Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T18:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_M.pdf: 13631091 bytes, checksum: 614bd6add75c50691b0684d8afeade9b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Peçonhas de serpentes contêm enzimas que quebram ligações fosfáticas (ATPases, 5'-nucleotidases, fosfatases e fosfodiesterases ou PDE) e que agem sobre ácidos nucléicos (PDE, DNase e RNase). Nesse trabalho, purificou-se e caracterizou-se a PDE da peçonha de Bothrops alternatus. A PDE foi isolada da peçonha, usando-se uma combinação de cromatografias de gel filtração e troca iônica. Em SDS-PAGE, a enzima é constituída de uma única cadeia polipeptídica com uma massa molecular de 105 kDa, a qual foi inalterada pela presença do ß- mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A enzima foi reconhecida por anti-soro botrópico comercial, tanto no ELlSA como no immunoblotting. A enzima purificada era desprovida de nucleotidase, fosfatase alcalina e atividade proteolítica. O pH ótimo da PDE foi de 7.5 a 9.5, com temperatura ótima de 60°C. Houve perda rápida de atividade, após 1 minuto a 70°C. O Kmda enzima foi de 2.69 mM. A atividade da PDE foi potencializada pelo cobalto e, em grau menor pelo cálcio, enquanto que o cobre, manganês, zinco, EDTA and ß-mercaptoetanol foram inibitórios. Esses resultados mostram que esta enzima é pertence à família de proteínas da PDE isoladas de outras peçonhas ofídicas / Abstract: A phosphodiesterase was purified from the venom of the snake Bothrops alternatus by a combination of gel filtration and ion exchange chromatographies. In SDS-PAGE, the enzyme gave a single band with a molecular mass of 105 kDa which was unaltered in the presence of ß -mercaptoethanol, indicating that the protein contained no subunits. There were no contaminating 5'-nucleotidase, alkaline phosphatase and protease activities. The enzyme was recognized by commercial bothropic antiserum and gave a single band in immunoblotting. The enzyme had a pH optimum in the range of 7.5-9.5 and the optimum temperature was 60°C, with activity being rapidly lost within 1 min at 70°C. The Kmof the enzyme was 2.69 mM. PDE activity was potentiated by cobalt and, to a lesser extent, by calcium, whereas copper, manganese, zinc, EDTA and ß-mercaptoethanol were inhibitory. These properties show that this enzyme is very similar to that isolated from other snake venoms.4 / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Loxosceles laeta, conocida como “araña del rincón” o “araña casera”, es el principal artrópodo de importancia clínica en nuestro país debido a las graves alteraciones fisiológicas, con secuelas irreversibles que produce su mordedura en humanos pudiendo llevar a la muerte. El objetivo de este trabajo fue explorar y caracterizar parcialmente las enzimas proteolíticas presentes en este veneno; las enzimas evaluadas fueron proteolíticas sobre caseína y dimetilcaseína (DMC), así como la acción pro-coagulante sobre plasma humano citratado. El veneno fue fraccionado usando una columna cromatográfica de filtración molecular sobre Sephadex G-100, equilibrado con buffer acetato de amonio 0,05M pH 5,0. Mediante PAGE-SDS se determinó que la proteasa que hidroliza DMC es de naturaleza monomérica, con un peso aproximado de 35 kDa. En los ensayos de inhibición, con el agente quelante EDTA y el inhibidor de serinoproteasas (PMSF), se obtiene una inhibición de 60,4% de la actividad proteolítica usando 5 mM de EDTA y empleando 5 mM de PMSF la actividad pro-coagulante se redujo al 6,7%. Las pruebas de inmunodifusión doble, usando el antiveneno loxoscélico comercial (INS-Perú) mostraron la antigenicidad de las proteasas en estudio, así como del antiveneno total. Se concluye que el veneno de la araña L. laeta contiene por lo menos 2 tipos de proteasas, una del tipo metaloproteasa y la otra serinoproteasa, siendo ambas enzimas reconocidas por el antiveneno loxoscélico comercial.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Coorientador : Prof. Dr. Olga Meiri Chaim / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/02/2016 / Inclui referências : f. 33-34;53-61 / Área de concentração :Biologia Celular e Molecular / Resumo: Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em pacientes picados por aranhas do gênero Loxosceles, caracterizado principalmente por causar lesão dermonecrótica com intensa resposta inflamatória no local da picada, e raramente ocorrem manifestações sistêmicas, como distúrbios renais e hematológicos. O veneno loxoscélico é um líquido cristalino e incolor composto essencialmente por proteínas e peptídeos entre 5 a 40kDa, contendo cerca de 30?g de proteínas. Sabe-se que as toxinas da família das fosfolipases-D são capazes de desencadear a maioria dos efeitos biológicos causados pelo envenenamento, tornando-se necessário o aprofundamento da ação completa desta toxina. Algumas isoformas de fosfolipases-D de veneno de aranha-marrom já foram identificadas e biologicamente caracterizadas. Após análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno de Loxosceles intermedia, algumas prováveis novas isoformas desta toxina foram identificadas e, entre elas, uma se destacou por sua presença em proporção relevante. O objetivo deste trabalho foi a clonagem, expressão heteróloga e purificação desta nova isoforma de toxina dermonecrótica, de modo a permitir sua avaliação biológica por testes in vitro e in vivo. A partir de técnicas de biologia molecular, foi possível obter a sequência nucleotídica e, por sua vez, aminoacídica completas da LiRecDT7, relatando que esta possui uma substituição conservativa no resíduo de aminoácido Asp233'Glu233. Houve pouco rendimento na expressão da toxina recombinante na forma solúvel e o processo de purificação por cromatografia mostrou-se pouco eficiente. Os testes de atividade esfingomielinásica sugerem que esta toxina como enzima está ativa. Os resultados obtidos até o presente demonstram que esta toxina é uma nova isoforma de fosfolipase-D presente no veneno de L. intermedia. Ainda assim, o processo de expressão e purificação devem ser otimizados, para avaliá-la biologicamente, contribuindo para a compreensão da composição do veneno dessa espécie, além de ser mais uma alternativa de ferramenta com potencial de aplicação biotecnológica. Palavras-chave: aranha, Loxosceles intermedia, veneno, fosfolipase-D / Abstract: Loxoscelism is the name of the clinical picture provoked in patients bitten by Loxosceles spiders. It is mainly characterized by dermonecrotic lesions with an intense inflammatory response at the site of the bite, and rarely systemic manifestations such as renal and hematological disorders. The venom produced by Loxosceles spiders is a crystalline, colorless liquid consisting mainly of proteins and peptides between 5 and 40kDa. It is known that the phospholipase-D family of toxins present in this venom is capable of causing most of the biological effects observed in accidents with the spiders. Some isoforms of phospholipases-D have been identified in the Loxosceles venom and biologically characterized. Transcriptome analysis of the venom gland of Loxosceles intermedia revealed some potential novel isoforms of this toxin and among them, one stood out for its presence in significant proportion. The aim of this work was the cloning, heterologous expression and purification of this new isoform of dermonecrotic toxin, named LiRecDT7, to allow their biological evaluation by in vitro and in vivo analysis. Using molecular biology techniques, it was possible to obtain the nucleotide sequence and, in turn, the complete amino acid sequence of LiRecDT7. Further analysis showed a conservative substitution at amino acid residue Glu233'Asp233. The expression of recombinant toxin in soluble form resulted in a low yield and the process of purification by chromatography proved to be inefficient. Nevertheless, preliminary assays that tested the sphingomyelinasic activity of LiRecDT7 suggest that this toxin is active as an enzyme. The results show that LiRecDT7 is a new isoform of phospholipase-D present in the venom of L. intermedia. Still, the expression and purification process must be optimized to allow further assessments. Thus, the results will help to expand the knowledge concerning the composition of the venom of this species, besides being an alternative tool with potential biotechnological applications. Key-words: spider, Loxosceles intermedia, venom, phospholipase-D

Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a notinas previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3 foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos semelhantes a LiTx3, o presente estudo teve como objetivo a clonagem e expressão de um peptídeo dessa família. Primers foram desenhados para a realização das técnicas de 3' e 5' RACE, o qual teve como resultado a obtenção da sequência nucleotídica completa do cDNA correspondente ao peptídeo em estudo. A sequência do propeptídeo associado ao peptídeo maduro foi amplificada e modificada por PCR com primers contendo sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI e inseridos no vetor de expressão pET-14b. A construção foi transformada em cepa de E. coli AD494(DE3). Um teste de expressão foi realizado para determinar as condições ótimas de expressão do peptídeo. Verificou-se que a indução com 0,5mM de IPTG, por 3 horas e meia, a 30oC era a melhor condição de expressão. A partir desse resultado, uma expressão em larga escala foi realizada, obtendo-se o peptídeo recombinante na fração solúvel, após cromatografia de afinidade em resina de Ni2+-NTA. A diversidade de peptídeos presentes no veneno de L. intermedia representa uma fonte importante de possíveis novas ferramentas moleculares com aplicação farmacológica e/ou biotecnológica.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências de Saúde. / No mundo ocorrem muitos acidentes com animais peçonhentos e, entre eles, destacam-se os causados pelos escorpiões, que são considerados um problema de saúde pública. No Brasil, esses acidentes estão classificados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como doenças negligencias. O principal escorpião responsável pelos acidentes no país, e também o mais perigoso é o Tityus serrulatus, popularmente chamado de escorpião amarelo. A picada deste animal é uma ameaça grave ao indivíduo acidentado, já que seu veneno é composto por toxinas potentes que podem levá-lo à morte em poucas horas. Entre as toxinas do veneno, a mais tóxica e que corresponde a 15% do peso do veneno é chamada de Ts1. A Ts1 é classificada como β-neurotoxina que atua em canais de Na+. Por ser considerada a principal toxina da peçonha e exercer uma importância representativa no processo de envenenamento, neutralizá-la significaria uma possível neutralização da atividade tóxica do veneno. Desta forma, este estudo teve como objetivo identificar um epítopo conformacional da Ts1. Este epítopo foi sintetizado quimicamente e utilizado como antígeno na produção de um soro capaz de neutralizar a toxina e o veneno total. Para isso, foram utilizadas ferramentas de bioinformática utilizando os softwares Sting Millenium, Java Protein Dossier e SwissPDBviwer, síntese de peptídeos utilizando a técnica Fmoc-Sínteses, imunizações e soroneutralização em camundongos adultos. Os resultados de ELISA e de neutralização in vivo mostraram que o epítopo conformacional predito foi capaz de produzir anticorpos que reconhecem o veneno e neutralizam o seu efeito tóxico. Concluiu-se que a produção deste anticorpo, a partir do epítopo sintetizado, pode se tornar uma alternativa para a produção atual de antivenenos, além de atender a condições expostas em debates em torno da bioética.

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T19:10:02Z : No. of bitstreams: 1 cordeiro_ff_me_botfmvz.pdf: 669896 bytes, checksum: a563b65811a0515bad1e5a7935727526 (MD5) / O escorpionismo é um problema comum que acomete países tropicais e subtropicais e que assume grande importância médico-sanitária devido à sua fatalidade sobre aqueles indivíduos mais sensíveis, podendo levar crianças e idosos à morte. O potencial letal do envenenamento reside nas graves alterações cardiopulmonares que a toxina escorpiônica é capaz de gerar em suas vítimas. A presente pesquisa avaliou os efeitos do veneno do escorpião Tityus serrulatus em cães com duas diferentes doses: uma dose que simularia o envenenamento natural (0,4 mg/dose total) e outra dose experimental (0,25 mg/kg). Foram observados sinais clínicos gerais em diferentes momentos pós-envenenamento, bem como dados específicos relacionados ao sistema cardio-pulmonar por meio de mensuração da pressão arterial sistêmica, dosagem da atividade enzimática de CK-MB e de exames radiográficos, eletrocardiográficos e ecocardiográficos. Os resultados obtidos demonstraram que o veneno escorpiônico foi capaz de gerar lesão cardíaca aguda e reversível em poucos dias sob dose experimental e produziu quadro de envenenamento leve na dose que simulara o acidente natural. / Scorpionism is a common problem that occurs in tropical and subtropical countries and has great medical and sanitary significance because of its fatality in sensitive individuals, leading children and old people to death. The lethal potential of poisoning is due severe pulmonary and cardiac effects that scorpion toxin can cause in it's victims. The present research evaluated the effects of the Tityus serrulatus toxin in dogs using two different dosages: one dose that simulates the natural envenoming (0,4 mg/total dose) and another experimental dose (0,25 mg/kg). General clinical signs were observed at different moments after the poisoning, as well as specific signs related to cardiac and pulmonary systems by using arterial blood pressure measurement, CK-MB enzymatic activity as well as radiographic, electrocardiographic and echocardiographic evaluations. The results showed that scorpion toxin can cause acute and reversible cardiac lesions under experimental dosage and produced mild poisoning at the dosage that simulated natural envenoming.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-10-24T13:59:03Z No. of bitstreams: 1 2012_TayanaKariyadosSantos.pdf: 1916483 bytes, checksum: 1da6d0a3a422596840dde29ca4f8afbd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-29T11:50:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_TayanaKariyadosSantos.pdf: 1916483 bytes, checksum: 1da6d0a3a422596840dde29ca4f8afbd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-29T11:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_TayanaKariyadosSantos.pdf: 1916483 bytes, checksum: 1da6d0a3a422596840dde29ca4f8afbd (MD5) / Os acidentes ofídicos, causados principalmente por serpentes do gênero Bothrops, são uma importante questão de saúde pública no Brasil. O tratamento de suas vítimas é baseado na administração do soro antiofídico produzido a partir do plasma de cavalos imunizados com peçonha. Por ser composto por anticorpos e outras moléculas, todas de origem equina, a utilização do soro pode gerar diversas respostas imunes adversas contra seus componentes, já que são heterólogos ao paciente. Com o objetivo de desenvolver novos anticorpos humanos para uso clínico, foram isolados Fabs específicos para peçonha de Bothrops atrox a partir de uma biblioteca combinatorial de Fabs humanos apresentada na superfície de fagos. Um deles, Fab D12, foi selecionado para expressão. Como sistema de expressão heteróloga do Fab em questão foi utilizada a levedura metilotrófica Pichia pastoris e o gene heterólogo foi posto sob controle do promotor AOX1, que é fortemente ativado na presença de metanol como única fonte de carbono. O melhor nível de produção em frasco, aproximadamente 30 mg/L, foi alcançado fazendo-se o acúmulo de biomassa durante 24 horas a 30 °C em meio contendo glicerol como fonte de carbono e a etapa de indução da síntese do Fab a 20 °C durante 48 horas, com alimentação de metanol a cada 12 horas. A purificação da proteína de interesse foi realizada por cromatografia de afinidade com íons Ni2+ já que ela carrega em sua porção carboxi-terminal uma cauda de histidina que tem afinidade por esses íons. Por meio de teste de ligação direta à peçonha verificou-se que o Fab D12 puro é capaz de reconhecer o extrato bruto da peçonha. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Snake bites, mainly caused by Bothrops snakes, are an important public health issue in Brazil. The treatment of victims is based on the administration of antiophidic serum which is produced from plasma of horses immunized with venom. As it is composed of antibodies and other molecules, all of equine origin, the serum can cause adverse immune responses against various components as they are heterologous to the patient. Aiming the development of new human antibodies for clinical use, it was isolated Fabs specific for the venom of Bothrops atrox from a combinatorial library of human Fabs displayed on the surface of phage. One of them, Fab D12, was chosen for expression. As system for heterologous expression of the Fab in question was used the methylotrophic yeast Pichia pastoris and the heterologous gene was put under the control of AOX1 promoter, which is strongly activated in the presence of methanol as sole carbon source. The higher level of production in flask, approximately 30 mg/L, was achieved by performing the growth of biomass for 24 hours at 30 ° C in media containing glycerol as sole carbon source and induction of the synthesis of Fab at 20 ° C for 48 hours, with methanol feed at each 12 hours. The purification of the protein of interest was performed by affinity chromatography with Ni2+ ions as it carries on its carboxy-terminus a histidine tail which has affinity for these ions. Through direct binding assay was confirmed that pure Fab D12 is capable of recognizing the crude extract of B. atrox venom.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2010. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-07-01T18:53:15Z No. of bitstreams: 1 2010_GeraldinoSilvaAndradeCFilho.pdf: 10642767 bytes, checksum: 2e900e5b7640cb08b6480439338800d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-07-03T16:20:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_GeraldinoSilvaAndradeCFilho.pdf: 10642767 bytes, checksum: 2e900e5b7640cb08b6480439338800d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-03T16:20:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_GeraldinoSilvaAndradeCFilho.pdf: 10642767 bytes, checksum: 2e900e5b7640cb08b6480439338800d4 (MD5) / A secreção cutânea de diferentes espécies de sapos constitui em uma fonte rica de bufadienolídeos, os quais exibem interessante diversidade estrutural e inúmeras propriedades biofarmacológicas. Neste trabalho, foi realizado o isolamento de bufadienolídeos do veneno do sapo Rhinella schneideri incluindo a marinobufagina (20), telocinobufagina (21), bufalina (22), helebrigenina (23), a atípica 20S,21Repoximarinobufagina (62), além da 19-hidroxitelocinobufagina (63) e o amplamente distribuído fitoesteróide _-sitosterol (19). Dos bufadienolídeos naturais, foram preparados os seguintes derivados: 3_-acetóxi-marinobufagina (64), 3_-acetóxibufalina (65), 3_-acetóxi-telocinobufagina (66), 3_-acetóxi-20S,21Repoximarinobufagina (67), 3b,5b-diacetóxi-marinobufagina (68), 3b,5b,14b-triacetóxitelocinobufagina (69) e 3b,14b-diacetóxi-bufalina (70), pela proteção das hidroxilas nos compostos 20 a 22 e 62; 20R,21S-epoximarinobufagina (71), 20,21- epoxitelocinobufagina (72) e 20,21-epoxibufalina (73), pelo tratamento dos compostos 20 a 22 com Fe(acac)3-H2O2; 3-oxo-marinobufagina (74), pela oxidação de 20 com PCC; 3-O-formil-marinobufagina (75), 3-O-formil-telocinobufagina (76), 3-O-formilbufalina (77) e 3-O-formil-20S,21R-epoximarinobufagina (78) por meio da formilação de 20, 21, 22 e 63 com ácido fórmico; 14a-H-15-oxo-3b,5b-dihidróxi-bufa-20,21-dienolídeo (79) e 14b-H-15-oxo-3b,5b-dihidróxi-bufa-20,21-dienolídeo (80), pela abertura do epóxido com ácido perclórico em 20, além de 3-oxo-5b-hidróxi-14b,15b-20,21- diepóxibufa-16,22-dienolídeo (83) pelo tratamento de 20 com CrO3-ácido acético. A caracterização estrutural de outros subprodutos derivados encontra-se em processamento e será detalhada oportunamente. A avaliação citotóxica dos compostos naturais 19 a 23, 62 e 63 e seus derivados 64 a 67 exibiram de moderada a intensa atividade contra as linhagens de células tumorais HL-60, SF-295, MDA-MB-435 e HCT- 8. Linfócitos sanguíneos periféricos (PBLs) foram suscetíveis à ação tóxica dos compostos testados, os quais, no entanto, não produziram hemólise em eritrócitos de ratos. O ensaio de inibição de Na+/K+-ATPase demonstrou que a telocinobufagina (21) e a bufalina (22) apresentaram maior afinidade às subunidades a2 e a3 da enzima isolada do hemisfério cerebral de rato, quando comparado à marinobufagina (20). No ensaio com a isoenzima da bomba de sódio a1b foi observado efeito aditivo na combinação ouabaína/marinobufagina e ouabaína/telocinobufagina. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Glandular secretions of toad species are an important source of bufadienolides, which exhibit interesting structural diversity and several biopharmacological properties. Here in it is described the isolation of bufadienolides from the Brazilian toad Rhinella schneideri parotoid glands secretion, including: marinobufagin (20), telocinobufagin (21), bufalin (22), hellebrigenin (23), the atypical 20S,21R-epoxymarinobufagin (62), 19- hydroxytelocinobufagin (63), besides the widespread steroid _-sitosterol (19). From natural bufadienolides were prepared the following derivatives: 3_-acetoxymarinobufagin (64), 3_-acetoxy-bufalin (65), 3_-acetoxy-telocinobufagin (66), 3_- acetoxy-20S,21R-epoxymarinobufagin (67), 3b,5b-diacetoxy-marinobufagin (68), 3b,5b,14b-triacetoxytelocinobufagin (69), and 3b,14b-diacetoxy-bufalin (70) by protection of hydroxyl at compounds 20 to 22, and 62; 20R,21S-epoxymarinobufagin (71), 20,21-epoxytelocinobufagin (72), and 20,21-epoxybufalin (73) by treatment of compounds 20 to 22 with Fe(acac)3-H2O2; 3-oxo-marinobufagin (74) by oxidation of compound 20 with PCC; 3-O-formyl-marinobufagin (75) by formylation of compound 20 with formic acid; 14a-H-15-oxo-3b,5b-dihydroxy-bufa-20,21-dienolide (79) and 14b-H- 15-oxo-3b,5b-dihydroxy-bufa-20,21-dienolide (80) by epoxide opening with perchloric acid at compound 20, and 3-oxo-5b-hydroxy-14b,15b-20,21-diepoxi-bufa-16,22- dienolide (83) by treatment of 20 with acetic acid-CrO3. The structural characterization of other byproducts derivatives are undergoing and will be detailed in due course. The cytotoxic evaluation showed that natural compounds 19 to 23, 62, and 63 and their derivatives 64 to 67 exhibited moderate to strong activity against human HL-60, SF-295, MDA-MB-435, and HCT-8 cancer cell strains. Peripheral blood lymphocytes (PBLs) were vulnerable to the toxic action of tested compounds, which however did not promote hemolysis of mouse erythrocytes. The Na+/+K-ATPase inhibitory assay demonstrates that telocinobufagin (21) and bufalin (22) showed more affinity to a2 and a3 subunities of the enzyme from rat cerebral hemisphere when compared to the marinobufagina (20). On the inhibition of human Na+/K+-ATPase a1b1 isoenzyme, additive effect was observed from the combination ouabain/marinobufagin as well as ouabain/telocinobufagin.