Subtilisin-like proteases form a large group of serine proteases with diverse functions, including the specific processing of a variety of proproteins and prohormones, and are found in prokaryotic and eukaryotic organisms. The work in this thesis focuses mainly on the Aral2 subtilisin-like protease following its discovery in the filtrate of Arabidopsis cell suspension cultures. Evidence obtained by Southern blotting and database searching is presented for the existence of a large gene family encoding subtilisin-like proteases in the model plant Arabidopsis thaliana. There may be more than fifty members in this gene family. Three of the corresponding DNA sequences have been cloned by RT-PCR and used as probes in Northern analysis to investigate the tissue specificity of the gene transcripts. These three genes appear to be expressed to varying degrees in Arabidopsis leaf, stem, root and silique tissues. A 650bp cDNA fragment encoding the C-terminal portion of the Aral2 protease has been obtained by RT-PCR, ligated to the malE gene and overexpressed as a fusion protein in E. coli cells. Polyclonal antisera have been raised against a combination of the fusion protein and the Aral2 C-terminal protein purified after cleavage from the fusion protein using Factor Xa protease. Aral2 protein has been detected in Arabidopsis tissues, particularly in siliques and stems, by Western blotting using these antibodies. An apoplastic location has been ascribed to Aral2 protease by immunocytochemistry using electron microscopy. The mature Aral2 subtilisin-like protease has been purified to homogeneity from Arabidopsis cell suspension culture filtrate by ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The purified enzyme has an acidic pH optimum of approximately pH5.5, which is unusual for a plant subtilisin-like protease. Aral2 protease is relatively thermostable and is activated in the presence of Ca(^2+) ions. The known serine protease inhibitors phenylmethanesulphonyl fluoride (PMSF), 4-(2- aminoethyl) benzenesulphonyl fluoride (AEBSF) and diisopropyl fluorophosphates (DFP) have an inhibitory effect on the proteolytic activity of Aral2. Substrate specificity studies have been performed using artificial peptide substrates, native proteins and cell wall protein extracts from Arabidopsis cells.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / Conyza bonariensis, popularly known as fleabane, is a major weed of soybean crop in Southern Brazil, due to its evolution as resistant to glyphosate herbicide, high adaptability to production systems and high production of viable seeds. The aim of this work was to investigate the resistance to glyphosate in Conyza bonariensis, from the evaluation of the current level of resistance, alternative herbicides, aspects of growth and development of the resistant biotype when compared to the susceptible to the herbicide, as well as to determine the mechanism of resistance involved. The study was divided in three chapters, with their experiments carried out from May 2012 to July 2013. An experiment of dose-response curve was conducted to determine the level of resistance presented by fleabane. Concurrently, a study evaluated alternative herbicides to glyphosate. During the autumn-winter and spring-summer, there were conducted two experiments of fitness with biotypes susceptible (S) and resistant (R) to glyphosate, where were determined growth variables and yield and quality of seeds. Also, there were developed studies related and not realted to to the target site of the herbicide (EPSPS enzyme), aiming to elucidate the mechanism of glyphosate resistance involved to C. bonariensis specie. The level of resistance observed for fleabane biotype was high, with resistance factor >50. Alternative herbicides to glyphosate were effective in controlling fleabane, proving the non-occurrence of multiple resistance. The R biotype showed higher fitness to the S from variables analyzed, highlighting as superior in the plant height development and dry matter accumulation, besides to conclude the biological cycle in a shorter time than the S biotype. R plants also showed higher quantity and better quality of seeds produced. Thus, the R biotype tends to suppress the S one, even in the absence of the herbicide spray, disseminating the resistance and becaming more difficult the control of fleabane. From the studies related to the mechanism of glyphosate resistance, it is possible to infer the C. bonariensis R biotype shows changes involving EPSPS enzyme, target site of glyphosate, implying in its insensitivity to the herbicide enzyme. Therefore, glyphosate is not anymore a tool in the management of C. bonariensis, being necessary the use of alternative herbicides associated with integrated weed management measures. / Conyza bonariensis, popularmente conhecida como buva, é a principal planta daninha da cultura da soja no Sul do Brasil, em decorrência de sua evolução como resistente ao herbicida glyphosate, alta adaptabilidade aos sistemas produtivos e elevada produção de sementes viáveis. O objetivo desse trabalho foi investigar a resistência ao glyphosate em Conyza bonariensis, a partir da avaliação do nível de resistência atual, herbicidas alternativos, aspectos do crescimento e desenvolvimento de biótipo resistente quando comparado ao suscetível ao herbicida, bem como determinar o mecanismo de resistência envolvido. O estudo foi dividido em três artigos sendo seus experimentos desenvolvidos no período de maio de 2012 a julho de 2013. Um experimento de curva-de-dose-resposta foi conduzido para determinar o nível de resistência apresentado pela buva. Concomitantemente, um estudo avaliou herbicidas alternativos ao glyphosate. Durante o outono-inverno e primavera-verão, desenvolveram-se dois experimentos de valor adaptativo para os biótipos suscetível (S) e resistente (R) ao glyphosate, onde foram mensuradas variáveis de crescimento e, produção e qualidade de sementes. Também foram desenvolvidos estudos relacionados e não relacionados ao local de ação do herbicida (enzima EPSPS), buscando-se elucidar o mecanismo de resistência ao glyphosate envolvido para a espécie C. bonariensis. O nível de resistência observado para o biótipo de buva foi elevado, com fator de resistência superior a 50. Herbicidas alternativos ao glyphosate foram eficazes no controle do biótipo de buva, comprovando a não ocorrência de resistência múltipla. O biótipo R apresentou valor adaptativo superior ao S a partir das variáveis analisadas, destacando-se como superior no desenvolvimento em estatura e acúmulo de massa seca, além de concluir o ciclo biológico em menor período que o biótipo S. Plantas R também apresentaram maior quantidade e melhor qualidade de sementes produzidas. Deste modo, o biótipo R tende a suprimir o S, mesmo na ausência da aplicação do herbicida, dissiminando a resistência e dificultando ainda mais o controle da buva. A partir dos estudos relacionados aos mecanismos de resistência ao glyphosate, pode-se inferir que o biótipo R da C. bonariensis apresenta alterações envolvendo a enzima EPSPS, alvo do glyphosate, implicando em sua insensibilidade ao herbicida. Portanto, o glyphosate deixa de ser uma ferramenta no manejo da C. bonariensis, sendo necessária a utilização de herbicidas alternativos associado a medidas de controle integrado de plantas daninhas.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 odicicleia alves.pdf: 1110797 bytes, checksum: db2d3a6fa7a73017ba6ce2662168434c (MD5) Previous issue date: 2009-05-01 / The allelopathy can be an alternative method to the control of weed plants. The use of cover crops straw as a mechanical barrier, or its chemical compounds resulted of staw decomposition, can inhibit the germination and growth of some weed plants. The objectives of this work were to evaluate the mechanical, allelopathyc and allelopathyc metabolite of straw decomposition effects on seeds germination of hairy beggarticks (Bidens pilosa L.), red morningglory (Ipomoea coccinea L.), goosegrass (Eleusine indica L.), milkweed (Euphorbia heterophylla L.) and bur grass (Cenchrus echinatus L.) weed plants. It were evaluated also the aquous straw effects on the germination of seeds of these weed plants and lettuce seeds, and to quantify the most important chemical metabolites in these aquous straw extracts, and the presence of phenols and flavonoids in the extracts stored during four weeks (0, 7, 14, 21 e 28 days). To obtair dormency supression and the best results in the germinations of the seeds of beggarticks (Bidens pilosa L.), red morningglory (Ipomea coccinea L.) and bur grass (Cenchrus echinatus L.), the seeds of the weed plants where immersed hot water (70 ºC) and in KNO3 solution (0,02%). Bur grass seeds were also exposed to 10 ºC for different periods. In conclusion, the crotalaria and braquiaria straws had both mechanical and allelopathyc effects on the seed germination and emergengy for the weed plants tested. When it had been observed the inhibition of the crotalaria and braquiaria aquous straws extracts on the radicular and aereal seedlings growth of red morningglory, milkweed and lettuce its effects were more pronounced at the higher used concentration. Phenols and flavonoids were found in the crotalaria and brachiaria aquous straw extracts, however its contents showed a reduction along the storing period. About the supression dormency methods utilized, It Was not observed supression dormency in all tested methods, wether some get affected the germination of the seed. / A alelopatia pode constituir-se um modo alternativo para o controle de plantas daninhas. A utilização de palhadas de plantas de cobertura de solo como barreira mecânica, ou os produtos resultantes da sua decomposição, podem impedir a germinação e o desenvolvimento de algumas espécies de plantas daninhas. Este trabalho objetivou avaliar o efeito físico de palhadas de crotalária (Crotalaria juncea L.) e braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.) sobre a germinação de sementes de picão (Bidens pilosa), corda de viola (Ipomoea coccinea L.), pé de galinha (Eleusine indica L.), leiteiro (Euphorbia heterophylla L.) e timbete (Cenchrus echinatus L.), assim como seu possível efeito alelopático oriundo da decomposição destas palhadas ao longo do tempo. Objetivou também avaliar o efeito dos extratos aquosos obtidos destas palhadas sobre a germinação das sementes destas plantas daninhas e de alface. Também, foram analisados os principais metabólitos encontrados nos extratos aquosos obtidos das duas palhadas, assim como aos teores de fenóis e flavonóides ao longo de quatro semanas de armazenamento dos extratos (0, 7, 14, 21 e 28 dias). Para obter-se a quebra de dormência e melhores resultados na germinação das sementes de picão, corda de viola e timbete, as sementes destas plantas daninhas foram submetidas a métodos de escarificação como imersão em água aquecida a 70 ºC e em solução de nitrato de potássio a 0,2%. As sementes de timbete foram ainda submetidas ao frio, numa tempertura de 10 ºC por diferentes períodos. Concluiu-se que as palhadas de crotalária e de braquiária exercem um efeito físico e também alelopático sobre a germinação e a emergência de sementes das espécies de plantas daninhas testadas. Quando ocorreu inibição do crescimento da radícula e da parte aérea de plântulas de corda de viola, leiteiro e alface provocada pelos extratos aquosos de crotalária e braquiária, estes foram mais efetivos quanto maior foi a concentração utilizada. Fenóis e flavonóides estão presentes nos extratos de crotalária e braquiária, sendo que seus teores são reduzidos a partir de duas semanas de armazenamento. Quanto aos métodos de escarificação utilizados, somente alguns tratamentos quebraram a dormência de determinadas espécies de plantas daninhas, enquanto outros não afetaram a germinação das mesmas.