Des de l’any 2001, diferents brots d’una malaltia associada a la infecció per un pestivirus, concretament un virus de la malaltia de la frontera de genotip 4 (BDV-4, de l’anglès border disease virus), han causat reduccions importants en el nombre d’efectius d’isard (Rupicapra pyrenaica pyrenaica). L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral va consistir en estudiar l’epidemiologia de la infecció per BDV a l’isard i a altres remugants salvatges i domèstics, ja que els pestivirus no són hoste-específics estrictes. La principal zona d’estudi va consistir en els Pirineus Catalans i Andorrans, però també es van estudiar diferents zones dels Ports de Tortosa i Beseit i Sierra Nevada, a Espanya, i dels Alps italians i suïssos. Les espècies estudiades van ser l’isard, el mufló europeu (Ovis aries), el cérvol (Cervus elaphus), el cabirol (Capreolus capreolus), la daina (Dama dama), l’isard alpí (Rupicapra rupicapra), l’íbex (Capra ibex) i la cabra salvatge (Capra pyrenaica), així com l’oví, caprí i vaquí que pasturen en els prats d’alta muntanya. Es va determinar la presència d’anticossos enfront a pestivirus en sèrum mitjançant una tècnica d’ELISA. En els sèrums positius es va dur a terme un test de seroneutralització vírica comparada amb una soca del virus de la diarrea vírica bovina (BVDV, de l’anglès bovine viral diaorrhea virus) i diferents soques de BDV locals i de referència. La detecció vírica es va realitzar mitjançant una tècnica de reacció en cadena de la polimerasa inversa i/o un test ELISA. Per últim, es va seqüenciar la regió no codificant 5’ dels virus detectats i es van aïllar. L’estudi de poblacions d’isard prèviament afectades per brots de malaltia va indicar que la infecció per BDV ha esdevingut endèmica en determinades zones i que possiblement aquest fet està relacionat amb la manca de recuperació de certes poblacions. Tanmateix, en altres zones, el virus aparentment ha deixat de circular i la recuperació de la població d’isards després dels brots és bona. L’estudi a la reserva nacional de caça de Freser-Setcases, va establir que el BDV-4 és mantingut a la població d’isards sense causar cap efecte negatiu a la dinàmica poblacional. És possible que en aquesta població hi circulin soques menys virulentes de BDV-4, causant una elevada seroprevalença i evitant la dispersió d’altres soques més virulentes, i l’aparició d’un brot de malaltia. En totes les poblacions els isards seropositius van presentar títols més alts d’anticossos contra les soques BDV, i la majoria contra les BDV-4, concretament. En tots els remugants salvatges que comparteixen hàbitat amb l’isard es va detectar una seroprevalença baixa. La seroprevalenca en oví i caprí va variar depenent de l’origen geogràfic, i al vaquí sempre va ser elevada. L’oví va presentar títols d’anticossos més alts enfront a les soques BDV-4, el vaquí a BVDV i les cabres enfront a BDV-4 i BVDV. Als estudis realitzats al sud-oest dels Alps italians es va detectar una elevada seroprevalença a l’isard alpí. Aquest fet suggereix que la infecció per pestivirus és freqüent a les ambdues espècies del gènere Rupicapra. Per altra banda, als íbex i a les cabres salvatges de totes les zones es va detectar una seroprevalença molt baixa, i la majoria dels individus positius van mostrar anticossos enfront a BDV. A Suïssa, tots els cérvols analitzats i un isard alpí van mostrar anticossos enfront a BVDV, mentre que la resta d’isards van mostrar títols més alts enfront a BDV. Aquest resultat indica que els remugants salvatges de Suïssa es poden infectar amb les dos espècies de pestivirus. / Since 2001 several outbreaks of a new disease associated to Border Disease Virus (genus Pestivirus) of genotype 4 infection (BDV-4) have caused important declines in the Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) populations. The main goal of the present research work was to study the epidemiology of BDV infection in Pyrenean chamois and other wild and domestic ruminants, since pestiviruses are not strictly host-specific. The main study areas consisted of the Catalan and Andorran Pyrenees, but also different areas from the Ports de Tortosa i Beseit and Sierra Nevada Spanish mountains and from the Italian and Swiss Alps. The studied species were the Pyrenean chamois, European mouflon (Ovis aries), red (Cervus elaphus), roe (Capreolus capreolus), and fallow deer (Dama dama), Alpine chamois (Rupicapra rupicapra), Alpine (Capra ibex) and Iberian ibex (Capra pyrenaica), and sheep, goats and cattle that share the habitat with chamois. Sera were tested for the presence of antibodies against pestivirus with a commercial blocking ELISA assay. Comparative virus neutralization tests were performed in positive sera by using a bovine viral diarrhoea virus (BVDV) strain and reference and local BDV strains. Viral detection in wild ruminants was performed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using the panpestivirus primers 324 and 326 and/or with a commercial sandwich ELISA assay. As last, the sequence analyses of the 5’UTR region from positive samples and virus isolation were performed. The study of pestivirus epidemiology in Pyrenean chamois populations previously affected by BDV-infection outbreaks revealed that in some populations the disease has become endemic and BDV circulates frequently in the chamois population, possibly having a negative impact on host population dynamics. Contrarily, in some populations BDV does not seem to circulate after the disease outbreak. The study of a Pyrenean chamois population from the Eastern Pyrenees unaffected by disease outbreaks revealed that BDV-4 is self-maintained in this population, apparently without causing negative population dynamic effects. The circulation of weakly virulent strains could have been the cause of the high seroprevalence detected, which could hinder the spread of more virulent strains within this chamois population and the appearance of disease outbreaks. The seropositive Pyrenean chamois had BDV antibodies in all the studied populations, and most of them had higher titres against the BDV-4 strains. All the wild ruminants sharing habitat with Pyrenean chamois showed a low seroprevalence. The seroprevalence in sheep and goats, varied depending on the geographical origin, while in cattle it was constantly high. Sheep had higher antibody titres against the BDV-4 strains, cattle against BVDV, while goats showed higher titres against both BVDV and BDV strains. The study of pestivirus epidemiology in the south-western Italian Alps revealed a high seroprevalence in Alpine chamois, suggesting that members of the genus Rupicapra are likely to be infected with pestiviruses. Otherwise, Alpine and Iberian Ibex from all zones had a low seroprevalence, and most of the positive ibex had BDV antibodies. In Switzerland, the analyzed red deer and one Alpine chamois, had antibodies to BVDV, and the rest of chamois had antibodies to BDV. This results shows that the wild ruminants from this country can be infected with both pestivirus species, BVDV and BDV.

Els inhibidors de la transcriptasa inversa vírica i de la proteasa, són dos tipus de fàrmacs àmpliament utilitzats en la lluita contra el virus de la immunodeficiència humana tipus-1 (VIH-1). Un correcte ús i disseny dels tractaments, pot conduir a una inhibició sostinguda de la replicació vírica, tot i que, no a una eliminació de la infecció. Un dels majors obstacles de la teràpia, és l'aparició de mutacions en el genoma víric, associades a una disminució de l'eficàcia terapèutica. Les pròpies característiques del VIH afavoreixen l'aparició d'aquestes mutacions que faciliten la imposició de variants capaces d'escapar a les situacions adverses, com pot ser la presència d'un fàrmac antiretroviral. En aquest treball s'han analitzat l'efecte que una major o menor inhibició de la replicació vírica pot tenir sobre l'evolució vírica i l'aparició de mutants de resistència. Dels resultats dels treballs realitzats vam poder concloure que, el nivell de supressió de la replicació vírica, condiciona la facilitat d'aparició de mutacions associades a resistència, malgrat l'existència d'evolució genètica. També es va analitzar l'ús d'un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda. Aquest sistema va ser dissenyat per l'anàlisi de proteases específiques pel lloc de tall, com és la proteasa del VIH-1. Tant l'acitivitat com la susceptibilitat als inhibidors de la proteasa són dos paràmetres importants a determinar de les diverses variants genètiques d'aquest enzim. Així vam veure que aquest sistema era útil per l'anàlisi de proteases obtingudes de mostres de pacients i permetia preveure la resposta a un posterior canvi de tractament. Altrament era molt sensible a la detecció de variacions en l'activitat proteolítica induida per canvis simples en la cadena aminoacídica, així com també permetia detectar canvis en la sensibilitat als diversos inhibidors de la proteasa. En resum doncs, vam concloure que, el sistema de cribratge basat en el bacteriòfag lambda constituiex una bona eina per a la caracterització de proteases del VIH-1 rellevants clínicament, així com, per la profundització en l'estudi i caracterització d'aquesta proteïna i les seves variants. / Inhibitors of protease and reverse transcriptase, are both widely used as drugs for threatment of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection. A correct use and design of threatments can reach an inhibition of viral replication during long periods of time. One of the major problems of therapy is the appearance of mutations in the viral genome associated with a diminution of therapy efficacy. The easy incorporation of mutations during replication of HIV-1, allowed the appearance of scape mutants. Here we evaluated how the level of viral replication can afect the appearance of genotipic resistance. We concluded that the level of supresion of viral replication conditionate the appearance of resistance associated mutations despite the existence of genetic evolution. We also evaluated the use of a bacteriophage lambda-based genetic screening system. This system was designed to evaluate cleavage site specific proteases as HIV-1 protease. The activity and drug susceptibility are two parameters important of HIV-1 protease variants. We found the system useful for the analysis of HIV-1 proteases from patient samples and was useful too, to predict the efect of a new therapy. The system was also very sensible to detect changes of the proteolytic activity due to simple genetic mutaions. In summary, we concluded that the lambda-based genetic screening system was a good tool to characterisate HIV-1 proteases clinically important, as was for the further study and characterisation of this protein and its variants.

Raltegravir es el primer inhibidor de la integrasa del VIH-1 aprobado para su uso en pacientes infectados por el VIH. Sinembargo, como el resto de los inhibidores, la emergencia de mutaciones de resistencia limita su eficacia clínica. El entendimiento de la prevalencia diferencial del ratio de mutaciones dentro de la región codificadora de la integrasa en pacientes con tratamiento TARGA (Tratamiento Antirretroviral de Gran Actividad) pero sin inhibidores de la integrasa, podría ayudar a identificar si algunas mutaciones virales o polimorfismos naturales ocurren, y si la diversidad genética del gen de la integrasa tiene implicaciones importantes en la respuesta clínica a los inhibidores de la integrasa. Por lo tanto, el primer objetivo de esta tesis doctoral fue explorar la evolución longitudinal de la región codificadora de la integrasa viral en pacientes que había recibido, durante una media de 10 años, terapia antirretroviral sin inhibidores de la integrasa. Un objetivo adicional, fue el estudio del efecto de los cambios genotípicos a la susceptibilidad al raltegravir y a la capacidad replicativa, en aquellas muestras que acumularon el mayor número de substituciones aminoacídicas durante el periodo de estudio. Nuestros resultados mostraron que las integrasas virales, después de una terapia antirretroviral prolongada, mantenían la sensibilidad genotípica y fenotípica al raltegravir. Además los cambios genotípicos a lo largo del tiempo, condujeron hacia una mejora de la capacidad replicativa de virus recombinantes para la integrasa viral, sugiriendo que el tratamiento antirretroviral prolongado no tiene coste biológico a nivel de capacidad replicativa del virus. Por lo tanto, nuestros datos apuntan que los tratamientos actuales no disminuyen la capacidad replicativa de la integrasa viral ni influyen la susceptibilidad al raltegravir. Hasta el momento, no existen estudios que evalúen la contribución fenotípica de mutaciones fuera de la región codificadora de la integrasa en pacientes que fracasan a tratamientos que contenían raltegravir. Las mutaciones de resistencia en la integrasa podrían jugar un papel importante en los cambios fenotípicos, tales como la capacidad replicativa y la susceptibilidad farmacológica. El segundo objetivo de esta tesis, fue comparar las contribuciones epistáticas de la integrasa, la proteasa, la transcriptasa reversa y el resto del genoma del VIH-1 en el fitness viral y la susceptibilidad al raltegravir en pacientes con y sin mutaciones de resistencia en la integrasa viral pero que fracasaban al TARGA conteniendo inhibidores de la integrasa. Nuestros resultados sugirieron una ausencia de efectos epistáticos entre los genes del VIH-1 en relación a la susceptibilidad farmacológica al raltegravir. Sinembargo, cambios genotípicos en la proteasa, la transcriptasa reversa y fuera de la polimerasa, compensaron la capacidad replicativa de virus que contenían mutaciones de resistencia en la integrasa viral. Por lo tanto, en pacientes que fracasaban a terapias que contenían inhibidores de la integrasa, la susceptibilidad al raltegravir estuvo esencialmente modulada por las mutaciones de resistencia dentro de la región codificadora de la integrasa, mientras que otros genes del VIH-1 estaban involucrados en la modulación del fitness viral. En pacientes con TARGA que consiguen suprimir la carga viral, se ha detectado la existencia de una viremia residual con métodos ultrasensibles. Si esta viremia residual refleja una replicación viral de bajo grado, o es el resultado de una producción viral por parte de reservorios estables, no está claro. Esta pregunta tiene serias implicaciones clínicas, porque si la viremia residual refleja una replicación de bajo grado, entonces la intensificación del TARGA podría ser útil para prevenir una evolución viral con el consecuente fracaso farmacológico. Los nuevos agentes farmacológicos, como los inhibidores de la integrasa, nos proporcionan nuevas herramientas con las que poder evaluar los reservorios virales que persisten en pacientes con TARGA. Raltegravir tiene un efecto único sobre las formas de ADN viral, incrementando las formas episomales 2-LTRs cuando la replicación es inhibida por el fármaco. El tercer objetivo de esta tesis fue evaluar si la intensificación del TARGA con raltegravir era capaz de impactar los niveles de ADN viral y la activación inmune. La intensificación con raltegravir bloqueó la replicación activa y la producción de virus infecciosos en un 29 por ciento de los pacientes. Nuestro estudio también reveló la relación efecto-causa entre la replicación activa y la activación inmune, sugiriendo que bajo un TARGA supresivo, la replicación activa es una causa, en vez de una consecuencia, de la anormal activación inmune. Por lo tanto, la intensificación del TARGA perturba el reservorio viral con implicaciones importantes para las estrategias terapéuticas dirigidas a alcanzar la erradicación viral. / Raltegravir is the first in-class HIV-1 integrase inhibitor approved for the treatment of HIV-1 infected subjects. However, like all other HIV inhibitors, the emergence of drug resistance limits its clinical efficacy. Understanding the differential prevalence rate of mutations within the integrase coding region from Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART)-experienced but integrase inhibitor-naïve subjects could help identify whether clinically relevant viral mutations or natural polymorphisms occur, and whether the sequence diversity of the integrase gene has important implications in the clinical response to integrase inhibitors. Therefore, the first objective of this project thesis was to explore intrasubject longitudinal evolution of the HIV-1 integrase-coding region over a median of 10 years of heavy antiretroviral therapy in integrase inhibitor-naïve subjects. An additional objective was to explore changes in phenotypic susceptibility to raltegravir and replication capacity in those samples that accumulated the highest number of amino acid substitutions during the study period. Our results showed that HIV-1 integrase from longitudinal samples did not show evidence of genotypic or phenotypic resistance to raltegravir. Long-term antiretroviral pressure did not impair the raltegravir susceptibility and appeared to drive the replication capacity of integrase-recombinant viruses towards improved phenotypes, suggesting no fitness cost associated with long¬term treatment. Therefore, our data suggest that current antiretroviral regimens do not diminish the fitness of integrase or influence raltegravir efficacy. No studies have evaluated the potential phenotypic contributions of mutations outside the integrase coding region in subjects whose raltegravir-containing regimens fail. Integrase resistance mutations could play a major role in phenotypic changes, such as replication capacity and drug susceptibility. The second objective of this thesis project was to compare the relative epistatic contributions of integrase, protease, reverse-transcriptase and the rest of the HIV-1 genome on viral fitness and susceptibility to raltegravir in subjects with and without raltegravir-resistance associated mutations and whose raltegravir-containing regimen has failed. Our results suggested an absence of epistatic effects between HIV-1 genes with regard to in vitro susceptibility to raltegravir. However, changes in protease, reverse-transcriptase and outside Polymerase compensated for the ex vivo replication capacity of viruses containing integrase resistance mutations. Therefore, raltegravir susceptibility was essentially driven by resistance mutations within the integrase coding region, whereas other HIV-1 genes were involved in modulating viral fitness in subjects whose raltegravir-containing regimen failed. In subjects under a suppressive HAART, residual viremia has been detected using ultra-sensitive methods. Whether residual viremia reflects ongoing viral replication at low levels or the production of virus from stable reservoirs remains unclear. Importantly, this question has immediate clinical implications, because if residual viremia reflects ongoing viral replication, then the intensification of the current treatment might be useful in preventing viral evolution and subsequent treatment failure. New classes of antiretroviral agents, such as integrase inhibitors, provide new tools to assess the viral reservoirs that persist in HAART-suppressed subjects. Raltegravir has a unique effect on viral DNA forms, leading to a measurable increase in 2-LTRs DNA circles when replication is inhibited. The third objective of this project thesis was to assess whether raltegravir intensification of the HAART regimen was able to impact the levels of HIV-1 DNA and immune markers in subjects with undetectable viremia measured by standard assays. Raltegravir intensification in HAART-suppressed subjects blocked active replication and production of infectious virus in 29 percent of subjects. Our study also revealed a causative relationship between active replication and immune activation, suggesting that under a suppressive HAART, active replication is a cause rather than a consequence of aberrant immune activation. Therefore, treatment intensification disturbs the latent reservoir, with important implications for therapeutic strategies aimed at achieving viral eradication.

El Circovirus porcí tipus 2 (PCV2) és l'agent causal de la circovirosi porcina (CP), una malaltia multifactorial que afecta porcs en fases de transició i engreix i que causa importants pèrdues econòmiques a la indústria porcina d'arreu del món. Les característiques histopatològiques de la CP i el fet que els animals malalts pateixin sovint infeccions secundàries i oportunístiques indica que aquesta malaltia implica una greu alteració del sistema immunitari del porc. Durant molts anys, el control de la CP es centrava principalment en la millora d'estratègies de maneig i en el control dels factors de risc que influeixen la presentació clínica de la malaltia. A dia d'avui, s'han introduït al mercat internacional quatre vacunes enfront PCV2 i la seva implementació al camp ha disminuït dràsticament la incidència de la CP. La present Tesi tenia com objectiu la caracterització de les respostes immunitàries desenvolupades pel porc en el curs de la infecció i vacunació per PCV2. En la primera part (Estudis I i II), es va caracteritzar el perfil immunològic de porcs sub-clínicament infectats amb PCV2, amb especial èmfasi en les respostes mediades per cèl·lules i el paper de les proteïnes capside (Cap) i replicasa (Rep) de PCV2 en el seu desenvolupament. Es va demostrar que el virus sencer, però no Cap i Rep indueix l'alliberació d'interleuquina (IL)-10 en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (CMSP), fins i tot en els cultius procedents d'animals verges, indicant l'origen innat d'aquesta resposta. Addicionalment, es va observar que, en fases inicials de la infecció per PCV2, es pot detectar interferó (IFN)-α en sèrum (dia 5 post-inoculació (PI)). Per altra banda, nivells detectables d'IL-10 només s'observaren de forma esporàdica, suggerint que els animals infectats sub-clínicament per PCV2 no es caracteritzen per tenir nivells elevats d'aquesta citoquina en sèrum. En relació a la immunitat adaptativa enfront a PCV2, es va veure que la resposta humoral es desenvolupa entra la segona i tercera setmana PI i que es caracteritza per la producció d'anticossos totals i neutralitzants, essent els neutralitzants d'aparició més tardana. La immunitat mediada per cèl·lules apareix entre la primera i segona setmana PI, i tant Cap com Rep estan implicades en el seu desenvolupament. A la segona part d'aquesta Tesi (Estudis III i IV), es va avaluar la immunogenicitat i eficàcia d'una vacuna comercial (una i dues dosis) basada en la Cap d'una soca de genotipus PCV2a en porcs convencionals. Els resultats d'aquests estudis van demostrar que la vacunació indueix el desenvolupament d'immunitat humoral i cel·lular i redueix la viremia, l'excreció i la càrrega vírica en teixits després de la infecció amb PCV2, tant amb soques de genotipus PCV2a com PCV2b. També es va observar que els anticossos maternals (AM) protegeixen enfront la infecció per PCV2 i influeixen en el desenvolupament de la resposta humoral després de la vacunació. Els resultats de l'estudi IV suggereixen que porcs amb títols d'IPMA per sota 5 log2 són potencialment més susceptibles a infectar-se amb PCV2. D'altra banda, es va veure que títols d'IPMA per sobre 10 log2 poden interferir amb el desenvolupament d'anticossos en resposta a la vacunació. En base a aquestes observacions, es proposa una "finestra de vacunació", definida com el rang de títols d'anticossos en el que els porcs s'haurien de vacunar per minimitzar la interferència amb els AM i, al mateix temps, assegurar el desenvolupament d'immunitat protectiva abans que els animals s'exposin a PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the causative agent of Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a multifactorial disease of nursery and fattening pigs that causes considerable economic losses to the swine industry worldwide. The histopathological features of PMWS and the fact that secondary and opportunistic infections are common in PMWS-affected pigs indicate that this disease involves a deep alteration of the immune system. For years, control of PMWS was limited mainly to the improvement of management strategies and to the control of risk factors thought to influence the infection outcome. At present, four vaccines against PCV2 are being sold on the international market and their application in the field drastically reduced the incidence of PMWS. This Thesis aimed to characterize the immune responses developed by pigs upon PCV2 infection and vaccination. In the first part (Studies I and II), the immune features of PCV2 experimental sub-clinical infections were characterized, with particular emphasis on cell-mediated responses, and on the role of PCV2 capsid (Cap) and replicase (Rep) proteins on it. Results from these studies showed that whole PCV2, but not Cap or Rep, induces the release of interleukin (IL)-10 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), even in those cultures obtained from PCV2-naïve pigs, a fact that indicates the innate origin of this response. In addition, it was found that interferon (IFN)-α can be detected in serum at early stages of the sub-clinical infection (5 days post inoculation (PI)). In contrast, IL-10 in serum could only be sporadically detected, suggesting that increased levels of this cytokine are not characteristic of PCV2 sub-clinically infected pigs. With regards to the acquired immunity to PCV2, humoral responses were developed mostly between the second and third week PI, characterized by the production of PCV2 total and neutralizing antibodies (NA), appearing NA later than total antibodies. Cell-mediated immunity developed within the first two weeks PI and it was demonstrated that both Cap and Rep proteins of PCV2 are involved in its development. In the second part of this thesis (Studies III and IV), the immunogenicity and efficacy of a commercial PCV2a-based sub-unit vaccine used in one- and two-dose schedules was evaluated in conventional piglets. Results from these studies demonstrated that vaccination induced the development of humoral and cell-mediated responses and significantly reduced viremia, shedding, and viral load in tissues upon challenge with either PCV2a or PCV2b isolates. It was also found that maternally derived PCV2 antibodies (MDA) protect against PCV2 infection and influence the humoral response developed after vaccination. Results from study IV suggest that pigs with IPMA titres below 5 log2 are potentially more susceptible to PCV2 infection. Besides, IPMA titres beyond 10 log2 were seen to interfere with the development of antibodies following PCV2 vaccination. Based on these observations a "vaccination window" was proposed, defined as the range of antibody titres at which piglets should be vaccinated to minimize interference with MDA and, at the same time, ensure the development of protective immunity before PCV2 exposure.

El gen precore-core del virus de la hepatitis B (VHB) se transcribe en dos ARN diferentes (ARNcore y ARNprecore) por la presencia en el promotor básico para este gen (PBC) de elementos que dirigen independientemente la síntesis de estos dos ARN. En la región precore del mismo gen se han descrito mutaciones que impiden la síntesis del HBeAg. Objetivos: 1.Estudiar en pacientes con hepatitis crónica B y portadores asintomáticos (p.a.) del VHB las concentraciones de ADN-VHB y HBeAg, el genotipo viral y la lesión histológica hepática. Relacionar con la presencia de mutaciones en el PBC y precore. 2. En pacientes con infección por VHB, VHC y/o VHD, determinar la concentración de ADN-VHB, ARN-VHC y ARN-VHD, genotipo viral y distribución de mutaciones en el PBC y precore del VHB. Pacientes: Objetivo 1: 182 HBsAg(+):116 hepatitis crónica: 30 HBeAg(+) con ALT elevada (14 HCA y 2 CH), 58 HBeAg(-) con ALT elevada (24 HCA y 10 CH), 28 ALT fluctuante (ALTf): 27 HBeAg(-) y 1 HBeAg(+) (6 HCA); 66 p.a. HBeAg(-). Objetivo 2: 175 Hepatitis crónica: 65 Coinfecciones (25 VHB/VHC, 18 VHB/VHD y 22 VHB/VHC/VHD) y 110 Infección aislada (55 VHB y 55 VHC). Métodos: VHB: HBsAg (EIA), HBeAg/Anti-HBe (RIA), cuantificación del HBeAg (RIA), determinación cualitativa del ADN-VHB (doble PCR), cuantificación del ADN-VHB (PCR en tiempo real), genotiopado VHB y mutaciones en PBC y precore (doble PCR y secuenciación). VHC: Anti-VHC (EIA), determinación cualitativa del ARN-VHC (RT-PCR), cuantificación del ARN-VHC (monitor test), genotipado VHC (RT-PCR-DEIA).VHD: Anti-HD (RIA), determinación cualitativa del ARN-VHD (RT-PCR), genotipado VHD (secuenciación). Resultados y conclusiones: 1. Mutaciones en el PBC en nuestra área: 72% en la hepatitis crónica HBeAg(-), 47% en hepatitis crónica HBeAg(+) y 52% en p.a. 2. La mutación mayoritaria en el PBC fue la sustitución de una G por una A en la posición 1764 (95% de las secuencias mutadas): su análisis sería el más sensible y suficiente para el estudio global del PBC. 3. Los pacientes con mutaciones en el PBC presentaron menor concentración de HBeAg: mutaciones en el PBC disminuyen pero no anulan la expresión del HBeAg; pero la presencia de estas mutaciones no afectaba a la concentración de ADN-VHB. 4. Las variantes de la región precore que impiden la expresión del HBeAg se detectaron preferentemente en la hepatitis crónica HBeAg(-) y, en proporción inferior, en p.a. Las variantes más frecuentes: posiciones 1896 (73% de las secuencias mutadas) y 1814-1817 (23% de las secuencias mutadas); para el estudio de la región precore es necesario realizar el análisis de estas mutaciones. 5. Análisis conjunto del PBC y precore: únicamente la presencia de mutaciones en las posiciones 1896 y 1899 del precore está asociada con mayores concentraciones de VHB. Las mutaciones en el PBC y/o precore están relacionadas con el estadío HBeAg(-) y la cirrosis hepática (posiciones 1764, PBC, y 1899, precore) y permite diferenciar a nivel molecular la hepatitis crónica ALTf del p.a. del VHB. 6. El genotipo A, mayoritario en el grupo HBeAg(+) con ALT elevada, y el genotipo D en HBeAg(-) con ALT elevada. La prevalencia de ambos genotipos era similar en ALTf y p.a. La presencia de mutaciones en el PBC se relacionó con el genotipo A mientras que en el precore con el genotipo D. En cada grupo de pacientes la carga viral era independiente del genotipo. 7. En las coinfecciones por VHB y VHC se observó una inhibición mutua entre ambos, con un mayor efecto inhibidor del VHC sobre el VHB. En la coinfección triple, el VHD actúa como dominante, e inhibe mayormente al VHC. La interacción entre los distintos virus no está influida por los genotipos. La coinfección por el VHC se relacionó con menor proporción de mutaciones en el PBC y precore del VHB. / The precore-core gen of the (HBV) is transcribed in 2 differents mRNAs (RNAcore and RNAprecore) by the action of differents elements in the basic core promoter for this gen (BCP). In the precore region of the same gen have been showed mutations able to abolish the synthesis of HBeAg. Aims: 1.To stablish in patients with chronic hepatitis B and HBV assymptomatic patients (AP), HBV-DNA and HBeAg concentrations, HBV genotype and the liver histologycal injury. Relation with mutations in BCP and precore. 2. To stablish in patients with HBV, HCV and/or HDV infection, the HBV-DNA, HCV-RNA and HDV-RNA concentrations, viral genotype and the presence of BCP and precore mutations. Patients: Aim 1: 182 HBsAg(+):116 chronic hepatitis: 30 HBeAg(+) with rised ALT (14 ACH and 2 HC), 58 HBeAg(-) with elevated ALT (24 ACH and 10 HC), 28 fluctuating ALT (ALTf): 27 HBeAg(-) and 1 HBeAg(+) (6 ACH); 66 HBeAg(-) AP. Aim 2: 175 chronic hepatitis: 65 Coinfections (25 HBV/HCV, 18 HBV/HDV and 22 HBV/HCV/HDV) and 110 isolated infections (55 HBV and 55 HCV). Methods: HBV: HBsAg (EIA), HBeAg/Anti-HBe (RIA), HBeAg quantification (RIA), HBV-DNA qualitative determination (nested-PCR), HBV-DNA cuantification (real time PCR), HBV genotype and mutations in BCP and precore (nested-PCR and sequenciation). HCV: Anti-HCV (EIA), HCV-RNA qualitative determination (RT-PCR), HCV-RNA quantification (monitor test), HCV genotype (RT-PCR-DEIA).HDV: Anti-HD (RIA), HDV-RNA qualitative determination (RT-PCR), HDV genotype (sequenciation). Results and conclusions: 1. BCP mutations in our area: 72% in HBeAg(-) chronic hepaititis, 47% in HBeAg(+) chronic hepatitis and 52% in AP. 2. The more prevalent mutation in BCP was the substitution of G to A in 1764 (95% in BCP mutated sequences): this analysis would be sufficient to the overall study of BCP. 3. Patients with BCP mutations presented a lower HBeAg concentration: BCP mutations reduce but not abolish HBeAg expression; nevertheless these mutations ware not related with HBV-DNA levels. 4. The precore region variants that abolish HBeAg expression was detected preferably in HBeAg(-) chronic hepatitis and, in a lower proportion, in AP. The more frequent variants: positions 1896 (73% in precore mutated sequences) and 1814-1817 (23% in precore mutated sequences): to study the presence of precore mutations is necessary to performance the analysis of these two regions. 5. Combined analyses of BCP and precore: only the presence of mutations in 1896 and 1899 was related with highers HBV-DNA concentrations. BCP and/or precore mutations was related with the HBeAg(-) state and HC (1764 position -BCP- and 1899 - precore-) and allow the differenciation between ALTf and AP in a molecular level. 6. Genotype A was found more frequently in HBeAg(+) with rised ALT, and genotypo D in HBeAg(-) with elevated ALT. The frequency of these genotypes was similar in ALTf and AP. BCP mutations were related with genotype A and precore mutations with genotypo D. In each group of patients HBV-DNA leves ware not associated with genotype. 7. A mutual nhibitory action between HBV and HCV in this dual coinfection was showed, with a stronger inhibitory effect of HCV over replication of HBV. HDV had a dominant role in triple coinfection, and seemed to exert a higher negative influence on HCV replication than on HBV. The interaction between the differents virus was not affected by the genotypes. HCV coinfection was related with a lower proportion of patients with BCP and precore mutants.

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia (ICO) i a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / Oncolytic adenoviruses represent an appealing therapeutic approach to treat cancer regarding its capability to infect and kill selectively tumor cells without damaging normal tissues. Tumor targeting upon intravenous administration and subsequent intratumoral virus dissemination are key features to improve oncolytic adenovirus therapy. To address these hurdles, in this work we have combined two different genetic modifications previously described by our group in an oncolytic adenovirus backbone with selective replication conditional to pRB pathway deregulation. First, the replacement of the heparan sulfate glycosaminoglycan-binding site KKTK of the fiber shaft with an integrin-binding motif RGDK for tumor-targeting that has shown to prolong blood persistence and significantly enhance the therapeutic index compared with a non­RGDK-modified virus. Second, the expression of hyaluronidase to degrade the extracellular matrix and improve the intratumoral spread of the virus. Preclinical toxicology and biodistribution studies conducted in non-permissive mouse and semi-permissive Syrian hamster models supported the selectivity and safety of this novel virus, ICOVIR-17K. Antitumor efficacy was also demonstrated in different tumor models in immunodeficient mice and immunocompetent hamsters upon different routs of administration. Moreover, the combination of ICOVIR-17K with the chemotherapeutic drug gemcitabine further increased the antitumor activity of the virus. The data presented in this thesis strongly supports ICOVIR-17K as a promising clinical candidate which is currently being tested in phase I clinical trials. Besides direct killing of cancer cells, oncolytic viruses may induce antitumor immune responses. Local inflammation of tumor tissue during an infection by an oncolytic virus provides suitable conditions to trigger antitumor immune responses against the tumor-associated antigens that are released in the immunogenic cell death process caused by these agents. Oncolytic adenoviruses can be used to promote immune responses against tumors by expressing and/or displaying tumor-associated antigens. However, a key limitation of this immunotherapeutic approach is the bias of the response towards the immunodominant viral antigens instead of the less immunogenic tumor antigens. In addition, defects in MHC class I antigen presentation pathway such as the downregulation of the transporter associated with antigen processing (TAP) are frequently associated with immune evasion of tumor cells and further impair the generation of specific immune responses against tumor antigens carried by oncolytic viruses. In this work we present a novel strategy that benefit from the TAP deficiency on tumor cells to enhance the response against those tumor epitopes, which had been attached to the viral protein E3-19K. This protein has a signal sequence that targets it to the endoplasmic reticulum, bypassing the necessity of TAP to transport the epitopes to that compartment. Compared to the display of the epitopes at the adenoviral capsid, this strategy promoted the immunogenicity of the epitopes and resulted in more potent antitumor immune responses, tackling a crucial aspect of virotherapy that is often overlooked. In summary, the two different projects involved in this thesis addressed the main limitations of oncolytic adenoviruses from distinct points of view that may eventually be combined in order to maximize the opportunities of success of oncolytic adenoviruses in the clinics. / La viroteràpia del càncer amb adenovirus oncolítics es basa en l’habilitat d’aquests agents en replicar selectivament en cèl·lules tumorals, produint la seva mort sense afectar cèl·lules normals. Les principals limitacions d’aquesta teràpia són la dificultat dels adenovirus per arribar als tumors després de ser administrats sistèmicament i també la seva incapacitat per dispersar-se de manera homogènia dins dels tumors. En aquest treball s’ha generat un adenovirus oncolític que combina dues mutacions descrites amb anterioritat pel nostre grup. Per una banda, la substitució del motiu d’unió a heparan-sulfats glicosaminoglicans situat al domini shaft de la fibra pel motiu d’unió a integrines RGD (mutació RGDK) per tal de millorar la ratio de transducció tumor/fetge i d’augmentar la persistència en sang de l’adenovirus. Per altra banda, l’expressió de hialuronidasa amb l’objectiu de degradar l’àcid hialurònic de la matriu extracel·lular del tumor i millorar la dispersió intratumoral de l’adenovirus. Aquest nou virus, l’ICOVIR-17K, va mostrar una potent eficàcia antitumoral en models de ratolí i hàmster que va ser fins i tot incrementada mitjançant la combinació amb gemcitabina, tot mantenint el perfil de toxicitat dels adenovirus oncolítics parentals. Per altra banda, a més de matar directament les cèl·lules tumorals, els adenovirus oncolítics poden contribuir a la generació de respostes immunes contra el tumor. El tipus de mort cel·lular que generen és altament immunogènic i ajuda al reclutament de cèl·lules del sistema immune que generen respostes contra els antígens tumorals alliberats en aquest procés. Una de les principals limitacions de la immunoteràpia amb virus oncolítics és la resposta esbiaixada cap als antígens virals, que són immunodominants, en lloc de cap als antígens tumorals, que són poc immunogènics. Per tal d’afavorir la generació de respostes immunes antitumorals, en aquest treball s’han incorporat epítops tumorals en la proteïna E3-19K de l’adenovirus, que conté una seqüència senyal que la dirigeix directament al reticle endoplasmàtic, de manera que evadeix els passos previs de processament antigènic per la via del MHC de classe I, comunament afectada en cèl·lules tumorals. Aquesta estratègia va permetre la generació de respostes immunes antitumorals més potents que quan els mateixos epítops eren incorporats a la càpside de l’adenovirus, i a més, van ser traduïdes en una millor eficàcia antitumoral en un model murí de melanoma. En resum, en aquest treball s’han abordat les principals limitacions dels adenovirus oncolítics des de diferents punts de vista que, eventualment, poden ser combinats per tal d’aconseguir un millor candidat per ser testat exitosament a la clínica.

La ràpida propagació del virus de la immunodeficiència humana tipus 1 (VIH-1) ha estat acompanyada d’una continua i extensa diversificació genètica vírica. Se sap poc sobre com la diversificació viral està influenciant la capacitat replicativa (CR) viral al llarg del temps. L’objectiu d’aquesta tesi va ser investigar l’impacte de la diversificació del VIH-1 sobre la seva CR. Es van analitzar dos enzims vírics essencials, la proteasa (PR) i la integrasa (IN) del VIH-1, responsables de la maduració del virió emergent i de la persistència de l’ADN víric a la cèl·lula hoste respectivament. A més, es va investigar la robustesa mutacional de la PR del VIH-1, comparant la tolerància a mutacions aleatòries úniques d’una PR del VIH-1 generada artificialment in vitro amb la PR salvatge. Primerament, es va comparar la variabilitat genètica de cent trenta-nou PR, quaranta gag i quaranta-set IN del VIH-1 procedents d’aïllats clínics naïve primerencs amb cinquanta PR, quaranta-una gag i quaranta-set IN del VIH-1 procedents d’aïllats naïve tardans obtinguts 15 anys després. A continuació, trenta-tres seqüències de la PR del VIH-1 van ser amplificades a partir de tres grups de virus: dos grups de mostres naïve aïllades amb 15 anys de diferència i un tercer grup de mostres resistents a inhibidors de PR (IP). Les PR amplificades van ser recombinades amb un clon infecciós HXB2 i la seva CR va ser determinada en cèl·lules MT4. La CR també va ser mesurada en aquests tres grups després d’haver aplicat una mutagènesi aleatòria in vitro mitjançant una PCR propensa a errors. No es van observar diferències significatives en les CR dels diferents virus recombinants tant dels aïllats naïve primerencs com tardans (P=0.5729), tot i que les PR dels aïllats tardans tenien una conservació de seqüència significativament inferior a la dels aïllats primerencs (P<0.0001). Els virus recombinants mutats aleatòriament dels tres grups mostraren una CR significativament inferior als virus salvatges corresponents (P<0.0001). No hi havia una diferència significativa en la reducció de la infectivitat viral entre els virus portadors de les PR naïve mutades aleatòriament i les mostres aïllades primer o després (P=0.8035). Notablement, es va observar una pèrdua significativament més gran de la CR en el grup de les PR resistents a IP (P=0.0400). Aquests resultats demostren que la diversificació de la seqüència de la PR no ha afectat la CR del VIH-1 o la robustesa de la PR i indiquen que les PR portadores de substitucions de resistència a IP són menys robustes que les PR naïve. Posteriorment, es van amplificar quaranta-set seqüències de la IN del VIH-1 a partir de dos grups de virus provinents de pacients naïve aïllats amb 15 anys de diferència. Les IN amplificades van ser recombinades amb un clon infecciós pNL4-3 i la CR va ser determinada amb cèl·lules CEM-GFP, un sistema reporter de GFP determinat per tat. Es van observar diferències significatives en la CR tant dels virus recombinants dels aïllats primerencs com dels aïllats tardans (P=0.0286), tot i que les IN dels aïllats tardans tenien una conservació de seqüència significativament inferior respecte a una seqüència ancestral de subtipus B (P<0.0001). Aquests resultats suggereixen que la diversificació genètica de la IN al llarg del temps ha influenciat en alguns casos la CR viral ex vivo. Remarcablement, es va trobar que alguns polimorfismes S17N, I72V, S119P, i D256E estaven relacionats amb una reducció de la CR viral i el seu efecte additiu podria perjudicar la funció de la IN. Finalment, es va avaluar l’evolució artificial de la PR del VIH-1. Es va demostrar que la PR salvatge del VIH-1 és tant vulnerable a l’addició de mutacions úniques aleatòries com una PR artificial del VIH-1 generada in vitro. / The rapid spread of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) has been accompanied by continuous extensive viral genetic diversification. Little is known about how virus diversification is influencing the viral replication capacity (RC) over time. The aim of this study was to investigate the impact of HIV-1 diversification on HIV-1 RC. HIV-1 protease (PR) and integrase (IN), two essential viral enzymes that are responsible for the maturation of the budding virion and the persistence of the viral DNA in the host cell, respectively, were analysed. In addition, the mutational robustness of the HIV-1 PR was also investigated by comparing the tolerance to single random amino acid mutations of an artificial in vitro-generated HIV-1 PR with the wild-type PR. First, the genetic variability of hundred and thirty nine HIV-1 PR, forty HIV-1 gag and forty-seven HIV-1 IN sequences from early HIV-1 naïve isolates was compared with fifty HIV-1 PR, forty-one gag and forty-seven IN sequences from late naïve isolates obtained 15 years apart. Then, thirty-three HIV-1 PR sequences were amplified from three groups of virus: two naïve sample groups isolated 15 years apart plus a third group of PR inhibitor-(PI) resistant samples. The amplified PRs were recombined with an HXB2 infectious clone and RC was determined in MT-4 cells. RC was also measured in these three groups after random mutagenesis in vitro using error-prone PCR. No significant RC differences were observed between recombinant viruses from either early or late naïve isolates (P=0.5729), even though the PRs from the late isolates had significantly lower sequence conservation scores compared with a subtype B ancestral sequence (P<0.0001). Randomly mutated recombinant viruses from the three groups exhibited significantly lower RC values than the corresponding wild-type viruses (P<0.0001). There was no significant difference regarding viral infectivity reduction between viruses carrying randomly mutated naïve PRs from early or recent sample isolates (P=0.8035). Interestingly, a significantly greater loss of RC was observed in the PI-resistant PR group (P=0.0400). These results demonstrate that PR sequence diversification has not affected HIV-1 RC or PR robustness and indicate that PRs carrying PI resistance substitutions are less robust than naïve PRs. The third study of this thesis analysed the effect of the IN genetic diversification in the virus RC. Forty-seven HIV-1 IN sequences were amplified from two groups of virus from naïve patients isolated 15 years apart. The amplified IN were recombined with a pNL4-3 infectious clone and RC was determined in CEM-GFP cells, a tat driven GFP reporter system. Significant RC differences were observed between recombinant viruses from either early or late naïve isolates (P=0.0286), even though the IN from the late isolates had significantly lower sequence conservation scores compared with a subtype B ancestral sequence (P<0.0001). These results suggest that the IN genetic diversification over time has influenced in some cases the ex vivo viral RC Interestingly, some IN polymorphisms S17N, I72V, S119P, and D256E were found to be linked to a reduced viral RC and their additive effect might contribute to impair the IN function. Finally, the artificial evolution of the HIV-1 PR was evaluated. These results demonstrated that wild-type natural HIV-1 PR was as vulnerable to the addition of single random amino acid mutations as an artificial in vitro-generated HIV-1 PR.

Objetivos: Puesta a punto de la técnica de reducción del número de placas (PRA), para estudiar la sensibilidad in vitro al ganciclovir (GCV) y al foscarnet (FOS) de las cepas de herpesvirus humano tipo 5 (HHV-5) y al aciclovir (ACV) y al FOS de las cepas de herpesvirus humano tipo 3 (HHV-3). Puesta a punto de las técnicas de reducción del efecto citopático (REC) y de coloración vital (DUA), para estudiar la sensibilidad in vitro al ACV y al FOS de las cepas de herpesvirus humanos tipos 1 y 2 (HHV-1 y HHV-2). Análisis de los valores de sensibilidad a los antivíricos de las cepas de HHV-1, 2 y 5 y comparación con la evolución clínica de los pacientes tras el tratamiento. Material y métodos: Se ha estudiado la sensibilidad de 204 cepas de HHV-1 y 2 aisladas de diferentes muestras de 165 pacientes inmunodeprimidos. Los valores de sensibilidad al antivírico se expresan como dosis inhibitoria 50% (DI50) y se calculan mediante el método de Spearman-Kärber cuando la técnica utilizada es la de REC y estadísticamente, mediante una estimación lineal, cuando se utiliza la de DUA. Asimismo, se ha estudiado la sensibilidad de 80 cepas de HHV-5 aisladas de las muestras de 73 pacientes con o sin patología de base y de nueve cepas de HHV-3 aisladas de las muestras tomadas de lesiones cutáneas de nueve pacientes. Los valores de DI50 se calculan mediante el método de Reed-Muench modificado. Resultados: El 96% de las cepas de HHV-1 y 2 estudiadas fueron sensibles a valores de DI50 del ACV inferiores a 3 mg/ml y todas fueron sensibles a valores de DI50 del FOS inferiores a 200 mg/ml. El 98% de cepas de HHV-5 fueron sensibles a valores de DI50 de GCV inferiores a 12 mM e inferiores a 400 mM en el caso del FOS. Todas las cepas de HHV-3 fueron sensibles tanto al ACV como al FOS.Conclusiones: 1 - La técnica de REC es sencilla y útil para estudiar la sensibilidad de los HHV-1 y 2.2 - La técnica de REC presenta una reproducibilidad del 87%. 3 - La adición de colorante vital en la técnica de REC añade complejidad a la técnica. 4 - Los valores obtenidos con las técnicas de REC y de PRA correlacionan con la evolución clínica de los pacientes. 5 - La frecuencia de HHV-1 y 2 resistentes al ACV en pacientes inmunodeprimidos es baja (4%) y cuando se observa no es necesariamente indicativa de fallo terapéutico. 6 - La técnica de PRA para el estudio de la sensibilidad de los HHV-5 y 3 es sencilla y requiere entre seis y ocho semanas lo que limita parcialmente su utilidad clínica.7 - La frecuencia de cepas de HHV-5 resistentes in vitro al GCV (4%) y al FOS (4%) en pacientes no tratados previamente es baja. 8 - No se detectó ninguna cepa de HHV-3 resistente al ACV o al FOS. 9 - Nuestra experiencia confirma que no es necesaria la realización de estudios de sensibilidad de los herpesvirus de forma rutinaria. Estos estudios estarían indicados en las cepas aisladas de pacientes con alteraciones inmunológicas graves cuyas lesiones siguen evolucionando o empeoran estando en tratamiento con el antivírico. / Objectives: Standarize the plaque reduction assay (PRA), to study in vitro susceptibility to ganciclovir (GCV) and foscarnet (FOS) of human herpesvirus type 5 (HHV-5) strains and to aciclovir (ACV) and FOS of human herpesvirus type 3 (HHV-3) strains. Standarize the cytopathic effect reduction assay (CRA) and the dye-uptake assay (DUA), to study in vitro susceptibility to ACV and FOS of human herpesvirus types 1 and 2 (HHV-1 and HHV-2) strains. Analize the antiviral susceptibility values obtained with the HHV-1, 2 and 5 strains to compare with the clinical evolution of the patients after treatment. Material and methods: We studied the susceptibility of 204 HHV-1 y 2 strains isolated from different samples isolated from 165 immunosuppressed patients. Antiviral susceptibility values are expressed as the 50 per cent inhibitory dose (ID50). When the antiviral susceptibility was determined by CRA we used the Spearman-Kärber method to calculate the ID50 and with the DUA we determined this value, statistically, using a linear stimation. We studied the susceptibility of 80 HHV-5 strains isolated from the samples of 73 patients with o without underlying disease. Finally, we studied the susceptibility of nine HHV-3 strains isolated from the samples recovered from the skin lesions of nine patients. The ID50 values were determined using the Reed-Muench modified method. Results: Approximately 96% of HHV-1 and 2 strains were inhibited by ACV ID50 values lower than 3 mg/ml. All the strains were susceptible to FOS ID50 values lower than 200 mg/ml. Ninety eight per cent of HHV-5 strains were inhibited by GCV ID50 values lower than 12 mM and by FOS ID50 values lower than 400 mM. All the HHV-3 strains were susceptible to ACV and FOS.Conclusions: 1 - The CRA is easy to perform and can be used to study the susceptibility of HHV-1 and 2. 2 - The reproducibility of the CRA is about 87%. 3 - The addition of vital dye to the CRA adds complexity to this assay. 4 - The values obtained with CRA and PRA had a close correlation with the clinical outcome of patients. 5 - The frequency of HHV-1 and 2 resistant to ACV in immunosuppressed patients is low (4%) and when it's observed not necessarily indicates therapeutic failure. 6 - The PRA is easy to perform the study of susceptibility of HHV-5 and 3 and needs between six and eight weeks to obtain results limiting parcially its clinical utility. 7 - The frequency of HHV-5 strains in vitro resistant to GCV (4%) and to FOS (4%) is low in patients no treated previously. 8 - We didn't detect any HHV-3 strain resistant to ACV or to FOS. 9 - In our experience, there is no need to routinely test susceptibility of HHV-1 and 2 isolated to ACV. Study of HHV-1 and 2 susceptibility should be indicated only in viruses isolated from patients with a severe immunologic disturbance in whom lesions persist or worsen while on ACV therapy.

El contingut de la tesi radica fonamentalment en l’ús de models de membrana biològica per a l’estudi del comportament fisicoquímic de seqüències peptídiques derivades del GB-virus C (GBV-C). La concomitància d’aquest virus amb el virus causant del SIDA (HIV) ha demostrat disminuir notablement la virulència d’aquets darrer. És per això que és important conèixer el comportament de pèptids que són fragments de les proteïnes del GBV-C per a posteriori poder enfocar l’estudi de la inhibició de la capacitat infectiva del HIV per part del GBV-C. Es tracta d’un estudi bàsic però amb resultats que contribueixen al disseny de noves estructures peptídiques per a ser emprades com una nova estratègia per a enfocar el tractament de la SIDA. Finalment indicar que aquest tema s’engloba dins del camp de la nanotecnologia pel que fa a l’ús de liposomes en els distints estudis presentats. Els resultats obtinguts es presenten en les següents publicacions: 1. Alay, M.; Busquets, M.A., Haro, I.; Rojo, N.; Alsina, M.A.; Prat, J. Merocyanine 540 for spectroscopic analysis of the interaction of a peptide sequence of hepatitis G virus with liposomes. Luminescence, 17: 263-264 (2002). 2. Alay, M.; Prat, J.; Haro, I.; Rojo, N.; Alsina, M.A.; Busquets, M.A. Spectroscopic analysis of the interaction of a peptide sequence of Hepatitis G virus with bilayers. Talanta, 60: 269-277 (2003). 3. Alay, M.; Prat, J.; Alsina, M.A.; Busquets, M.A. Effect of merocyanine 540 on Langmuir-Blodgett films and liposomes of zwitterionic, anionic and cationic lipid composition. Journal de Physique IV. 113: 3 -6 (2004) 4. Alay, M.; Alsina, M.A.; Haro, I.; Prat, J.; Busquets, M.A. Analysis of the effect of a peptide sequence of the E2 protein (HGV/GBV-C) on the physicochemical properties of zwitterionic and negatively charged bilayers. Luminescence 20: 445-450 (2005) 5. Alay, M.; Alsina, M.A.; Haro, I.; Prat, J.; Busquets, M.A. Interaction of E2 (GBV-C/HGV)-derived peptides with liposomes: fluorescence anisotropy and fluorescence resonance energy transfer methods. Luminescence 21: 360 -361 (2006) 6. Alay, M.; Haro, I., Girona, V.; Prat, J.; Busquets, M.A. Interaction of two overlapped synthetic peptides from GB virus C with charged mono and bilayers. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces105: 7 -13 (2013)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T20:41:36Z : No. of bitstreams: 1 lara_vm_dr_botfmvz.pdf: 525605 bytes, checksum: 677d688fc01b9f020a8258be406beba7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho objetivou determinar a freqüência do vírus da imunodeficiência felina, correlacioná-la a dados epidemiológicos, identificar os diferentes sorotipos das amostras positivas e realizar a análise filogenética das mesmas. Para tanto, foram colhidas 519 amostras de sangue total de gatos domésticos oriundos de diferentes cidades do estado de São Paulo submetidas à técnica de PCR-nested para identificação do vírus. Dessas amostras, 81 (15,6%) apresentaram-se positivas ao teste, das quais 45 (55,5%) pertenciam a gatos com sinais clínicos de alguma enfermidade, sendo 21 fêmeas e 24 machos. Vinte e duas amostras (27,2%) foram provenientes de animais aparentemente normais, com duas fêmeas e 20 machos, e outras 14 (17,3%) a gatos sem histórico clínico definido, com três fêmeas e 11 machos. Foram submetidas ao seqüenciamento genético 50 (61,7%) amostras positivas. Entretanto, em somente 32 destas (64%) realizou-se a inferência filogenética. A análise genética foi baseada em um segmento do gene gag de 459 pb. As relações genealógicas foram realizadas através dos métodos da máxima parcimônia, da evolução mínima e de agrupamento de vizinhos. Os resultados obtidos revelaram uma ampla similaridade entre as três árvores construídas e em todas elas, as 32 amostras estudadas foram agrupadas dentro do mesmo sorotipo, que foi o sorotipo B. / The present work aimed to determine the feline immunodeficiency virus frequency, to correlate it to epidemiologic data, to identify different FIV subtypes of positive samples and also to accomplish its phylogenetic analysis. For that, it was collected 519 blood samples of domestic cats from different cities of the São Paulo state, submitting them by PCR-nested for virus identification. Eighty one samples (15.6%) were positive to the test, which 45 (55.5%) of them were from animals with clinical signs of some illness. Those samples, 21 were from female and 24 from male cats. Twenty-two of the positive samples (27.2%) were from healthy cats (2 females and 20 males), and 14 of them (17.3%) from cats without clinical history (3 females and 11 males). Fifty positive samples (61.7%) were submitted to DNA sequencing, but only in 32 of them the phylogenetic inference was done. The genetic analysis was based on a segment of the gag gene with 459pb. The genealogical relationships were established through maximum parcimony, minimum evolution and neighbor-joining methods. The results revealed a wide similarity among the three built trees and, in all of them, the 32 studied samples were allocated inside of the same subtype, that was the subtype B.