Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A e B do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A e Bdo fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais. / Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animal’s age) and lyophilized for subsequent assays. Offspring’s mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animal’s ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A and B fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animal’s age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A and B fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snake’s diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-05-17T11:44:30Z No. of bitstreams: 1 2016 - Francis Barbosa Ferreira.pdf: 4527522 bytes, checksum: 6a5a6589610ff851e68801c3ec05e3c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T11:44:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Francis Barbosa Ferreira.pdf: 4527522 bytes, checksum: 6a5a6589610ff851e68801c3ec05e3c9 (MD5) Previous issue date: 2016-08-04 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / In this work, semi and thiosemicarbazones selected from the LaDMol-QM library, were used to study their interactions with a metalloproteinase from the snake Bothrops pauloensis (BpMP-I) by molecular modelling and enzymatic inhibition assays with the toxin. The crystalographic structure of BaPI (PDB code: 2W12) was used as a mold to build the 3D model of BpMP-I by homology modeling. The theorical model of BpMP-I showed good quality parameters and was used in a subsequent molecular modeling study. The thiossemicarbazones showed better molecular docking results and in vitro enzymatic inhibitions assays than semicarbazones. Studies by semi-empirical methods indicate a positive enthalpy of interaction, suggesting that the enzyme inhibition by these compounds must be a entropy-driven process. The results were used together to select the LDQM-IN-23 compound and propose rationally designed modifications to improve the interactions with the toxin. The study of the catalytic site of BpMP-I showed that there is an adjacent pocket with amino groups of the peptide bonds available for interaction. All results were used together to design structural changes, aiming the enhancing of the interaction with toxin. Therefore, was proposed the insertion of the carboxyl group with different spacers, containing 2 (LDQM-IN- 23b) and 3 methylene groups (LDQM-IN-23c). The docking results and semi-empiric optimization showed that there was a considerable improvement in the interaction for the modified compounds. The modified compounds were synthesized and tested for biological and enzymatic inhibition activity. It was observed that the IC50 values have improved: the original molecule, LDQM-IN-23 has an IC50 of 3,011 ?M and the modified molecules have IC50 of 79.12 (LDQM-IN-23b) and 1.77 ?M (LDQM-IN-23c). These molecules were tested for inhibition of hemorrhagic activity induced by Bothropoidin, a P-III class metalloproteinase, and by the B. pauloensis whole snake venom. The three molecules can inhibit the hemorrhagic activity induced by isolated toxin and whole venom, and LDQM-IN- 23c showed higher efficiency compared with the other two, and in a rate of 1:10 (w/w venom/inhibitor) the inhibition of the hemorrhagic activity was 100%. A molecular docking study of this lead compound with Snake Venom Metalloproteases (SVMPs) from different snake species and genera showed that this molecule can effectivelly interact with these SVMPs. / Neste trabalho, foram utilizadas semi e tiossemicarbazonas, selecionadas na quimioteca do LaDMol-QM (Dequim-UFRRJ), para o estudo das intera??es destas com o s?tio ativo de uma metaloprotease da pe?onha da serpente Bothrops pauloensis por modelagem molecular e ensaios de inibi??o da atividade enzim?tica e biol?gica sobre a toxina. A estrutura cristalogr?fica de uma metaloprotease (BaPI) complexada com um inibidor (um peptideomim?tico) (c?digo PDB 2W12) foi utilizada como molde para a constru??o do modelo 3D da metaloprotease da pe?onha de B. pauloensis (BpMP-I). O modelo 3D te?rico da BpMP-I, in?dito para esta toxina, apresentou bons par?metros de qualidade, sendo considerado adequado para estudos de planejamento de ligantes baseado na estrutura. As tiossemicarbazonas obtiveram melhores resultados, quando comparados com os resultados das semicarbazonas, tanto para os ensaios de docagem molecular quanto para estudos de inibi??o da atividade enzim?tica in vitro. Estudos por m?todos semiemp?ricos indicam uma entalpia de intera??o positiva, sugerindo que a inibi??o enzim?tica por estes compostos deve ser um processo controlado entropicamente. Os resultados foram utilizados para selecionar o derivado LDQM-IN-23 e propor modifica??es estruturais planejadas racionalmente, visando melhorar a intera??o deste com a toxina. O estudo do s?tio catal?tico da metaloprotease mostrou que esta possui uma cavidade adjacente com grupos amino das liga??es pept?dicas dispon?veis para intera??o. Foi proposta, ent?o, a inser??o de um grupo carboxilato com diferentes espa?adores, 2 (LDQM-IN-23b) e 3 grupos metileno (LDQM-IN-23c). Os resultados de docagem e otimiza??o semi-emp?rica mostraram que houve uma melhora consider?vel na intera??o dos ligantes modificados, os quais foram sintetizados e testados para as atividades de inibi??o enzim?tica e biol?gica. Na inibi??o enzim?tica, houve melhora da CI50 com o aumento do espa?ador. O composto LDQM-IN-23 tem CI50 de 3011,00 ?M e os compostos modificados possuem a CI50 de 79,12 (LDQM-IN-23b) e 1,77 ?M (LDQM-IN- 23c). Estes compostos foram testados para a inibi??o da atividade hemorr?gica in vivo induzida pela Botropoidina, uma metaloprotease da classe P-III, e pela pe?onha bruta de B. pauloensis. Os tr?s compostos conseguiram inibir a atividade hemorr?gica induzida pela toxina isolada e pela pe?onha, sendo que o composto LDQM-IN-23c mostrou maior efici?ncia, quando comparado com os outros dois, e para a propor??o de 1:10 (m/m pe?onha/inibidor) a inibi??o da atividade foi de 100%. Foi realizado um estudo de docagem deste composto l?der com outras metaloproteases de pe?onha de serpentes (SVMPs ? Snake Venom Metalloproteinases), de esp?cies e g?neros diferentes, mostrando que este ligante consegue interagir com outras SVMPs e ? um candidato para inibir a atividade hemorr?gica de SVMPs presentes na pe?onha, n?o s? de B. pauloensis, mas de outras serpentes