent adenoviral vectors (HD) are promising gene transfer vehicles for gene therapy of DMD. Because HD are devoid of all adenoviral genes, they are weakly toxic, poorly immunogenic and possess sufficient cargo capacity to carry the full-length dystrophin cDNA. Although HD can provide dystrophin therapeutically in dystrophic mice, gene expression decays months after intramuscular injection. Two strategies that both aimed to stabilize dystrophin expression were explored here. The first strategy involved the integration of HD DNA into cellular chromosomes. Stabilizing HD DNA could prevent its elimination from muscles. A site-specific integrase from phage ΦC31 was used to integrate an HD carrying a selection marker in human cells and murine myoblasts. Efficacy of integration (obtained after selection) reached up to 0.5% per cell, and up to 76% of integration events (in clones) were mediated site-specifically. Although some deletions in HD extremities occurred, 70% of clones analyzed showed one integrated copy of HD (as expected). Only a small increase in the number of double-strand breaks was found in myoblasts expressing the integrase. In conclusion, HD integration was relatively efficient, specific and safe. This method could be used to stabilize dystrophin expression in vivo. The second strategy involved using a muscle-specific promoter (ΔUSEx3) to reduce potential toxicity induced by widespread expression of dystrophin. Because ΔUSEx3 would be delivered by HD, we investigated whether or not the viral context could affect ΔUSEx3 activity. We constructed an HD and a lentiviral vector (LV) carrying a reporter gene under its control. Strong, muscle-specific and stable (with LV) expression was obtained in vitro. Intramuscular injection of HD resulted into a powerful transgene expression contrasting with LV, where expression was relatively weak. Delivery of ΔUSEx3 in multiple tissues by HD demonstrated its muscle-specificity. Therefore, both the viral context and the muscular environments modulate ΔUSEx3 activity. Further studies are required to determine whether or not ΔUSEx3 can stabilize dystrophin expression in vivo.

La sélection de modèle est un thème majeur de l'apprentissage statistique. Dans ce manuscrit, nous introduisons des méthodes de sélection de modèle dédiées à des SVM bi-classes et multi-classes. Ces machines ont pour point commun d'être à coût quadratique, c'est-à-dire que le terme empirique de la fonction objectif de leur problème d'apprentissage est une forme quadratique. Pour les SVM, la sélection de modèle consiste à déterminer la valeur optimale du coefficient de régularisation et à choisir un noyau approprié (ou les valeurs de ses paramètres). Les méthodes que nous proposons combinent des techniques de parcours du chemin de régularisation avec de nouveaux critères de sélection. La thèse s'articule autour de trois contributions principales. La première est une méthode de sélection de modèle par parcours du chemin de régularisation dédiée à la l2-SVM. Nous introduisons à cette occasion de nouvelles approximations de l'erreur en généralisation. Notre deuxième contribution principale est une extension de la première au cas multi-classe, plus précisément à la M-SVM². Cette étude nous a conduits à introduire une nouvelle M-SVM, la M-SVM des moindres carrés. Nous présentons également de nouveaux critères de sélection de modèle pour la M-SVM de Lee, Lin et Wahba à marge dure (et donc la M-SVM²) : un majorant de l'erreur de validation croisée leave-one-out et des approximations de cette erreur. La troisième contribution principale porte sur l'optimisation des valeurs des paramètres du noyau. Notre méthode se fonde sur le principe de maximisation de l'alignement noyau/cible, dans sa version centrée. Elle l'étend à travers l'introduction d'un terme de régularisation. Les évaluations expérimentales de l'ensemble des méthodes développées s'appuient sur des benchmarks fréquemment utilisés dans la littérature, des jeux de données jouet et des jeux de données associés à des problèmes du monde réel / Model selection is of major interest in statistical learning. In this document, we introduce model selection methods for bi-class and multi-class support vector machines. We focus on quadratic loss machines, i.e., machines for which the empirical term of the objective function of the learning problem is a quadratic form. For SVMs, model selection consists in finding the optimal value of the regularization coefficient and choosing an appropriate kernel (or the values of its parameters). The proposed methods use path-following techniques in combination with new model selection criteria. This document is structured around three main contributions. The first one is a method performing model selection through the use of the regularization path for the l2-SVM. In this framework, we introduce new approximations of the generalization error. The second main contribution is the extension of the first one to the multi-category setting, more precisely the M-SVM². This study led us to derive a new M-SVM, the least squares M-SVM. Additionally, we present new model selection criteria for the M-SVM introduced by Lee, Lin and Wahba (and thus the M-SVM²). The third main contribution deals with the optimization of the values of the kernel parameters. Our method makes use of the principle of kernel-target alignment with centered kernels. It extends it through the introduction of a regularization term. Experimental validation of these methods was performed on classical benchmark data, toy data and real-world data

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal