Nesse estudo investigamos os efeitos da hipóxia tecidual aguda (HA) sobre as propriedades eletrofisiológicas intrínsecas dos neurônios pré-simpáticos bulboespinhais da área rostro-ventrolateral do bulbo (RVLM) de ratos jovens adultos submetidos previamente à hipóxia crônica intermitente (HCI) e os seus respectivos controle. Para marcarmos os neurônios pré-simpáticos bulboespinhais da RVLM, ratos Wistar jovens (P19-P21) anestesiados com ketamina e xilazina, receberam microinjeções bilaterais de rodamina, um traçador fluorescente retrógrado, na coluna intermediolateral da medula espinhal (T3-T6) e 2 dias após a recuperação da cirurgia, os animais foram submetidos ao protocolo de HCI, enquanto que ratos controle foram mantidos em condições de normóxia, durante 10 dias. No décimo primeiro dia, os ratos foram novamente anestesiados para a remoção do cérebro e as fatias do tronco cerebral contendo neurônios pré-simpáticos com marcação positivas foram registrados. Utilizamos a técnica de whole cell patch-clamp para estudo das propriedades eletrofisiológicas desses neurônios. As propriedades eletrofisiológicas intrínsecas foram analisadas antes e após a HA, a qual foi produzida pela perfusão das fatias do tronco cerebral com uma solução hipóxica (95% N2 + 5% CO2) durante 2 minutos na presença de bloqueadores sinápticos excitatórios e inibitórios. Todos os neurônios pré-simpáticos apresentaram característica intrínseca de autodespolarização e a frequência de disparos basal de potenciais de ação (PAs) desses neurônios de ratos do grupo controle e HCI foram similares [Controle= 5,03 ± 0,4 Hz (n=39) vs HCI= 6,31 ± 0,7 Hz (n=31); p > 0,05]. No grupo controle, a HA não alterou a frequência média de disparos de PAs (BS = 5,03 ± 0,4 Hz vs HA = 5,24 ± 0,3 Hz (n=39); p > 0,05], porém revelou diferentes perfis de disparo de PAs após 2 min de exposição à HA: i) 11 neurônios com aumento na frequência de disparos (BS = 5,1 ± 0,7 Hz vs HA = 7 ± 0,7 Hz; p < 0,05]; ii) 21 neurônios sem alteração na frequência de disparos (BS = 4,8 ± 0,5 Hz vs HA = 5,36 ± 0,6 Hz; p > 0,05] e iii) 7 neurônios com diminuição na frequência de disparos (BS = 7,3 ± 1,1 Hz vs HA = 3,6 ± 0,7 Hz; p < 0,05). No grupo HCI, a HA produziu aumento na frequência média de disparos (BS= 6,31 ± 0,7 Hz vs HA= 7,25 ± 0,8 Hz; n=31 - p < 0,05) e na análise do perfil de disparo de PAs, a HA revelou 2 subpopulações: i) 9 neurônios com aumento na frequência de disparos (BS = 4,7 ± 0,8 Hz vs HA = 8,2 ± 1,4 Hz; p < 0,05) e ii) 22 neurônios sem alteração na frequência de disparos (BS = 7,0 ± 1,0 Hz vs HA = 6,8 ± 1,0 Hz; p > 0,05). Esse estudo nos permitiu revelar diferentes subpopulações de neurônios pré-simpáticos que responderam de forma distintas à HA. Os resultados também sugerem que a HCI teria um efeito pré- condicionante na excitabilidade intrínseca dos neurônios pré-simpáticos em resposta à HA / In this study we evaluated the effects of acute hypoxia (AH) on the intrinsic electrophysiological properties of presympathetic neurons from rostro ventrolateral medulla (RVLM) of juvenile rats exposed to chronic intermittent hypoxia (CIH) or normoxic condition (control group). To label the RVLM bulbospinal presympathetic neurons, young Wistar rats (P 19 - 21) anesthetized with ketamine and xylazine, received bilateral microinjections of a fluorescent retrograde tracer (rhodamine retrobeads) were performed into the intermediolateral column of spinal cord (T3-T6) and two days after recovery of the surgery, the animals were submitted to CIH or normoxic protocol, during 10 days. On the 11th day, under anesthesia, brainstem slices were obtained and only the labeled RVLM presympathetic neurons were recorded, using whole-cell patch-clamp approach to study the electrophysiological properties of these neurons. The intrinsic electrophysiological properties were analyzed before and after AH, which was produced by slice perfusion with hypoxic solution (95% N2 and 5% CO2) during 2 min in the presence of excitatory and inhibitory synaptic antagonists. All recorded RVLM presympathetic neurons presented intrinsic pacemaker activity and the baseline firing frequency of these neurons from control and CIH group were similar [Control= 5,03 ± 0,4 Hz (n=39) vs HCI= 6,31 ± 0,7 Hz (n=31); p > 0,05]. In the control group, AH do not change the firing rate (BS = 5,03 ± 0,4 Hz vs HA = 5,24 ± 0,3 Hz (n=39); p > 0,05), but revealed different pattern of firing frequency after 2 min of AH: i) 11 neurons increased the firing frequency (BS = 4,9 ± 0,9 Hz vs HA = 6,9 ± 1,0 Hz; p < 0,05) ; ii) 21 neurons do not change the firing frequency (BS = 4,8 ± 0,5 Hz vs HA = 5,36 ± 0,6 Hz; p > 0,05) and iii) 7 neurons decreased the firing frequency (BS = 7,3 ± 1,1 Hz vs HA = 3,6 ± 0,7 Hz; p < 0,05). In the CIH group, the AH increased the firing rate comparing with basal condition (SB= 6,31 ± 0,7 Hz vs AH= 7,25 ± 0,8 Hz; n=31 - p < 0,05) and analyzing the pattern of action potential, AH revealed 2 subpopulations in this group: i) 9 neurons increased the firing frequency (SB = 4,7 ± 0,8 Hz vs AH = 8,2 ± 1,4 Hz; p < 0,05) and ii) 22 neurons do not change the firing frequency (SB = 7,0 ± 1,0 Hz vs AH = 6,8 ± 1,0 Hz; p > 0,05).. The data shows that AH revealed different subpopulations of presympathetic neurons and suggest that CIH plays a preconditioning in the intrinsic excitability of presympathetic neurons in response to acute hypoxia

Nesse estudo investigamos os efeitos da hipóxia tecidual aguda (HA) sobre as propriedades eletrofisiológicas intrínsecas dos neurônios pré-simpáticos bulboespinhais da área rostro-ventrolateral do bulbo (RVLM) de ratos jovens adultos submetidos previamente à hipóxia crônica intermitente (HCI) e os seus respectivos controle. Para marcarmos os neurônios pré-simpáticos bulboespinhais da RVLM, ratos Wistar jovens (P19-P21) anestesiados com ketamina e xilazina, receberam microinjeções bilaterais de rodamina, um traçador fluorescente retrógrado, na coluna intermediolateral da medula espinhal (T3-T6) e 2 dias após a recuperação da cirurgia, os animais foram submetidos ao protocolo de HCI, enquanto que ratos controle foram mantidos em condições de normóxia, durante 10 dias. No décimo primeiro dia, os ratos foram novamente anestesiados para a remoção do cérebro e as fatias do tronco cerebral contendo neurônios pré-simpáticos com marcação positivas foram registrados. Utilizamos a técnica de whole cell patch-clamp para estudo das propriedades eletrofisiológicas desses neurônios. As propriedades eletrofisiológicas intrínsecas foram analisadas antes e após a HA, a qual foi produzida pela perfusão das fatias do tronco cerebral com uma solução hipóxica (95% N2 + 5% CO2) durante 2 minutos na presença de bloqueadores sinápticos excitatórios e inibitórios. Todos os neurônios pré-simpáticos apresentaram característica intrínseca de autodespolarização e a frequência de disparos basal de potenciais de ação (PAs) desses neurônios de ratos do grupo controle e HCI foram similares [Controle= 5,03 ± 0,4 Hz (n=39) vs HCI= 6,31 ± 0,7 Hz (n=31); p > 0,05]. No grupo controle, a HA não alterou a frequência média de disparos de PAs (BS = 5,03 ± 0,4 Hz vs HA = 5,24 ± 0,3 Hz (n=39); p > 0,05], porém revelou diferentes perfis de disparo de PAs após 2 min de exposição à HA: i) 11 neurônios com aumento na frequência de disparos (BS = 5,1 ± 0,7 Hz vs HA = 7 ± 0,7 Hz; p < 0,05]; ii) 21 neurônios sem alteração na frequência de disparos (BS = 4,8 ± 0,5 Hz vs HA = 5,36 ± 0,6 Hz; p > 0,05] e iii) 7 neurônios com diminuição na frequência de disparos (BS = 7,3 ± 1,1 Hz vs HA = 3,6 ± 0,7 Hz; p < 0,05). No grupo HCI, a HA produziu aumento na frequência média de disparos (BS= 6,31 ± 0,7 Hz vs HA= 7,25 ± 0,8 Hz; n=31 - p < 0,05) e na análise do perfil de disparo de PAs, a HA revelou 2 subpopulações: i) 9 neurônios com aumento na frequência de disparos (BS = 4,7 ± 0,8 Hz vs HA = 8,2 ± 1,4 Hz; p < 0,05) e ii) 22 neurônios sem alteração na frequência de disparos (BS = 7,0 ± 1,0 Hz vs HA = 6,8 ± 1,0 Hz; p > 0,05). Esse estudo nos permitiu revelar diferentes subpopulações de neurônios pré-simpáticos que responderam de forma distintas à HA. Os resultados também sugerem que a HCI teria um efeito pré- condicionante na excitabilidade intrínseca dos neurônios pré-simpáticos em resposta à HA / In this study we evaluated the effects of acute hypoxia (AH) on the intrinsic electrophysiological properties of presympathetic neurons from rostro ventrolateral medulla (RVLM) of juvenile rats exposed to chronic intermittent hypoxia (CIH) or normoxic condition (control group). To label the RVLM bulbospinal presympathetic neurons, young Wistar rats (P 19 - 21) anesthetized with ketamine and xylazine, received bilateral microinjections of a fluorescent retrograde tracer (rhodamine retrobeads) were performed into the intermediolateral column of spinal cord (T3-T6) and two days after recovery of the surgery, the animals were submitted to CIH or normoxic protocol, during 10 days. On the 11th day, under anesthesia, brainstem slices were obtained and only the labeled RVLM presympathetic neurons were recorded, using whole-cell patch-clamp approach to study the electrophysiological properties of these neurons. The intrinsic electrophysiological properties were analyzed before and after AH, which was produced by slice perfusion with hypoxic solution (95% N2 and 5% CO2) during 2 min in the presence of excitatory and inhibitory synaptic antagonists. All recorded RVLM presympathetic neurons presented intrinsic pacemaker activity and the baseline firing frequency of these neurons from control and CIH group were similar [Control= 5,03 ± 0,4 Hz (n=39) vs HCI= 6,31 ± 0,7 Hz (n=31); p > 0,05]. In the control group, AH do not change the firing rate (BS = 5,03 ± 0,4 Hz vs HA = 5,24 ± 0,3 Hz (n=39); p > 0,05), but revealed different pattern of firing frequency after 2 min of AH: i) 11 neurons increased the firing frequency (BS = 4,9 ± 0,9 Hz vs HA = 6,9 ± 1,0 Hz; p < 0,05) ; ii) 21 neurons do not change the firing frequency (BS = 4,8 ± 0,5 Hz vs HA = 5,36 ± 0,6 Hz; p > 0,05) and iii) 7 neurons decreased the firing frequency (BS = 7,3 ± 1,1 Hz vs HA = 3,6 ± 0,7 Hz; p < 0,05). In the CIH group, the AH increased the firing rate comparing with basal condition (SB= 6,31 ± 0,7 Hz vs AH= 7,25 ± 0,8 Hz; n=31 - p < 0,05) and analyzing the pattern of action potential, AH revealed 2 subpopulations in this group: i) 9 neurons increased the firing frequency (SB = 4,7 ± 0,8 Hz vs AH = 8,2 ± 1,4 Hz; p < 0,05) and ii) 22 neurons do not change the firing frequency (SB = 7,0 ± 1,0 Hz vs AH = 6,8 ± 1,0 Hz; p > 0,05).. The data shows that AH revealed different subpopulations of presympathetic neurons and suggest that CIH plays a preconditioning in the intrinsic excitability of presympathetic neurons in response to acute hypoxia

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However, the role of the above structures in cardiovascular recovery and autonomic changes induced by HS solution administration in animals submitted to HH has not yet been evaluated. Thus, the present study evaluated the A1, A2 neuronal clusters and MnPO nucleus involvement in the cardiovascular and autonomic responses promoted by HS solution infusion in hypovolemic animals. For this, wistar rats (280-320 g) were separated into four protocols: I. A2 neuronal cluster lesion (A2 Sham: n = 6; A2 Experimental: n = 6); II. A1 neuronal cluster lesion (A1 Sham: n = 6; A1 Experimental: n = 6); III. A1 and A2 neural clusters concomitant lesions (A1 + A2 Sham: n = 6; A1 + A2 Experimental: n = 6) and IV. Pharmacological inhibition of MnPO (MnPO Sham: n = 6; MnPO Experimental: n = 6). The animals of the first three protocols were anesthetized and subjected to saporin-anti-DβH nanoinjections for neuronal lesion (100 nL, 0.105 ng/nl) in experimental groups and Saporin nanoinjections (100 nL, 0.022 ng/nL) in sham groups for fictitious neuronal lesion, respectively, in the NTS, CVLM or simultaneously in the NTS and CVLM regions. After 20 days of recovery, the animals were anesthetized and instrumented to mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and renal sympathetic nervous activity (RSNA) recordings. Then, HH was performed by blood withdrawal until MAP reached approximately 60 mmHg. After 20 min of HH, sodium overload (3M NaCl, 1.8 mL/g, 90 seconds of infusion, i.v) was conducted. In another series of experiments, MnPO Sham and MnPO Experimental groups were anesthetized and instrumented for MAP, HR and RSNA recordings. Then, the animals were submitted to HH and HS infusion at the end of the hemorrhage. GABAergic agonist Muscimol (4 mM, 100 nL, MnPO Experimental group) or saline nanoinjections (0.15 M, 100 nL, MnPO Sham group) were performed in the MnPO after 10 min from the start of HH. HH-induced hypotension, bradycardia and renal sympathoinhibition in the animals of the A2 Sham, A1 Sham, A1 + A2 Sham and MnPO Sham groups. In the sham groups, HS infusion after HH reestablished MAP, HR, and did not alter the renal sympathoinhibition generated during hypovolemia. In the A2 Experimental and A1 Experimental groups, the specific lesion of A1 or A2 neurons did not alter the hypotension, bradycardia and renal sympathoinhibition caused during HH. In addition, the A1 or A2 neurons specific lesion did not alter the reestablishment of MAP, HR and the RSNA reduction after HS solution infusion. However, in the animals of the A1 + A2 experimental group, the simultaneous A1 and A2 neurons lesion did not alter the decrease in MAP and HR observed during HH, but abolished renal sympathoinhibition. In addition, simultaneous A1 and A2 neurons lesion abolished MAP restoration and ANSR reduction after HS infusion, while HR restoration was not modified. In the MnPO experimental animals, MnPO nucleus inhibition did not alter the decrease in MAP and HR observed during HH, but abolished renal sympathoinhibition. However, MnPO inhibition abolished the MAP restoration and promoted strong sympathetic activation in the renal bed after HS infusion, while HR restoration was not modified. These results suggest that the A1, A2 neuronal clusters and MnPO nucleus are part of the integration and transmission information circuits about changes in plasma osmolarity, participating in cardiovascular and autonomic recovery induced by sodium chloride overload in animals submitted to HH. / Os benefícios hemodinâmicos e cardiovasculares provenientes do uso de solução salina hipertônica (SH) no tratamento da hemorragia hipotensiva (HH) são relatados há vários anos. Recentes investigações mostraram a participação de regiões do sistema nervoso central (SNC), como os grupamentos neuronais A1 (localizado na região caudoventrolateral do bulbo; CVLM), A2 (localizado no núcleo do tracto solitário; NTS) e do núcleo Pré-óptico mediano (MnPO) nas respostas hemodinâmicas induzidas pela sobrecarga de cloreto de sódio em animais normovolêmicos. Entretanto, o papel das estruturas acima relacionadas na recuperação cardiovascular e nas alterações autonômicas induzidas pela administração de solução SH em animais submetidos à HH ainda não foi avaliado. Assim, o presente estudo buscou avaliar o envolvimento dos grupamentos neuronais A1, A2 e do núcleo MnPO nas respostas cardiovasculares e autonômicas promovidas pela infusão de solução SH em animais hipovolêmicos. Para isto, ratos Wistar (280-320 g) foram separados em quatro protocolos: I. Lesão do grupamento neuronal A2 (Controle A2: n=6; Experimental A2: n=6); II. Lesão do grupamento neuronal A1 (Controle A1: n=6; Experimental A1: n=6); III. Lesões concomitantes dos grupamentos neuronais A1 e A2 (Controle A1 + A2: n=6; Experimental A1 + A2: n=6) e IV. Inibição farmacológica do núcleo MnPO (Controle MnPO: n=6; Experimental MnPO: n=6). Os animais dos três primeiros protocolos foram anestesiados e submetidos a nanoinjeções de saporina-anti-DβH para lesão neuronal (100 nL, 0,105 ng/nL) nos grupos experimentais e Saporina (100 nL, 0,022 ng/nL) nos grupos controles para lesão neuronal fictícia, respectivamente, no NTS, na região CVLM ou conjuntamente no NTS e CVLM. Após 20 dias de recuperação, os animais foram novamente anestesiados e instrumentalizados para registro da pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e atividade nervosa simpática renal (ANSR). Em seguida, a HH foi realizada através da retirada de sangue até que a PAM atingisse aproximadamente 60 mmHg. Após 20 min de HH foi conduzida a sobrecarga de sódio (NaCl 3M, 1,8 mL/kg, 90 segundos de infusão, i.v). Em outra série de experimentos, os animais dos grupos controle MnPO e Experimental MnPO foram anestesiados e instrumentalizados para registro da PAM, FC, ANSR. Em seguida, foram submetidos à HH e a infusão de solução SH ao final da hemorragia. Nanoinjeções do agonista GABAérgico, muscimol (4 mM, 100 nL, grupo experimental MnPO) ou salina (0,15 M; 100 nL; grupo controle MnPO) foram realizadas no MnPO após 10 min do início da HH. A HH promoveu hipotensão, bradicardia e simpatoinibição no território renal nos animais dos grupos controle A2, controle A1, controle A1 + A2 e controle MnPO. Nos grupos controle, a infusão de solução SH após a HH reestabeleceu a PAM, FC e não alterou a simpatoinibição renal gerada durante a hipovolemia. Nos animais dos grupos experimental A2 e experimental A1, a lesão especifica dos neurônios A1 ou A2 não alterou a hipotensão, bradicardia e simpatoinibição provocados durante a HH. Em adição, a lesão especifica dos neurônios A1 ou A2 não alterou o reestabelecimento da PAM, FC e a queda da ANSR gerada após a infusão de solução SH. Entretanto, nos animais do grupo experimental A1 + A2, a lesão simultânea dos neurônios A1 e A2 não alterou a queda da PAM, da FC observada durante a HH, mas aboliu a simpatoinibição renal. Ademais, a lesão simultânea dos neurônios A1 e A2 aboliu a restauração da PAM e a redução da ANSR após a infusão de solução SH, enquanto a restauração da FC não foi modificada. Nos animais do grupo experimental MnPO, a inibição do MnPO não alterou a queda da PAM e da FC observadas durante a HH, entretanto aboliu a simpatoinibição renal. Porém, a inibição do núcleo MnPO aboliu a restauração da PAM e promoveu forte simpatoexcitação no leito renal após a infusão de solução SH, enquanto a restauração da FC não foi modificada. Esses resultados sugerem que os neurônios dos grupamentos A1, A2 e o núcleo MnPO fazem parte dos circuitos de integração e transmissão de informações a respeito de mudanças na osmolaridade plasmática, participando da recuperação cardiovascular e autonômica induzida pela sobrecarga de cloreto de sódio em animais submetidos à HH.