K. Babiarová Ph.D. Thesis ABSTRACT Cancer immunotherapy is concerned generally with the activation of cancer immunity specific for tumor antigens (TA) produced by cancer cells. My PhD thesis focused on the development of different types of cancer vaccines expressing various TA and predominantly on the determination of the efficacy of these vaccines. For studying TA-specific cancer cellular immunity in mice immunized with these vaccines, I used mainly the ELISPOT-IFNγ assay. First, DNA, recombinant vaccinia virus (rVACV) and peptide vaccines against WT1 positive tumors were prepared. They consist of a fragment of WT1 protein with motifs predicted to bind to Db murine MHC class I. The administration of peptide vaccines by tattoo delivery in combination with unmethylated CpG motifs and anti-TGFβ monoclonal antibody was the most effective. Next, I was interested in the immunotherapy of chronic myeloid leukemia (CML). Hruskova et al. prepared the mouse polyomavirus-like particles (MPyV-VLP) carrying the junction region of BCR-ABL fusion protein (1). In our laboratory, there were constructed the other types of CML vaccines with the expression of the junction region of BCR-ABL fusion protein, such as DNA or rVACV, too. Prepared vaccines failed to induce effective cancer immune response. It seems that BCR-ABL...

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20256号 / 医博第4215号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 三森 経世, 教授 前川 平 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第23815号 / 医科博第136号 / 新制||医科||9(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 山下 潤, 教授 遊佐 宏介, 教授 伊藤 貴浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Die chronisch ischämische Herzkrankheit und der Myokardinfarkt (MI) sind die häufigsten Gründe für schwere Krankheit und vorzeitigen Tod in den entwickelten Ländern. Langfristig kommt es als Folge des Infarktes zur Kollateralgefäßbildung und zur Entwicklung einer kompensatorischen Herzhypertrophie. Eine Vielzahl von adaptativen Veränderungen in diesem Prozess konnte identifiziert werden. Wir konnten zeigen, dass in der akuten Phase nach MI Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit des Myokards erhöht waren. Die Expression der Hitzeschockproteine (HSP) 25 und 72 war verstärkt und korrelierte mit der Relaxationsgeschwindigkeit. In der chronischen Phase nach MI entwickelte sich eine signifikante Herzhypertrophie, die mit verminderter Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit einherging. Für die verlangsamte Relaxation war die verminderte Aktivität der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums (SERCA) als entscheidender Faktor anzusehen. Bei transgener Überexpression von Renin / Angiotensinogen ist die Relaxationsgeschwindigkeit des Myokards war wie auch nach MI durch geringere SERCA- Protein Expression vermindert. Die Empfindlichkeit der kontraktilen Funktion gegenüber Sauerstoffmangel und Reoxygenierung war nach MI gegenüber dem Kontrollmyokard geringer. Dafür konnten die verstärkte Expression der antioxidativ wirksamen HSPs und die erhöhte Aktivität der Glutathionperoxidase und der Superoxiddismutase, eine Verschiebung des Kreatinkinase (CK)- Isoenzymmusters und eine verminderte SERCA- Aktivität verantwortlich gemacht werden. Die Repolarisation der Aktionspotentiale der Kardiomyozyten war nach MI gegenüber den Kontrolltieren signifikant verlangsamt. Bereits eine 10-fach geringere artifizielle Dehnung des Gewebes führte nach MI im Vergleich zu Kontrolltieren zum Auftreten von Nachdepolarisationen und Extra-Aktionspotentialen. Ausschließlich in MI ließ sich durch die artifizielle Dehnung Vorhofflimmern auslösen, d.h. nach Myokardinfarkt war der mechano- elektrische Feedback Mechanismus empfindlicher. Die dehnungsinduzierten Veränderungen konnten durch Gadolinium unterdrückt werden, was auf eine Beteiligung von dehnungsaktivierten Ionenkanälen an den beobachteten Phänomenen schließen ließ. Auch kardiale Fibroblasten zeigten nach MI signifikante Änderungen ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften, was zur Arrhythmieentstehung beitragen kann. Mittels molekularer Analysen konnten wir zeigen, dass der unter Sauerstoffmangel stabilisierte Transkriptionsfaktor Hif-1alpha in der Lage ist, den Promoter des Wilms' Tumor Suppressor Gens 1 (WT1) direkt transkriptionell zu aktivieren. Das führte zu verstärkter Expression von WT1 in den Herzen nach Myokardinfarkt, und zu verstärkter Expression von WT1 in Herz und Niere bei systemischer normobarer Hypoxie. Die WT1 Expression im Herzen nach MI ließ sich in den Koronargefäßen lokalisieren. Koexpression mit Proliferations- und Vaskulogenesemarkern ließ vermuten, dass WT1 nach MI eine wichtige Rolle für die Neovaskulogenese spielt. Die gewonnenen Ergebnisse tragen zum Verständnis der pathophysiologischen Veränderungen bei kardialer Hypertrophie nach Myokardinfarkt bei und eröffnen möglicherweise langfristig neue therapeutische Ansätze. / Chronic ischemic heart disease and myocardial infarction are the most common causes for morbidity and mortality in industrialized countries. A survived myocardial infarction (MI) results in a long run in collateral formation and the development of cardiac hypertrophy. A variety of adaptive responses in this process had been identified. We could show that in the acute phase after Mi in rats, contraction- and relaxation rates of the myocardium are increased. The higher relaxation rate correlates to an increased expression of heat shock proteins. In the chronic phase after MI, with the development of cardiac hypertrophy, contraction and relaxation rates decrease. The decrease in the relaxation rate could be attributed to a reduced activity of the Ca- ATPase of the sarcoplasmic reticulum (SERCA2). Transgenic overexpression of renin / angiotensinogen also resulted in a reduced SERCA2 expression and, consequently, lower relaxation rate. The susceptibility of contractile function to hypoxia - reoxygenation was reduced after MI compared to sham operated control animals. The lower susceptibility to hypoxia - reoxygenation could be attributed to an increased expression of heat shock proteins, higher activities of the antioxidant enzymes glutathionperoxidase and superoxiddismutase, shifts in the isoenzyme distribution of the creatine kinase, and a reduced SERCA2 activity. Repolarization of cardiomyocyte action potentials was found to be delayed after MI. A 10-fold lower artificial stretch of the tissue after MI than after sham operation caused afterdepolarizations and extra action potentials. Higher artificial stretch caused atrial fibrillation only after MI suggesting an intensified mechano-electrical feedback mechanism after MI. Stretch- induced electrical abnormalities could be suppressed by gadolinium suggesting the involvement of stretch-activated ion channels in the electrical abnormalities. Also electrophysiological properties of cardiac fibroblasts were significantly altered after MI, which may contribute to the increased risk for arrhythmia after infarction. Furthermore, we could show that the Hif-1alpha transcription factor, which is stabilized under hypoxic conditions is capable to directly activate the Wilms'' tumor suppressor 1 (WT1) transcriptionally. This leads to an increased expression of WT1 in the heart after MI and in heart and kidneys after systemic hypoxia. After MI, WT1 is expressed mainly in coronary vessels. Co-expression of WT1 with markers of proliferation and vasculogenesis suggests a role of WT1 in neovasculogenesis. These findings contribute to our understanding of pathophysiological alterations in the development of cardiac hypertrophy after MI and may contribute to the development of new therapeutic approaches.

61 Summary Wilms' tumor gene 1 (WT1) is highly expressed in acute leukemia and other hematological malignancies. It has been therefore suggested as a potential universal marker of minimal residual disease (MRD), particularly in patients with acute myeloid leukemia (AML). Due to controversial results of some of the studies, the role of WT1 in MRD follow-up and WT1 prognostic significance remain unclear. WT1 protein is produced in more than 36 different isoforms. These variants have distinct, partially overlapping functions and their ratio is supposed to influence the final effect of WT1. However, despite the increasing number of studies, the clinical impact of WT1 and its isoforms in acute leukemia have not yet been elucidated. We established a unique qPCR method to assess the expression pattern of the main 4 WT1 isoforms. Using this method, we determined the ratio of WT1 variants in the samples of patients with AML, myelodysplastic syndrome (MDS) and healthy controls. Our data showed that this pattern can distinguish among particular hematological malignancies, but lacks a prognostic significance. Within our international study group we determined the prognostic significance of total WT1 expression in childhood AML. Based on our results of a large cohort of patients we can conclude that WT1 expression at...

Testicular germinal tumors (TGCT) are relatively rare solid tumors in adults. Even so, they affect more than 700 men a year in the Czech Republic, mostly young patients aged 18- 45 years. A large number of patients are curable by a combination of surgery and chemotherapy, yet about 50 men a year in the Czech Republic succumb to this tumor, in the vast majority of cases due to the development of resistance to chemotherapy containing cisplatin. The rare occurrence and high curability are probably the cause of infrequent molecular and clinical studies carried out in these tumors, and our understanding of the biological processes leading to primary tumor development and the development of cisplatin resistance (CDDP) is still limited. At present, no specific molecular markers that could be used as prognostic or predictive factors and improve patient stratification or treatment tailoring are available in TGCT management. In this work, we studied the molecular-genetic background of TGCT development and CDDP resistance at several levels. To comprehensively study the development of cisplatin resistance, we prepared and analyzed CDDP-exposed TGCT cell lines. Long-term exposure to CDDP increased resistance 10-fold in the NCCIT cell line, while no significant resistance was achieved with Tera-2. The...

Im Rahmen dieser Dissertation wurde retrospektiv die Minimale Resterkrankung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und Myelodysplastischen Syndrom nach allogener Stammzelltransplantation mit minimaler Konditionierung untersucht. Hierfür wurden vier unterschiedliche Methoden zur Detektion der Minimalen Resterkrankung analysiert. Nach Etablierung einer quantitativen Real-Time PCR für das Wilms Tumor Gen 1 (WT1) im peripheren Blut wurden diese Ergebnisse mit bereits routinemäßig erhobenen Daten des Chimärismus im Gesamtknochenmark und in CD34+ Zellen sowie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) krankheitsspezifischer chromosomaler Aberrationen von insgesamt 88 Patienten verglichen und statistisch ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die Genexpressionanalysen des WT1 sowie die Chimärismusanalysen ein Rezidiv im Gegensatz zu den FISH Analysen vier Wochen im Voraus detektieren können. In Reiceiver Operating Curve Analysen wurden eine WT1 Expression von > 24 WT1/10.000 ABL1 Kopien und der Abfall des CD34+ Spenderchimärismus von ≥ 5% als diagnostisch stärkste Methoden identifiziert. In uni- und multivariaten Analysen von insgesamt 20 Parametern wurden die beiden Methoden als unabhängige Variablen für ein frühes Rezidiv, progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben bestätigt. Kombiniert man beide Methoden, so kann bei jeweiligem negativen Testergebnis ein Rezidiv innerhalb der nächsten vier Wochen nahezu ausgeschlossen werden.

El mal pronòstic en una neoplàsia epitelial està associada a l'adquisició de característiques mòbils o invasives per part de les cèl·lules canceroses. Aquesta transformació morfològica es denomina transició epiteli-mesènquima (TEM). Snail és un factor de transcripció implicat en aquest procés, responsable de reprimir l'expressió de l'E-cadherina. Aquest treball demostra que Snail té la capacitat de reprimir l'expressió de MUC1 i VDR a través de la seva unió directa a caixes de reconeixement situades en els diferents promotors proximals. A més, la sobreexpressió d'Snail en diverses línies cel·lulars provoca un augment dels nivells d'ARNm de ZEB1 i un increment de l'activitat del seu promotor. L'activitat del promotor mínim d'Snail i els seus nivells d'ARNm depenen de la senyalització d'ERK. Finalment, hem demostrat que Snail i WT1, un regulador positiu de l'expressió de l'E-cadherina, competeixen per unir-se al promotor de l'E-cadherina i regular la seva transcripció. / The poor prognosis in epithelial neoplasia is associated with the acquisition of motile or invasive properties by the cancerous cells. This morphological transformation is often referred to as epithelial to mesenchymal transition (EMT). The Snail transcription factor is involved in this process by repressing the expression of E-cadherin. In this study we demonstrate the capacity of Snail to repress both MUC1 and VDR transcription by direct binding to specific sequences within their proximal promoter. Moreover, Snail overexpression in several cell lines induces ZEB1 mRNA and increases its promoter activity. The activity of the Snail minimal promoter is dependent on the ERK signaling pathway. Finally, we have demonstrated that Snail and WT1, a positive regulator of E-cadherin expression, compete for the binding to the E-cadherin promoter in order to regulate its transcription.

Final publication is available at http://www.bloodjournal.org/ / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19614号 / 医博第4121号 / 新制||医||1015(附属図書館) / 32650 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙折 晃史, 教授 山田 亮, 教授 三森 経世 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM