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Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 00718.pdf: 1498139 bytes, checksum: f702dccfa320f843e27c284e713aefbb (MD5) / Tese (Doutoramento) / IEA/T / Instituto de Quimica, Universidade de Sao Paulo - IQ/USP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:09/10305-8

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 00718.pdf: 1498139 bytes, checksum: f702dccfa320f843e27c284e713aefbb (MD5) / Tese (Doutoramento) / IEA/T / Instituto de Quimica, Universidade de Sao Paulo - IQ/USP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As toxinas de veneno de serpentes têm como principal função alterar a homeostase das presas para fins de alimentação ou defesa. O estudo aprofundado da composição do veneno de serpentes é importante para a produção de soros antiofídicos mais eficientes, para a descoberta de novos fármacos e na compreensão de processos biológicos, ecológicos e evolutivos. As pesquisas com toxinas têm mostrado uma versatilidade natural, refinada pela evolução, na diversificação de funções em famílias de proteínas recrutadas de suas funções endógenas, por meio de sucessivas duplicações e acumulo de mutações levando a uma evolução acelerada. A miríade de toxinas disponíveis e sua diversidade de funções ainda não foram completamente descritas. A combinação das análises em larga escala do transcriptoma de novo da glândula de veneno e do proteoma do veneno permite elaborar um perfil mais completo do toxinoma do veneno, permitindo inclusive um aumento na sensibilidade da detecção de toxinas pouco representadas e inesperadas nos venenos. O objetivo geral deste estudo foi analisar o toxinoma do veneno de uma das mais perigosas espécies australianas, a Pseudonaja textilis (Elapidae). Foi possível identificar no veneno as toxinas: fatores de coagulação de veneno do complexo protrombinase, subunidades de fosfolipases A2 (PLA2) da neurotoxina textilotoxin e PLA2 de atividade procoagulante, neurotoxinas tipo three-finger toxin (3FTx), inibidores de protease do tipo-kunitz textilinin, e pela primeira vez, uma nova variante de 3FTx, lectinas tipo C, CRiSP além de indícios de toxinas de lagarto Heloderma e outras proteínas candidatas a toxinas como calreticulin e dipeptidase 2. Metaloproteinases, pouco estudadas em Elapidae, foram clonadas e detectadas no veneno por ensaios de fracionamento e imunoreatividade. A análise do transcriptoma identificou novas isoformas e variantes de toxinas, principalmente das 3FTx e dos inibidores de serinoproteases, assim como transcritos de toxinas que não foram detectadas no veneno e que merecem mais investigações. O quadro de sintomas com acidentes em humanos é bem explicado pelas toxinas identificadas, porém, em seu habitat natural, as toxinas pouco conhecidas e até então não descritas devem ter funções importantes e específicas na predação. Identificar esta diversidade de variantes é importante para entender o modo de ação das toxinas. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:09/10305-8

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In last years, considerable efforts have been made to identify neuroactive and neuroprotective peptides derived from the venom of different natural species. In this work, were studied the activity of Dinoponera quadriceps native (DqV) and denatured (DqDV) venom on chemically induced seizures models in vivo and on in vitro cortical astrocytes viability. Male Swiss mice (28- 33g) were pretreated with DqV (0.1 or 0.5 mg/kg, e.v., n = 6-8), DqDV (0.5 or 2.0 mg/kg, i.p., n = 6-8) or DqDV (0.1 or 0.5 mg/kg, e.v., n = 6-8). 30 minutes after the intraperitoneal pretreatment or ten minutes after intravenous pretreatment with the venom was induced seizures in all animals by the administration of pentylenetetrazole (80 mg/kg) pilocarpine (400 mg/kg) or strychnine (3.0 mg/kg). In behavioral analysis, we recorded the time to the first seizure and to death and the percentage of survival. To determine the parameters of oxidative stress was dissected three brain areas (prefrontal cortex, hippocampus and striatum) of animals used in behavioral analysis, in order to determine the degree of lipid peroxidation, by measuring the levels of malondialdehyde (MDA), and the content of nitrite. In in vitro assay, cell viability of cortical astrocytes was determined after treatment with different concentrations of DqV, PTZ and DqV + PTZ. The data were analyzed by ANOVA followed by a Student Newman-Keuls (for in vivo tests) or Bonferroni (for in vitro experiments) as post hoc tests. It was observed that the DqV had effect only on the PTZ model, both in behavioral analysis as for the determination of the oxidative parameters. Pretreatment with DqV significantly reduced the time until the occurrence of first seizure (0.1 mg/kg: 77.83 Â 5.27 compared to the 101.0 Â 3.31 seconds in the control group; 0.5 mg/kg: 74.43 Â 3.94 compared to the 101.0 Â 3.31 seconds in the control group), while DqDV caused an increase in the percentage of survival when pretreated by i.p. (0.5 mg/kg: 25% of survival compared with 0% in the control group, 2.0 mg/kg: 62.5% of survival compared with 0% in control group) and e.v (0.5 mg/kg: 28.57% of survival compared with 0% in control group). routes. In relation to the oxidative stress parameters, both pretreatments with DqV and with DqDV caused increases of MDA levels in all three brain areas analyzed. The nitrite content also increased after pretreatment with DqV in the three areas of the brain and after pretreatment with DqDV via e.v., only in the hippocampus. About cell viability assays, were observed that DqV was not able to change this parameter. The PTZ reduced the cell viability of astrocytes in a dose-dependent way, with an IC 50 (cytotoxicity index to 50% of the cell population under study) corresponding to 33.12 mM. The combined treatment of DqV (100 Âg/mL) and PTZ (IC 50) also caused a reduction in cell viability. The results suggest that the DqV, probably, has both neurotoxic and neuroprotective components, and that the astrocytes should be the cells involved in the venomâs neurotoxicity. / Nos Ãltimos anos, esforÃos considerÃveis tÃm sido feitos no sentido de identificar peptÃdeos naturais neuroativos e neuroprotetores derivados do veneno de diferentes espÃcies animais. Nesse trabalho foi estudada a atividade do veneno de Dinoponera quadriceps nativo (vDq) e desnaturado (vdDq) em modelos animais de convulsÃo quimicamente induzidos in vivo e sobre a viabilidade de astrÃcitos corticais in vitro. Camundongos Swiss machos (28-33g) foram prÃ-tratados com o vDq (0,1 ou 0,5 mg/kg, e.v, n= 6-8), vdDq (0,5 ou 2,0 mg/kg, i.p., n= 6-8) ou com vdDq (0,1 ou 0,5 mg/kg, e.v., n= 6-8). Meia hora apÃs o prÃ-tratamento intraperitoneal ou dez minutos apÃs o prÃ-tratamento endovenoso com o veneno foi induzida a convulsÃo em todos os animais atravÃs da administraÃÃo de pentilenotetrazol (80 mg/kg), pilocarpina (400 mg/kg,) ou estricnina (3,0 mg/kg). Na anÃlise comportamental, foram registrados os tempos para ocorrÃncia da primeira convulsÃo e morte e o percentual de sobrevida. Para determinaÃÃo dos parÃmetros de stress oxidativo foram utilizadas trÃs Ãreas cerebrais (cÃrtex prÃ-frontal, hipocampo e corpo estriado) de animais utilizados na anÃlise comportamental, a fim de se determinar o grau de peroxidaÃÃo lipÃdica, pela mensuraÃÃo dos nÃveis de malondialdeÃdo (MDA), e o conteÃdo de nitrito. No ensaio in vitro, foi determinada a viabilidade celular de astrÃcitos corticais apÃs o tratamento com diferentes concentraÃÃes de vDq, PTZ e vDq + PTZ. Os dados foram analisados por ANOVA e Student-Newman-Keuls como pÃs-teste, para os ensaios in vivo, e ANOVA seguido pelo pÃs-teste de Bonferroni, para as experimentaÃÃes in vitro. Foi observado que o vDq apresentou efeito apenas no modelo de PTZ, tanto na anÃlise comportamental quanto na determinaÃÃo dos parÃmetros oxidativos. O prÃ-tratamento com vDq reduziu significativamente o tempo para ocorrÃncia da primeira convulsÃo (0,1 mg/kg: 77,83 Â 5,27 comparado com 101,0 Â 3,31 segundos no grupo controle; 0,5 mg/kg: 74,43 Â 3,94 comparado com 101,0 Â 3,31 segundos no grupo controle), enquanto que o vdDq causou aumento do percentual de sobrevida quando prÃ-tratado por via i.p. (0,5 mg/kg: 25% de sobrevida comparado com 0% no grupo controle; 2,0 mg/kg: 62,5% de sobrevida comparado com 0% no grupo controle) e e.v (0,5 mg/kg: 28,57% de sobrevida comparado com 0% no grupo controle). Em relaÃÃo aos parÃmetros de estresse oxidativo, tanto o prÃ-tratamento com o vDq quanto com o vdDq causaram aumentos dos nÃveis de MDA nas trÃs Ãreas cerebrais analisadas. O conteÃdo de nitrito tambÃm sofreu elevaÃÃo apÃs prÃ-tratamento com vDq, nas trÃs Ãreas cerebrais, e apÃs o prÃ-tratamento com vdDq, via e.v., apenas no hipocampo. Quanto aos ensaios de viabilidade celular, foi observado que o vDq, isoladamente, nÃo foi capaz de alterar esse parÃmetro. O PTZ causou reduÃÃo da viabilidade de astrÃcitos de modo dose-dependente e com uma IC 50 (Ãndice de citotoxicidade para 50% da populaÃÃo celular em estudo) correspondente a 33,12 mM. O tratamento combinado entre vDq (100 Âg/mL) e PTZ (IC 50) tambÃm causou reduÃÃo da viabilidade das cÃlulas. Os resultados sugerem que o vDq possivelmente apresenta ambos componentes neurotÃxicos e neuroprotetores, e os astrÃcitos devem ser uma das cÃlulas envolvidas na neurotoxicidade do veneno.

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