Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Coorientador: Débora Colombi / Banca: Consuelo L. Fortes-Dias / Banca: Marcelo Fossey / Banca: Paulo Eduardo M. Ribolla / Banca: João Renato Carvalho Muniz / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical e áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 90% dos acidentes ofídicos, sendo que os acidentes provocados por este último apresentam relativa alta taxa de mortalidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops possuem uma classe de fosfolipases A2, as Lys49-PLA2s, que não possuem atividade catalítica, mas são capazes de induzir a mionecrose por uma mecanismo não catalítico que não é totalmente conhecido. Com relação às fosfolipases A2 veneno das serpentes do gênero Crotalus, o complexo crotoxina, formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (catalítica) pode constituir até cerca de 60% do veneno desses animais, como no caso da subespécie Crotalus durissus terrificus, e é uma potente neurotoxina que provoca um grande bloqueio da transmissão neuromuscular. Neste trabalho, utilizando diversas técnicas teóricas e experimentais, sobretudo cristalografia de raios X, são apresentados diversos resultados que visam aprofundar o conhecimento acerca do funcionamento destas proteínas. Com relação à crotoxina, é apresentado a estrutura cristalográfica da crotoxina B de Crotalus durissus colillineatus, a expressão heteróloga da isoforma CBa2 da crotoxina B de Crotalus durissus terrificus para a posterior produção de formas mutantes sítio-dirigidas e resultados da análise do espalhamento de raios X a baixo ângulo da crotoxina e de suas subunidades isoladas, gerando informações relevantes e inéditas acerca da oligomerização destas proteínas. No caso das Lys49-PLA2s isoladas do veneno botrópico, são apresentadas duas novas estruturas cristalográficas dessa classe de proteínas isolada da serpente amazônica B. brazili. A análise ... / Abstract: Snakebite is a very serious public health problem still today, affecting tropical and subtropical countries, especially the rural areas of Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, Bothrops and Crotalus snake genus are responsible of almost 90% of snakebites. The venoms of Bothrops snakes have a class of phospholipases A2, known as Lys49-PLA2s, which do not have catalytic activity. However, they are able to induce myonecrosis by a non-catalytic mechanism that is not fully understood. In the venom of Crotalus snakes, a phospholipase A2, known as crotoxin constitutes about 60% of the venom from these animals. This protein is a potent neurotoxin that causes a large block of neuromuscular transmission formed by complexation of crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic). In this work, it was used several theoretical and experimental techniques, in particular X-ray protein crystallography, to generate information to extend the knowledge of the action of these proteins. Regarding to crotoxin, the crystal structure of crotoxin B isolated from Crotalus durissus colillinetaus was solved and the heterologous expression of isoform CBa2 of crotoxin B from Crotalus durissus terrificus was performed, in order to, subsequently, produce site-directed mutants. Furthermore, it is presented small angle X-ray scattering experiments with the crotoxin and its isolated subunits that provided intriguing and novel information about the oligomerization of these proteins. Regarding to Lys49-PLA2s from Bothrops snakes, it is presented two new crystal structures of this class isolated from Amazonian snake B. brazili. The analysis of these structures and the structural comparison to other Lys49-PLA2s crystallographic structures generated new information about the position of hydrophobic residues in C-terminal portion of these proteins. This information led us to a new proposition of the mechanism of action of these proteins. It is also presented ... / Doutor

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Banca: Selma Dzimidas Rodrigues / Banca: Luciana Reitz de Carvalho / Resumo: Os estudos na área de biotecnologia marinha vêm crescendo nas ultimas décadas e os trabalhos recentes têm revelado inúmeros compostos com potencial farmacológico. O Brasil apresenta um extenso litoral, bastante diversificado em espécies e recursos abundantes para uma pesquisa tecnológica dos organismos marinhos. Os polissacarídeos sulfatados de algas já vêm sendo utilizados em diversas aplicações, principalmente inibindo a atividade de determinadas enzimas, como aquelas relacionadas à cascata de coagulação. Este estudo teve como objetivo mostrar a relevância destas moléculas na modulação das atividades enzimática e inflamatórias das Fosfolipases A2 secretórias extraídas do veneno da Crotalus durissus terrificus. O estudo mostrou que os efeitos biológicos e farmacológicos estão relacionados com a fonte dos polissacarídeos sulfatados, ou seja, a macroalga de origem, mas também com sua estrutura química, a composição dos açucares e a massa molecular. Através da cromatografia por exclusão molecular foi possível identificar as massas moleculares aproximadas dos açucares e também pode revelar a interação existente entre a Fosfolipase A2 e os polissacarídeos sulfatados. Os testes enzimáticos revelaram que a ação fosfolipásica é dose dependente do açúcar, ou seja, em baixas doses de polissacarídeos sulfatados das macroalgas Botryocladia occidentalis e Codium isthmocladum, a atividade da Fosfolipase A2 diminuiu e aumentou, respectivamente. Porém, em altas doses, a atividade enzimática aumentava e diminuía, respectivamente, para as mesmas algas. A atividade enzimática diminuiu ao longo do tempo para o polissacarídeo sulfatado da Caulerpa racemosa. Para esta clorófita, a atividade edematogênica aumentou enquanto para as outras diminuíam, bem como para o teste de miotoxicidade / Abstract: Studies in the field of marine biotechnology have been growing in recent decades, and recent studies have revealed numerous compounds with pharmacological potential. Brazil has an extensive coastline, quite diverse in species and abundant resources for technological research of marine organisms. The sulfated polysaccharides of algae have already been used in several applications, mainly by inhibiting the activity of certain enzymes, such as those related to the coagulation cascade. This study aimed to show the relevance of these molecules in the modulation of inflammatory and enzymatic activities of Phospholipase A2 secretory extracted from the venom of Crotalus durissus terrificus. The study showed that the biological and pharmacological effects are related to the source of sulfated polysaccharides, or origin of the seaweed, but also their chemical structure, composition and molecular weight of sugars. Through molecular exclusion chromatography was possible to identify approximate molecular masses of sugars and can also reveal the interaction between the phospholipase A2 and sulfated polysaccharides. The tests revealed that the enzyme phospholipase action is dose-dependent sugar, or low doses of sulfated polysaccharides of macroalgae and Codium isthmocladum, Botryocladia occidentalis, the phospholipase A2 activity decreased and increased, respectively. However, at high doses, the enzyme activity increased and decreased, respectively, for the same algae. The enzyme activity decreased over time for the sulfated polysaccharide the Caulerpa racemosa. For this seaweed, the enzymatic activity increased while the edema decreased / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:31:20Z : No. of bitstreams: 1 buchi_at_me_botfm.pdf: 494324 bytes, checksum: 8a45f84c2c6a750412659b4b78ff10f4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As serpentes do gênero Crotalus durissus terrificus possuem em seu veneno diversas substâncias, entre elas uma serinoprotease com atividade trombina símile denominada giroxina, a qual é capaz de coagular o fibrinogênio plasmástico, promovendo a formação de fibrina. O objetivo do estudo foi a purificação e caracterização estrutural da enzima giroxina de Crotalus durissus terrificus. Para tanto, foram utilizadas métodos cromatográficos de gel filtração em Sephadex G75 e afinidade em Benzamidina-Sepharose 6B para isolamento e purificação; eletroforéticos de SDSPAGE 12% reduzido e de seqüenciamento do N-terminal da enzima purificada para identificação e avaliação do grau de pureza; clonagem e expressão do cDNA da glândula venenífera por RT-PCR e testes de cristalização. A modelagem teórica molecular foi realizada a partir de ferramentas de bioinformática baseadas em análises comparativas de outras serinoproteases depositadas no NCBI (National Center for Biotechnology Information). O seqüenciamento N-terminal da giroxina purificada, produziu uma proteína de cadeia única com massa molecular aproximada de 30 KDa e sua seqüência completa de cDNA apresentou 714 pb os quais codificaram uma proteína completa contendo 238 aminoácidos. Foram obtidos cristais a partir das soluções nos 2 e 5 do Kit Crystal Screen® 2 e 1 respectivamente, verificando-se sua constituição protéica. Para os alinhamentos múltiplos da sequência molde giroxina símile B2.1 com outras seis serinoproteases derivadas de veneno de serpentes (SVSPs) indicou-se a preservação de resíduos de cisteína e de seus principais elementos de estruturais (α-hélices, β-barris e loops).Evidenciou-se a localização da tríade catalítica nos aminoácidos His57, Asp102, Ser198 e os sítios de atividade especifica S1 e S2 nos aminoácidos Thr193 e Gli215 respectivamente... / The venom of snakes Crotalus durissus terrificus genus have in their various substances, including a serinoproteases with thrombin-like activity called gyroxin, which clot the plasmatic fibrinogen and promote the fibrin formation. The objective of this study was purificate and characterize structurally the gyroxin enzyme from Crotalus durissus terrificus. For this, we used chromatographic gel filtration with Sephadex G75 and affinity benzamidine-Sepharose 6B for isolation and purification, SDS-PAGE 12% in reduce conditions for assessment purity, N-terminal sequencing of purified enzyme for identification and assessment purity; the cloning and expression of cDNA from venom gland by RT-PCR and crystallization tests. The theoretical molecular modeling was performed with bioinformatics tools based on comparative analysis of other serinoproteases deposited in the NCBI (National Center for Biotechnology Information). The N-terminal sequencing purified gyroxin protein produced a single chain with a molecular mass of approximately 30 kDa and its full-length cDNA had 714 bp which encoded a complete protein containing 238 amino acids. Crystals were obtained from the solutions 2 and 5 of the Crystal Screen Kit ® 2 and 1 respectively and was verificated a protein constitution. For multiple sequence alignments such gyroxin-like B2.1 with six other serinoproteases derived from snake venom (SVSPs) indicated the preservation of cysteine residues and its main structural elements (α helices, β-barrel and loops). Identificated the amino acids positions in the catalytic triad His57, Asp102, Ser198 and sites of specific activity in S1 and S2 amino acids Thr193 and Gli215 respectively. The recognition area of fibrinogen cleavage in SVSPs to template sequence gyroxin B2.1 was located in residues Arg60, Arg72, Gln75, Arg81, Arg82, Lis85, Glu86, Lis87... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: José Luiz de Mello Nicoletti / Coorientador: Yara Cury / Banca: Renée Lauffer Amorim / Banca: Paulo Sérgio Lacerda Beirão / Resumo: A crotoxina, uma neurotoxina isolada do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus, apresenta efeito antiinflamatório, imunomodulador e analgésico. Neste trabalho, o efeito da crotoxina sobre o desenvolvimento do neuroma e dor neuropática foi investigado. Para a indução da lesão nervosa, o nervo ciático de ratos foi submetido à transecção e remoção de um fragmento de 0,5 cm. Para avaliação da hiperalgesia foi utilizado o teste de pressão de pata. A formação do neuroma foi determinada por estudos histopatológicos. A hiperalgesia foi detectada 2 h após a cirurgia persistindo por 64 dias. O grupo controle desenvolveu neuroma no coto proximal do nervo transeccionado, a partir do 7o dia, sendo que 80 % dos animais apresentaram neuromas ao final do experimento (64o dia). A crotoxina aplicada nos cotos proximais e distais imediatamente após a transecção do nervo promoveu o bloqueio da hiperalgesia. O efeito analgésico foi observado 2 h após a administração da crotoxina, persistindo por 64 dias. A analgesia induzida pela crotoxina foi bloqueada pela administração de atropina e pela administração de zileuton, e inibida parcialmente pela administração de ioimbina e metisergida. Estudos histopatológicos mostram que a crotoxina retarda em 7 dias o desenvolvimento do neuroma. Estes resultados demonstram que a crotoxina promove analgesia de longa duração e retarda o desenvolvimento do neuroma. O efeito analgésico da crotoxina neste modelo de dor neuropática é mediado por ativação de receptores muscarínicos centrais e parcialmente, por receptores -adrenérgicos e serotoninérgicos. Mediadores lipídicos derivados da via da 5-lipoxigenase, participam da modulação destes efeitos / Abstract: Crotoxin (CTX), a neurotoxin isolated from Crotalus durissus terrificus snake venom(CdtV) induces analgesia, anti-inflammatory and immunomodulation effects. However, CTX effects on neuropathic pain have never been showed. For induction of neuropathic pain, the sciatic nerve of male Wistar rats was transected in two locations at the mid-thigh level and 0.5 cm of the nerve was removed. Pain-related behavior and development of neuromas were analyzed over a 64-day period after surgery. The rat paw pressure test was used for hyperalgesia evaluation. The presence of neuromas was determined by histological analysis of the nerves. Hyperalgesia was detected 2 h after surgery and persisted for 64 days. Control group showed neuromas until day 7, however 80% of the rats presented neuromas on day 64. CTX applied to the proximal and distal nerve stumps, immediately after nerve transection, blocked hyperalgesia. The analgesic effect was observed 2 h after CTX treatment and persisted for 64 days. CTX-induced analgesia was blocked by administration of atropine and administration of zileuton and partially inhibited by yohimbine and methysergide. Histological analysis showed that CTX delays for about 7 days the development of neuromas. The results indicate that CTX induces a long-lasting analgesic effect on neuropathic pain of transected sciatic nerve and inhibits the development of the neuropathy. The analgesic effect is mediated by central muscarinic receptors and partially by -adrenoceptors and serotonergic receptors. 5-lipoxygenase lipidic mediators are involved in this modulation / Mestre

Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Lucilena Delazari dos Santos / Banca: Ricardo de Oliveira / Resumo: A leishmaniose visceral americana, causada pelo parasita intracelular Leishmania (L) infantum chagasi, é transmitida pela picada do mosquito Lutzomyia longipalpis. O tratamento é realizado à base de quimioterápicos clássicos, que desenvolvem importantes efeitos colaterais no hospedeiro. A prospecção de novas drogas é o grande desafio mundial do momento. Assim, este estudo realizado in vitro teve por objetivos avaliar o efeito anti-leishmania de frações do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi. Do veneno total foram extraídas e purificadas duas frações denominadas respectivamente de fosfolipase A2 (PLA2) e peptídica. Além disso, formas promastigotas e macrófagos infectados por amastigotas foram expostos a uma diluição seriada de PLA2 e da fração peptídica em intervalos que variaram entre 1,5625 μg/mL e 200 μg/mL. Ambas demonstraram atividade contra as formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi variando de acordo com as doses testadas e o tempo de incubação. O ensaio MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) das frações contra as formas promastigotas mostrou IC50 de 52,07 μg /mL para a PLA2, e uma IC50 de 16,98 μg/mL para a fração peptídica. O ensaio MTT para se avaliar a citotoxicidade nos macrófagos peritoneais mostrou uma IC50 de 98 μg/mL para PLA2 e uma IC50 16,98 μg/mL para a fração peptídica. Nos macrófagos peritoneais infectados pelas formas amastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi a PLA2 estimulou o crescimento dos parasitas; em doses mais elevadas foi capaz de controlar em 23% o seu crescimento. A fração peptídica controlou 43% do crescimento do parasita intracelular na dose de 16,98 μg/mL., mostrando-se tóxica acima desta doe para os macrófagos. Ambas as frações estimularam a produção de H2O2 pelos macrófagos, mas apenas PLA2 foi capaz de estimular a produção ... / Abstract: American visceral leishmaniasis is caused by the intracellular parasite Leishmania ( L ) infantum chagasi , and transmitted by sand fly Lutzomyia longipalpis. Treatment is based on classical chemotherapeutics with significant side effects and the search for new drugs is the greatest global challenge. Thus , this in vitro study aimed to evaluate the anti - leishmanicidal effect of Crotalus durissus terrificus venom's fractions on promastigotes and amastigotes of Leishmania (L) infantum chagasi. The whole venom were purified two fractions called respectively phospholipase A2 (PLA2) and peptide. Furthermore, promastigotes and macrophage infected per amastigotes were exposed to serial dilutions of the peptide fraction and PLA2 at intervals varying between 1.5625 μg/mL and 200 μg/mL. Both showed activity against promastigotes and varies according to the tested doses and the time of incubation. The MTT assay (3-(4,5-Dimethyl-1,3- thiazol-2-yl)-3,5-diphenyl-2H-tetrazol-3-ium bromide) against promastigotes showed IC50 of 52.07 μg/mL to PLA2, and 16.98 μg/mL for peptide venom's fraction. The MTT assay to evaluate the cytotoxicity in peritoneal macrophages showed an IC50 of 98 μg/mL for PLA2 and 16.98 μg/ml for peptide. In peritoneal macrophages infected by Leishmania (L) infantum chagasi amastigotes the PLA2 stimulated growth of parasites, at higher doses was able to control 23 % growth. The peptide fraction controlled 43 % of the intracellular parasite growth at a dose of 16.98 μg/mL, showing up this dose toxic to macrophages . Both fractions stimulated H2O2 production by macrophages but only PLA2 was able to stimulate NO production . The results encourage further studies to describe the metabolic pathways involved in cell death , as well as the prospect of molecules with antiparasitic activity present in the peptide fraction of Crotalus durissus terrificus / Mestre

Resumo: O ensaio imunoenzimático de ELISA foi utilizado para avaliar, acompanhar e comparar a resposta imune humoral de camundongos SWISS durante o processo de hiperimunização com veneno nativo e irradiado com Cobalto-60 (60Co) obtido das serpentes Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni. A potência e a capacidade de neutralização foram avaliadas por meio de desafios "in vitro". A imunidade obtida ao final do processo de hiperimunização foi verificada mediante desafio "in vivo" e os efeitos colaterais foram avaliados. A imunização dos animais, com uma DL50 de cada veneno, ocorreu nos dias um, 15, 21, 30 e 45, quando foram colhidas amostras de sangue. No 60º dia ocorreram os desafios. Os resultados demonstraram que o teste de ELISA mostrou-se eficiente na avaliação, acompanhamento e comparação da resposta imune dos camundongos durante o processo de hiperimunização. Os títulos do soro produzido com veneno nativo foram semelhantes aos títulos do soro obtido com veneno irradiado. A capacidade imunogênica foi mantida após a irradiação com 60Co. O soro produzido a partir do veneno irradiado de Crotalus durissus terrificus apresentou potência e capacidade de neutralização maiores, quando comparado ao soro obtido a partir do veneno nativo.Os anticorpos antiveneno nativo e irradiado, mediante os desafios "in vitro", mostraram-se igualmente eficazes na neutralização dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops. Todos anticorpos foram capazes de neutralizar cinco DL50 dos respectivos venenos. As alterações clínicas foram mínimas durante o processo de hiperimunização com veneno irradiado e evidentes com veneno bruto. / Abstract: ELISA was used to evaluate, follow, and compare the humoral immune response of Swiss mice during hyperimmunization with natural and Cobalt-60- irradiated (60Co) Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. Potency and neutralization were evaluated by in vitro challenges. After hyperimmunization, immunity was observed by in vivo challenge and the side effects were assessed. The animals' immunization with one LD50 of each venom was on days one, 15, 21, 30, and 45, when blood samples were collected; the challenges occurred on the 60th day. Results showed that ELISA was efficient in evaluating, following, and comparing mouse immune response during hyperimmunization. Serum titers produced with natural venom were similar to those with irradiated venom. Immunogenic capacity was maintained after 60Co irradiation. Serum produced from Crotalus durissus terrificus irradiated venom showed higher potency and neutralization capacity than that from natural venom. Antibodies from natural and irradiated venom by in vitro challenges were also efficient in neutralizing Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. All antibodies were capable of neutralizing five LD50 from these venoms. Clinical alterations were minimum during hyperimmunization with irradiated venom and evident with natural venom. / Orientador: Domingos Alves Meira / Coorientador: Benedito Barraviera / Mestre

Resumo: As serpentes do gênero Crotalus durissus terrificus possuem em seu veneno diversas substâncias, entre elas uma serinoprotease com atividade trombina símile denominada giroxina, a qual é capaz de coagular o fibrinogênio plasmástico, promovendo a formação de fibrina. O objetivo do estudo foi a purificação e caracterização estrutural da enzima giroxina de Crotalus durissus terrificus. Para tanto, foram utilizadas métodos cromatográficos de gel filtração em Sephadex G75 e afinidade em Benzamidina-Sepharose 6B para isolamento e purificação; eletroforéticos de SDSPAGE 12% reduzido e de seqüenciamento do N-terminal da enzima purificada para identificação e avaliação do grau de pureza; clonagem e expressão do cDNA da glândula venenífera por RT-PCR e testes de cristalização. A modelagem teórica molecular foi realizada a partir de ferramentas de bioinformática baseadas em análises comparativas de outras serinoproteases depositadas no NCBI (National Center for Biotechnology Information). O seqüenciamento N-terminal da giroxina purificada, produziu uma proteína de cadeia única com massa molecular aproximada de 30 KDa e sua seqüência completa de cDNA apresentou 714 pb os quais codificaram uma proteína completa contendo 238 aminoácidos. Foram obtidos cristais a partir das soluções nos 2 e 5 do Kit Crystal Screen® 2 e 1 respectivamente, verificando-se sua constituição protéica. Para os alinhamentos múltiplos da sequência molde giroxina símile B2.1 com outras seis serinoproteases derivadas de veneno de serpentes (SVSPs) indicou-se a preservação de resíduos de cisteína e de seus principais elementos de estruturais (α-hélices, β-barris e loops).Evidenciou-se a localização da tríade catalítica nos aminoácidos His57, Asp102, Ser198 e os sítios de atividade especifica S1 e S2 nos aminoácidos Thr193 e Gli215 respectivamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The venom of snakes Crotalus durissus terrificus genus have in their various substances, including a serinoproteases with thrombin-like activity called gyroxin, which clot the plasmatic fibrinogen and promote the fibrin formation. The objective of this study was purificate and characterize structurally the gyroxin enzyme from Crotalus durissus terrificus. For this, we used chromatographic gel filtration with Sephadex G75 and affinity benzamidine-Sepharose 6B for isolation and purification, SDS-PAGE 12% in reduce conditions for assessment purity, N-terminal sequencing of purified enzyme for identification and assessment purity; the cloning and expression of cDNA from venom gland by RT-PCR and crystallization tests. The theoretical molecular modeling was performed with bioinformatics tools based on comparative analysis of other serinoproteases deposited in the NCBI (National Center for Biotechnology Information). The N-terminal sequencing purified gyroxin protein produced a single chain with a molecular mass of approximately 30 kDa and its full-length cDNA had 714 bp which encoded a complete protein containing 238 amino acids. Crystals were obtained from the solutions 2 and 5 of the Crystal Screen Kit ® 2 and 1 respectively and was verificated a protein constitution. For multiple sequence alignments such gyroxin-like B2.1 with six other serinoproteases derived from snake venom (SVSPs) indicated the preservation of cysteine residues and its main structural elements (α helices, β-barrel and loops). Identificated the amino acids positions in the catalytic triad His57, Asp102, Ser198 and sites of specific activity in S1 and S2 amino acids Thr193 and Gli215 respectively. The recognition area of fibrinogen cleavage in SVSPs to template sequence gyroxin B2.1 was located in residues Arg60, Arg72, Gln75, Arg81, Arg82, Lis85, Glu86, Lis87... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: Marcos R. M. Fontes / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Andreimar Martins Soares / Mestre

Orientador: Márcia Gallacci / Banca: Marcos Roberto de Mattos / Banca: Vidal Haddad Junior / Resumo: Os acidentes envolvendo as serpentes do gênero Bothrops se destacam no Brasil e em outros países da América Latina, representando 90% das notificações. O envenenamento botrópico é caracterizado por intensa mionecrose local que não é eficientemente neutralizada pelo único tratamento disponível, isto é, a soroterapia. Como conseqüência, em casos graves, este acidente pode levar a amputação de membros, desabilitando a vítima. Os principais responsáveis pelo desenvolvimento da mionecrose são proteínas com estruturas homólogas às enzimas fosfolipases A2 (PLA2s). Entre essas se destacam as variantes cataliticamente inativas que apresentam como característica um resíduo de lisina na posição 49 (Lys49-PLA2s). Tradicionalmente, as Lys49-PLA2s são consideradas miotoxinas não-neurotóxicas, uma vez que não induzem paralisia in vivo. No entanto, em preparações isoladas, tal efeito é observado. Recentemente, sugeriu-se que a paralisia muscular in vitro, da mesma forma que a lesão muscular, resultaria da atividade desestabilizadora de membrana da fibra muscular induzida por estas toxinas. O presente estudo teve como objetivo investigar a relação entre os efeitos miotóxico e paralisante das Lys49-PLA2s e contribuir para o esclarecimento do mecanismo de ação e da relação estrutura/atividade dessas toxinas. Sendo assim, realizaram-se estudos miográficos e morfológicos em preparações neuromusculares de camundongos utilizando a PrTX-I (Lys49-PLA2 isolada do veneno de Bothrops pirajai) e potenciais inibidores vegetais (ácido rosmarínico, ácido caféico e ácido aristolóquico). Os resultados obtidos mostraram as diferentes capacidades dos compostos vegetais em neutralizar os efeitos miotóxico e paralisante da PrTX-I. Assim, o ácido rosmarínico neutralizou ambos os efeitos eficientemente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Accidents caused by Bothrops snake genus stand out in Brazil and other Latin American countries, representing 90% of notifications. Bothropic envenoming is characterized by intense local myonecrosis, not effectively neutralized by serum therapy, the only available treatment. As a result, in severe cases, these accidents can lead to amputation of limbs, disabling the victim. The main responsibles for myonecrosis development are proteins with homologous structures from enzymes phospholipase A2 (PLA2s). Among these stand out catalytically inactive variants that have a characteristic lysine residue at position 49 (Lys49-PLA2s). Traditionally, Lys49-PLA2s myotoxins are considered non-neurotoxic, since they do not induce paralysis in vivo. However, this effect is observed in isolated preparations. It was recently suggested that muscle paralysis in vitro, as well as muscle injury, would result from the destabilizing activity of the muscle fiber membrane induced by these toxins. This study aimed to investigate the relationship between paralyzing and myotoxic effects of Lys49-PLA2s and contribute to the elucidation of the mechanism of action and structure/activity relationship of these toxins. Therefore, myographical and morphological studies were performed in neuromuscular preparations of mice using PrTX-I (Lys49-PLA2 isolated from Bothrops pirajai venom) and potential inhibitors from plants (rosmarinic acid, caffeic acid and aristolochic acid) as experimental tools. The results showed the different skills of plant compounds to neutralize myotoxic and paralyzing effects of PrTX-I. Thus, the rosmarinic acid efficiently neutralized both effects, whereas caffeic acid only partially inhibited the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T15:07:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_Luizde_M.pdf: 4179090 bytes, checksum: 98eeb71706df15ef7df0c8cbc6aa8696 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A capacidade de venenos ofídicos induzirem efeitos locais é bem conhecida. Neste trabalho, investigamos o edema e a hemorragia, induzidos pelo veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) "in natura" e/ou aquecido, em ratos. O edema foi induzido por injeção subplantar (12,5-100 µg/pata) e quantificado por hidropletismógrafo. A hemorragia foi induzida por injeção intramuscular (0,25-64 µg), no músculo gastrocnêmio esquerdo, e expressada como a quantidade de hemoglobina(hb) acumulada no músculo, determinada pelo método de cianometemoglobina. Com todas as doses do veneno testadas, o edema apresentou resposta máxima 15 minutos após a administração. A resposta máxima foi observada com o VBL na dose de 75 µg/pata (salina controle = 0,09 ± 0,001 ml e veneno = 1,09 ± 0,05 ml, n=7), e desapareceu dentro de 24 horas. O efeito máximo hemorrágico foi observado com 32 /µg do VBL (salina controle =1,23 ± 0,06 mghb/g de tecido e veneno = 6,77 ± 0,69 mghb/g de tecido, n=6), e desapareceu dentro de 72 horas. O VBL aquecido (97°C, 30 segundos) reduziu o edema em 70% e aboliu completamente a atividade hemorrágica. A administração concomitante do VBL (75 /µg) aquecido, com o iloprost (0,1 µg), potencializou o edema em duas vezes. Pré-tratando-se os ratos com mepiramina (6mg/kg), ciproheptadina (6mg/kg), mepiramina e ciproheptadina (6 mg/kg), 15 minutos antes; dexametasona (1 mg/kg), 2 horas antes; BW A4C (10 mg/kg) e Hoe 140 (0,6 mg/kg), 30 minutos antes; inibiram o edema induzido pelo VBL aquecido (75g), associado ao iloprost (0,1 µg), em 28%, 55%, 77%, 63%, 35% e 30%; respectivamente. A co-administração do VBL aquecido (75 µg), com o captopril (300 µg), potencializou o edema em 44%, mesmo na ausência do iloprost. A indometacina (10mg/kg) não foi efetiva. A incubação do soro antiBothrops lanceo/atus (antiVBL) com o VBL "in natura", neutralizou completamente o efeito hemorrágico mas aboliu somente parcialmente (45%) o edema. A administração intravenosa do antiVBl imediatamente após a injeção subplantar ou intramuscular do VBl, neutralizou 30% do edema e 38% da hemorragia. Quando o antiVBl foi incubado com o VBl aquecido associado ao iloprost, e administrado na pata dos ratos, a neutralização foi discreta (em torno de 30%), e foi observada somente com a menor proporção (0,125 ml antiVBLlmg VBl). Quando administrado por via intravenosa imediatamente após a injeção do veneno aquecido, foi completamente ineficaz. Estes resultados, indicam que o VBl induz edema na pata e hemorragia no músculo de ratos. O VBl aquecido induz edema livre de hemorragia. O antiVBL neutralizou completamente o efeito hemorrágico e inibiu somente parcialmente o edema, quando foi pré-incubado com o VBL. O antisoro foi pouco efetivo em neutralizar ambas as atividades quando foi administrado por via intravenosa. Estas observações indicam que histamina, serotonina, bradicinina e produtos da lipoxigenase estão envolvidos no edema causado pelo veneno de Bothrops lanceolatus / Abstract: The ability of snake venoms to induce local effects is well known. In this thesis, the oedema and hemorrhage induced in rats by heated and non-heated Bothrops lanceolatus venom (BL V) was investigated. Oedema was induced by the subplantar injection of venom (12.5-100 µg/paw) and was quantified by hydroplethysmography at various times thereafter. Hemorrhage was induced by injecting venom (0.25 - 64 µg) into the left gastrocnemius muscle and was expressed as accumulation of extravascular hemoglobin(hb) as determined by the cyanomethemoglobin method. With ali of the venom doses tested, the oedematogenic response peaked within 15 mino The maximal response was observed at a venom dose of 75 µg/paw (saline control = 0.09 ± 0.001 ml and venom = 1.09 ± 0.05 mi, n=7) and disappeared within 24h. The maximum hemorrhagic effect was observed with 32 µg of BLV (saline control = 1.23 ± 0.06 mghb/g of tissal and venom = 6.77 ± 0.69 mghb/g of tissal, n=6) and disappeared within 72h. Heating BLV (97°C, 30 sec) reduced the oedema by 70% and completely abolished the hemorrhagic activity. The combined administration of heated BL V (75 µg) With iloprost (0.1 µg) potentiated the oedema two-fold. Pre-treating the rats with mepyramine (6 mg/kg), cyproheptadine (6 mg/kg), mepyramine and cyproheptadine (6 mg/kg each, 15 min before), dexamethasone (1 mg/kg 2 h before), BW A4C (10 mg/kg) and Hoe 140 (0.6 mg/kg each 30 min before), inhibited the oedema induced by heated BL V (75 µg) plus iloprost (0.1 µg) by 28%, 55%, 77%, 63%, 35% and 30%; respectively. The co-administration of heated BL V (75 µg) with captopril (300 µg) potentiated the oedema by 44%, even in the absence of iloprost. Indomethacin (10 mg/kg) had no effect on the oedematogenic response. Pre-incubating native (non-heated) BL V with antiBL Vantiserum completely neutralized the hemorrhagic effect but only partially. abolished (45%) the oedema. The intravenous administration of antiBL V antiserum immediately after the subplantarar intramuscular injection of venom neutralized 30% of the oedema and 38% of the hemorrhage. When antiBLV antiserum was incubated with heated BLV plus iloprost and injected into rat paws, the neutralization was discrete (abaut 30%) and was observed only with the lowest proportion (0.125 ml antiBLV/mg BLV) tested. When administered intravenously immediately after the injection of heated venom, there was no neutralization whatsoever. These results indicate that non-heated BL V induces oedema in the paw and hemorrhage in the muscle of rats while heated BLV induces oedema without hemorrhage. AntiBLV antiserum completely neutralized the hemorrhagic effect and only partially inhibited the oedema when it was preincubated with BtV. The antiserum was less effective in neutralizing both activities when administered intravenously. These observations indicate that bradykinin, histamine, serotonin and lipoxygenase products are involved in the oedema caused by Bothrops lanceolatus venom / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências

Orientadores: Lea Rodrigues-Simioni, Maria Alice Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T10:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_YokoOshima_M.pdf: 11411260 bytes, checksum: 5403f0689ceac02dc46c3ee98511f0c5 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar as atividades neurotóxica e miotóxica das peçonhas de Crotalus duhssus tenificus (Cdt,10 ng/ml), Bothrops jararacussu (Bjssu, 50 ng/ml) e de suas principais toxinas, crotoxina (CrTX, 10 ng/ml) e bothropstoxina (BthTX, 20 ng/mi), respectivamente. Utilizamos antivenenos (AV) comerciais e específicos para avaliar a capacidade de neutralização dessas atividades, em preparações biológicas (camundongo), nervo frênico-diafragma (NFD) e extensor digitorum longus (EDL). O AV eqüino comercial empregado foi produzido pelo Instituto Vital Brazii. O AV específico foi produzido por inoculação sucessiva, em coelhos, com veneno totat de Cdt, Bjssu e da toxina CrTX. O acompanhamento da produção de anticorpos foi realizado por imunodifusão e, posteriormente, confirmado pela técnica de ELISA. A atividade neurotóxica foi avaliada por intermédio de técnica miográfica e a miotóxica, através de determinação de creatinoquinase (CK), in vitro, e de análise histológica. Os dois venenos e suas respectivas toxinas produziram bloqueio neuromuscular dose-dependente e mionecrose, em diferentes graus. O estudo do bloqueio neuromuscular evidenciou diferenças entre as preparações utilizadas (NFD e EDL), quanto à sensibilidade aos venenos e toxinas, provavelmente pela constituição predominante de fibras de contração rápida (EDL) e lenta (NFD). A neutralização do bloqueio neuromuscular mostrou ser dose-dependente na preparação NFD e, a partir de determinada dose de AV, foi registrada uma facilitação importante para os AV comerciais. A neutralização cruzada também foi investigada para Bjssu e BthTX, em ambas as preparações, e novamente a resposta foi diferente entre elas. Os elevados níveis obtidos da enzima CK, liberada após 120 minutos de exposição aos AV, sozinhos, o que pretendia ser um simples controle, revefou que, possivelmente a quantidade de proteínas interfira no mecanismo liberador de CK Isto sugere que a determinação enzimática, em associação à análise histológica, pode constituir um parâmetro quantitativo de mionecrose, mas deve ser interpretada com cuidado na avaliação de lesão celular se estudada individualmente. A análise histológica revelou que a capacidade do veneno botrópico de destruir a musculatura esquelética é maior do que a do crotálico, nas condições experimentais empregadas. Os AV específicos foram eficientes na neutralização da miotoxicidade. Pode-se concluir que, o estudo da neutralização com AV produzido de frações purificadas, associada aos parâmetros miográficos e miotóxicos, pode constituir um modelo útil na dissociação entre as atividades neurotóxica e miotóxica das toxinas / Abstract: This thesis evaluates the neurotoxic and myotoxic activities of Crotalus durissus terrificus (Cdt, 10 \xg/m\) and Bothrops jararacussu (Bjssu, 50 ng/ml) venoms and their major toxins, crotoxin (CrTX, 10 ng/ml) and bothropstoxin-l (BthTX-l, 20 ng/ml), respectively, and the ability of commercial and specific antivenoms to neutralize these activities. Neurotoxic activity was studied in vitro using the phrenic nerve-diaphragm (PND) and extensor digitorum longus (EDL) preparations. Myotoxic activity was determined by measuring the release of CK in vitro from the EDL preparation as well as by histological analysis. The commercial equine antivenom employed was produced by the Instituto Vital Brazil. The specific antiCdt, antiBjssu and antiCrTX antivenoms were raised in rabbits by successive inoculations over a two month period. The antibody production was determined by both immunodiffusion and by an enzyme-linked immunosorbent assay (EUSA). Both of the venoms and their respective toxins produced a dose-dependent neuromuscular blockade as well as differing degrees of necrosis. The variation in sensitivity between the two preparations may reflect the presence of predominantly fast fibers in the EDL and slow fibers in the PND. Neutralization of the neuromuscular blockade was dose-dependent in the PND and, at elevated concentrations, the antisera produced facilitation of the preparation. Bjssu venom was more potent than Cdt venom in producing skeletal muscle damage under the conditions employed here. The specific antivenoms had a greater neutralization capacity than the commercial antivenoms. Concomitant studies on the neutralization of both neurotoxic and myotoxic activities may provide a useful model for dissociating these two activities / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas