Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09994.pdf: 3905779 bytes, checksum: 7cdc8d8ae9585729a6a818ed202c59c8 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 10386.pdf: 2709613 bytes, checksum: e5193eaf23e32490bcf76fc5ad0d8789 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares, IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:05:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:32:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 03268.pdf: 1411071 bytes, checksum: 329c08d164e3d0d4d2a4ce77f1e2aa13 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IEA/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:32:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 03181.pdf: 1949463 bytes, checksum: c34e1f3d7f43777cbd9147685ab2ea6e (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Animal toxins can be a source of molecular models for the design of new drugs. This study investigated the antimicrobial and trypanocidal potential from Dinoponera quadriceps ant venom (DqV) aiming to discover therapeutic value substances. We conducted the microdilution test, where it was determined the minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum Lethal Concentration (MLC) over Staphylococcus aureus ATCC 6538P , Escherichia coli ATCC 10536 , Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 , Salmonella subsp cholearaesuis choleraesuis serotype choleraesuis ATCC 10708 and Candida albicans ATCC 10231 strains and two microbial strains of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), S. aureus ATCC 33591 and S. aureus CCBH 5330. MIC and MLC of DqV were respectively 6.25 Âg/mL and 12.5 Âg/mL for S. aureus ATCC 6538P, 3.12 Âg/mL and 3.12 Âg/mL for E. coli, 12.5 Âg/mL and 12.5 Âg/mL for P. aeruginosa, 12.5 Âg/mL and 25 Âg/mL for S. choleraesuis, 25 Âg/mL and 50 Âg/mL for C. albicans, 12.5 Âg/mL and 50 Âg/mL for S. aureus CCBH 5330 and 100 Âg/mL and 100 Âg/mL for S. aureus ATCC 33591. Mechanism of action experiments were performed for the strain of S. aureus ATCC 6538P methicillin-susceptible (MSSA), that changes in the permeability of the bacterial membrane of S. aureus treated with bacteriostatic and bactericidal concentrations of DqV was observed by the crystal violet assay and release of genetic material assay. A lowest MIC was observed when alkaline pH broth was used (7,5-9,0). Complete bacterial growth inhibition was observed after 4 h of incubation with the MLC of DqV. Bacterial morphology was analyzed by atomic force microscopy after exposure of bacteria to the CIM and CIM /2 of DqV for 4 hours, showing membrane damage. In antiparasitic assays, we determined the cytotoxic effects of the venom on epimastigote and trypomastigote forms of the Y strain of Trypanosoma cruzi. In epimastigotes, cytotoxicity was evaluated at 24 and 48 h, finding IC50 of 28.32 Âg/mL and 20.67 Âg/mL, respectively. The mechanism of cell death was assessed by flow cytometry and revealed the presence of necrotic and apoptotic involvement in the cytotoxic effect of DqV over epimastigote form, in addition, the appearance of double labeled cells with PI and Annexin V-FITC, indicating the occurrence of late apoptosis. Cytotoxicity was evaluated over trypomastigote finding an IC50 of 1.978 Âg/mL and over RAW 264.7 cells finding an IC50 of 32.44 Âg/mL. The venom showed antibacterial activity against S. aureus MSSA and MRSA, P. aeruginosa, S. choleraesuis, E. coli and C. albicans, suggesting membrane damage in S. aureus ATCC 6538P. Additionally, showed cytotoxic potential on epimastigote and tripomastigote forms of Y strain of T. cruzi. / As toxinas animais podem ser fonte de modelos moleculares para o desenho de novos fÃrmacos. Este trabalho objetivou estudar o potencial antimicrobiano e tripanocida do veneno da formiga Dinoponera quadriceps (VDq) visando à descoberta de substÃncia de valor terapÃutico. Foi realizado o ensaio de microdiluiÃÃo em caldo, onde foi determinado a ConcentraÃÃo InibitÃria MÃnima (CIM) e ConcentraÃÃo Letal MÃnima (CLM) das cepas Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella cholearaesuis subsp. choleraesuis sorotipo choleraesuis ATCC 10708 e Candida albicans ATCC 10231 e duas cepas Staphylococcus aureus Meticilina Resistente (MRSA), S. aureus ATCC 33591 e S. aureus CCBH 5330. CIM e CLM de VDq foram respectivamente 6,25 Âg/mL e 12,5 Âg/mL para S. aureus ATCC 6538P, 3,12 Âg/mL e 3,12 Âg/mL para E. coli, 12,5 Âg/mL e 12,5 Âg/mL para P. aeruginosa, 12,5 Âg/mL e 25 Âg/mL para S. choleraesuis, 25 Âg/mL e 50 Âg/mL para C. albicans, 12,5 Âg/mL e 50 Âg/mL para S. aureus CCBH 5330 e 100 Âg/mL e 100 Âg/mL para S. aureus ATCC 33591. Em seguida foram realizados experimentos de mecanismo de aÃÃo para a cepa de S. aureus ATCC 6538P SensÃvel à Meticilina (MSSA), onde se verificou alteraÃÃo na permeabilidade da membrana bacteriana de S. aureus tratado com concentraÃÃes bacteriostÃticas e bactericidas de VDq atravÃs do ensaio do cristal violeta e do ensaio de liberaÃÃo de material genÃtico. Uma menor CIM foi encontrada quando pHs alcalinos foram utilizados no teste (7,5-9,0). Uma completa inibiÃÃo de crescimento foi observada apÃs 4 h de incubaÃÃo com CLM de VDq. A morfologia bacteriana foi avaliada por microscopia de forÃa atÃmica apÃs exposiÃÃo da bactÃria à CIM e CIM/2 de VDq durante 4 h, mostrando o dano de membrana. Nos ensaios antiparasitÃrios, foram observados os efeitos citotÃxicos do veneno sobre formas epimastigotas e tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi. Nas formas epimastigotas, a citotoxicidade foi avaliada em 24 e 48 h, com IC50 de 28,32 Âg/mL e IC50= 20,67 Âg/mL, respectivamente. O mecanismo de morte celular foi avaliado por citometria de fluxo e revelou envolvimento necrÃtico e apoptÃtico no efeito do VDq sobre formas epimastigotas, alÃm do aparecimento de cÃlulas marcadas duplamente com PI e anexina V-FITC, indicando a ocorrÃncia de apoptose tardia. A citotoxicidade foi avaliada sobre formas tripomastigotas encontrando uma IC50 de 1,978 Âg/mL e sobre cÃlulas RAW 264.7 uma IC50 de 32,44 Âg/mL. O veneno apresentou atividade antimicrobiana sobre S. aureus MSSA e MRSA, P. aeruginosa, S. choleraesuis, E. coli e C. albicans, sugerindo lise de membrana em S. aureus ATCC 6538P. Adicionalmente, apresentou potencial citotÃxico sobre as formas epimastigota e tripomastigorta de cepa Y de T. cruzi.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os efeitos locais provocados por venenos botrÃpicos sÃo caracterizados por edema, hemorragia e dor local. No entanto, os mecanismos fisiopatolÃgicos relacionados a esses venenos podem variar de acordo com a espÃcie. Esta caracterÃstica espÃcie-especÃfica pode prejudicar a eficÃcia da soroterapia. Desta forma, considerando a diversidade da resposta fisiopatolÃgica dos venenos, investigamos os mecanismos e mediadores envolvidos na resposta inflamatÃria local induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu (VBjsu). Camundongos Swiss fÃmeas foram submetidos à injeÃÃo intraplantar de soluÃÃo salina ou VBjsu (0,125-8 Âg/pata). Para o estudo dos mecanismos e mediadores envolvidos, diferentes sub-grupos de animais foram submetidas ao prÃ-tratamento com loratadina (um antagonista do receptor H1), composto 48/80 (para induzir a depleÃÃo dos mastÃcitos), capsaicina (para promover a dessensibilizaÃÃo das fibras C), infliximabe (um anticorpo anti-TNF-&#945;), indometacina (um inibidor nÃo-especÃfico da COX), celecoxibe (um inibidor seletivo da COX-2) ou fucoidina (um modulador de P- e L-selectinas) administrados antes do VBjsu. O edema da pata foi medido por pletismografia. AlÃm disso, os tecidos da pata foram recolhidos para determinaÃÃo da atividade da mieloperoxidase (MPO), dosagem dos nÃveis de TNF-&#945;, IL-1 e da imunoexpressÃo da COX-2. O efeito quimiotÃtico direto do VBjsu tambÃm foi estudado por meio do ensaio da cÃmara de Boyden, e o estado de ativaÃÃo dos neutrÃfilos humanos foi avaliado atravÃs da dinÃmica intracelular de cÃlcio em neutrÃfilos realizado in vitro com auxilio da microscopia confocal. O VBjsu causou uma resposta edematogÃnica concentraÃÃo e tempo dependentes com aumento da produÃÃo local de TNF-&#945;, IL-1&#946; e da imunoexpressÃo da COX-2 nos tecidos quando comparado ao grupo salina (P<0,05). Ambos, edema e migraÃÃo de neutrÃfilos foram impedidos pelos inibidores da COX (indometacina ou celecoxibe), ou pelo modulador de P - e L-selectinas (fucoidina) vs. VBjsu (P<0,05). O exame histopatolÃgico revelou que o VBjsu induz uma precoce migraÃÃo de neutrÃfilos para o local da lesÃo vs. o grupo salina (P<0,05). AlÃm disso, o VBjsu induz a quimiotaxia e ativa neutrÃfilos in vitro aumentando diretamente a dinÃmica de cÃlcio intracelular quando comparado ao RPMI (P<0,05). Portanto, o VBjsu induz uma resposta edematogÃnica precoce dependente da produÃÃo de prostanoides e da migraÃÃo de neutrÃfilos. / Local tissue reactions provoked by Bothrops venoms are characterized by edema, hemorrhage, pain, and inflammation; however, the mechanisms of tissue damage vary depending upon the species of snake. This mechanistic variability reduces the efficacy of antivenom treatment. Considering the diversity of intraspecific pathophysiological responses, we investigated the mechanisms and mediators involved in the local inflammatory response induced by the Bothrops jararacussu venom (VBjsu). Female Swiss mice were injected with either saline or VBjsu (0.125-8 Âg/paw). In a subset of VBjsu-treated mice, loratadine (an H1 receptor antagonist), compound 48/80 (for mast cell depletion), capsaicin (for C-fiber desensitization), infliximab (an anti-TNF-&#945; antibody), indomethacin (a non-specific COX inhibitor), celecoxib (a selective COX-2 inhibitor) or fucoidan (a P- and L-selectins modulator) were administered before VBjsu treatment. Paw edema was measured by plethysmography. In addition, paw tissues were collected for the measurement of myeloperoxidase (MPO) activity, TNF-&#945; and IL-1 levels, and COX-2 immunoexpression. The direct chemotactic effect of VBjsu was also studied using a Boyden chamber assay, and the in vitro calcium dynamic in neutrophils was investigated using confocal microscopy. VBjsu caused concentration- and time-dependent edematogenic responses and increased the local production of TNF-&#945; and IL-1&#946; as well as COX-2 expression vs. saline group (P<0.05). Both edema and neutrophil migration were prevented by pretreatment with cyclooxygenase inhibitors (indomethacin or celecoxib) or by the P- and L-selectins modulator, fucoidan vs. VBjsu (P<0.05). Furthermore, VBjsu induced a direct in vitro neutrophil chemotaxis by increasing intracellular calcium vs. RPMI (P<0.05). Therefore, VBjsu induces an early onset edema dependent upon prostanoid production and neutrophil migration.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O veneno de C. d. terrificus tem sido descrito como sendo de pouca complexidade, tendo 4 frações caracterizadas, convulxina, giroxina. crotoxina e crotamina. O presente trabalho visou o isolamento e caracterização da Delta toxina cuja existência havia sido aventada em trabalhos anteriores. Após a realização de uma varredura de tampões em uma coluna de exclusão molecular Superdex-75 acoplada a um sistema FPLC, na presença de três diferentes tampões, chegou-se a uma condição ideal de fracionamento do veneno crotálico. Em seqüência realizou-se a segunda etapa de purificação em sistema HPLC em uma coluna C4, onde foi possível identificar o pico de interesse. O pico puro passou por análises em MALDI-ToF sendo sua massa estimada em 14.074,92 Da, Quando analisado por eletroforese em gel de poiiacrilamida, a delta toxina apresentou massa molecular de cerca de 14 kDa e uma migração anômala, Por eletroforese 2D, a proteína apresentou caráter ácido, com pl entre 4 e 5 e massa molecular de aproximadamente 42 kDa, revelando \"spots\" muito semelhantes podendo ser isoformas com características de uma proteína glicosiiada. Após digestão dos spots com tripsina, os fragmentos foram confrontados com o banco de dados do \"swissprot\", mostrando alto grau de homologia \"até 43% de cobertura\" com a troca ri na, um ativador de protrombina do veneno de Tropidechis carinatus, esses dados foram confirmados com a análise de aminoácidos. De posse desses resultados, optou-se por testar a capacidade da fração purificada de ativar fator X e II, usando substratos sintéticos. Os resultados apontaram para uma ativação direta do fator X, uma vez que não houve ativação do fator II, atividade que também não foi detectada no veneno total. A mesma se mostrou um potente ativador da agregação de forma direta, uma vez que os ensaios de agregação plaquetária foram realizados com plaquetas lavadas, logo na ausência de fatores séricos. Quando os ensaios de agregação foram realizados na presença de alguns inibidores observou-se que nem a atividade metalo proteinase, nem a serino proteinase, tampouco um domínio lectina estavam envolvidos no processo, uma vez que EDTA, benzamidina e D-galactose não inibiram a atividade da proteína. No presente trabalho isolamos a Delta toxina do veneno de C. d. terrificus. A mesma se comportou como previsto por Vital Brazil em 1980, eluindo na posição por ele aventada, sendo uma proteína ativadora de Fator X que ativa agregação plaquetária mesmo em concentrações muito baixas e de massa molecular de 40 kDa levando nos a crer se tratar de um homotrímero cujos componentes são unidos por ligações fracas. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 02759.pdf: 4084534 bytes, checksum: 9f566ae8144088d7793859fc3ba3a449 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP