La télomérase, enzyme qui permet le maintien de la longueur des télomères est activée dans la majorité des cellules cancéreuses. Du fait de son rôle dans l’immortalité cellulaire, elle a été proposée comme cible de nouvelles stratégies anticancéreuses; il est donc fondamental d’identifier les mécanismes de sa régulation. Des travaux récents du laboratoire ont démontré, en utilisant une lignée de leucémie aiguë promyélocytaire résistante à la différenciation par les rétinoïdes (NB4-LR1), que l’acide rétinoïque tout trans (ATRA) induit une répression transcriptionnelle de hTERT, sous-unité catalytique de la télomérase, indépendamment de la différenciation. Cette répression est également associée à la mort des clones résistants. Il a également été montré lors du traitement par l’ATRA de cellules résistantes à cette répression, NB4-LR1SFD, qu’il existait une hyperméthylation de la région distale du promoteur de hTERT associée à la persistance de sa transcription et à la prolifération cellulaire. Ceci nous a conduit à proposer un modèle de régulation de hTERT dans lequel l'induction de modifications épigénétiques de la région distale de son promoteur empêcherait la fixation d'éventuels répresseurs. Des résultats récents suggèrent que WT1, facteur connu pour contribuer à la répression de hTERT, pourrait être un de ces facteurs. WT1 code pour un facteur de transcription à doigt de zinc et a été décrit pour la première fois comme délété dans les tumeurs de Wilms (tumeurs rénales de l’enfant). Cependant le rôle de WT1 dans développement tumoral varie en fonction des modèles cellulaires ; il peut avoir un rôle d’oncogène ou au contraire agir comme un gène suppresseur de tumeur. Dans le but d’élucider les mécanismes de régulation de la télomérase, nous avons donc voulu étudier le rôle de WT1 dans la répression de hTERT. Pour ce travail, nous avons utilisé deux modèles cellulaires :• La Leucémie aigue promyélocytaire (LAP) : leucémie aigue myéloblastique caractérisée par un transcrit de fusion impliquant le récepteur aux rétinoïdes.• Le neuroblastome : tumeur solide extra crânienne la plus fréquente chez l’enfant. Cette maladie est très hétérogène aussi bien au niveau biologique que clinique ; en effet certaines formes peuvent régresser spontanément alors que d’autres, très agressives, sont résistantes à toutes les thérapeutiques actuelles. Cette hétérogénéité clinique est notamment liée à la différenciation de la tumeur et également à la présence ou non de l’amplification de l’oncogène N-Myc qui a un rôle pronostic majeur dans cette maladie. Les voies de signalisations impliquées dans le fort pouvoir tumorigène des neuroblastomes ne sont pas encore clairement identifiées.Nous avons pu montrer dans ces modèles que WT1 réprime hTERT et que cette répression semble fonction de l'état de méthylation de la région distale du promoteur de hTERTLa 2ème partie de mon travail a été d’étudier le rôle de WT1 dans les neuroblastomes. Les résultats de nos travaux montrent que WT1 est plus exprimé dans les tumeurs sans amplification de N-Myc et dont la différenciation est stromale. Cependant la surexpression de WT1 dans des tumeurs sans amplification de N-Myc semble associée à un moins bon pronostic. L’étude de l’expression de WT1 pourrait constituer un outil pronostic intéressant dans ces tumeurs. / Telomerase is expressed and active in most immortalized cells. Whereas telomerase becomes activated during neoplastic transformation, its activity decreases during differentiation of various immortal cells in response to pharmacological agents, including retinoids. We showed using both an Acute Promyelocytic Leukemia (APL) cellular model (NB4 cell model) and Neuroblastoma cells that all-trans-retinoic acid (ATRA) induced a transcriptional repression of the catalytic subunit of telomerase, hTERT, associated with differentiation. This repression also occurred independently of differentiation, as demonstrated during long term treatment of ATRA-induced maturation resistant NB4-LR1, leading to telomere shortening, growth arrest and cell death. Changes in chromatin environment of hTERT promoter and binding of transcriptional factors have been demonstrated in differentiating cells when hTERT is repressed. However, it is not clear whether these changes are directly involved in hTERT repression or only linked to differentiation. A variant cell line was isolated from NB4-LR1 cells, (NB4-LR1SFD), which bypassed the death step because of a re-activated telomerase and resisted to hTERT repression despite the continuous presence of ATRA. Using both NB4-LR1 and NB4-LR1SFD cells, it was shown that the mechanisms of ATRA-induced hTERT repression involved: 1) a switch from c-myc to mad1 binding at the proximal domain of hTERT promoter, 2) epigenetic modifications of the distal domain of hTERT promoter (-600 -250 nucleotides). Indeed, the persistence of hTERT transcription was associated with an hypermethylation of the distal domain in ATRA-treated NB4-LR1SFD. Interestingly, the binding of a known hTERT repressor, WT1, to this distal domain, was defective in NB4-LR1SFD. The first part of my thesis was to investigate the role in hTERT transcriptionnal regulation of both c-myc and WT1, two transcription factors, which bind to the proximal and the distal region of hTERT promoter, respectively. The second part was to determine the role of WT1 in neuroblastoma. Neuroblastoma is the most common extra cranial solid tumor in childhood and the most frequently diagnosed neoplasm during the infancy. A striking feature of this tumor is its clinical heterogeneity. Among tumor progression markers delineated so far, MYCN amplification occurs in about 25% of total neuroblastoma cases and this percentage increases at 30% in advanced stage NEUROBLASTOMA. Despite the fact that MYCN amplification is strongly correlated with neuroblastoma of poor outcome, MYCN status cannot predict all cases of poor survival in neuroblastoma. In addition, neuroblastoma without MYCN amplification (about 70-80% of neuroblastoma) are far to display favorable behavior. WT1 was initially identified as a tumor suppressor gene involved in the development of a pediatric renal tumor (Wilm’s tumor). Here, we describe an inverse correlation between WT1 expression and MYCN amplification and expression. However and most notably, our results show that WT1 gene expression is associated with a poor outcome for patients showing non-MYCN-amplified tumors. Thus WT1 expression may be a prognostic marker for a better risk-stratification and for an optimized therapeutic management of neuroblastoma.

Die „donor lymphocyte infusion“ (DLI) stellt eine wirksame Therapieoption für ein Rezidiv bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) dar. Jedoch ist die DLI oft mit einer „graft-versus-host disease” (GvHD) assoziiert, die auf einer proinflammatorischen, gegen den Empfänger gerichteten T-Zell-vermittelten Immunantwort beruht. Eine Strategie, den „graft-versus-leukemia” (GvL)-Effekt zu steigern und dabei das Risiko einer GvHD zu mindern, besteht in dem adoptiven Transfer hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche selektiv AML-assoziierte Antigene erkennen. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, eine neue Strategie zur Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche die Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) Wilms‘-Tumor-Antigen 1 (WT1), Proteinase 3 (PR3), Nucleophosmin 1 (NPM1) und Survivin als attraktive Ziele für spezifische Immuntherapien erkennen, zu entwickeln. Zunächst wurden mithilfe der innovativen Streptamer-Technologie die Frequenzen von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen WT1, PR3, NPM1 und Survivin im peripheren Blut von 10 gesunden HLA-A*02:01+ Spendern analysiert. Auf diese Weise konnten jedoch nur sehr geringe bis keine detektierbaren Frequenzen LAA-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten zu dem Schluss, dass AML-Peptid-spezifische CD8+ T-Zellen im Gegensatz zu Virus-spezifischen T-Zellen aufgrund deutlich geringerer Frequenzen nicht direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden können. Daher erfolgte die in vitro-Expansion der CD8+ T-Zellen mithilfe von autologen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs). DCs sind als professionelle Antigen-präsentierende Zellen in der Lage, Effektorzellen des adaptiven Immunsystems zu stimulieren sowie deren Expansion zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Protokoll für die Generierung von Fast-MoDCs etabliert. Diese zeichneten sich durch die ausgeprägte Expression kostimulatorischer und Antigen-präsentierender Moleküle, die Sekretion großer Mengen des proinflammatorischen Zytokins IL-12 sowie ein effizientes stimulatorisches Potenzial gegenüber CD4+ T-Zellen aus. Erneute Frequenzanalysen nach zweimaliger in vitro-Stimulation mit Peptid-beladenen Fast-MoDCs mittels ELISpot ergaben einen Anstieg der Frequenzen AML-Peptid-spezifischer CD8+ T-Zellen, insbesondere von WT1126-spezifischen CD8+ T-Zellen. Daraufhin erfolgte die Anreicherung der stimulierten CD8+ T-Zellen mit Spezifität für die vier untersuchten LAAs WT1, PR3, NPM1 und Survivin mittels Streptamer-Technologie. Dabei erzielte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten deutlich höhere Reinheiten als die von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen die Peptide PR1169, NPM1283,mut A/D und Survivin95. Aus diesem Grund wurden die weiteren Untersuchungen auf WT1126 als das bisher vielversprechendste der untersuchten Peptide begrenzt. CD8+ T-Zellen von drei gesunden Spendern wurden mit bestrahlten T2-Zellen und Fast-MoDCs, welche mit dem HLA-A*02:01-restringierten Peptid WT1126 beladen waren, stimuliert. Anschließend erfolgte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen mittels Streptamer-Technologie. Bereits nach einmaliger Stimulation kam es zu einer deutlichen Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen, welche effektiv in der Lage waren, Peptid-beladene Zielzellen zu lysieren. Jedoch konnte nach zweimaliger Stimulation nochmals eine deutliche Steigerung in Reinheit und Ausbeute erzielt werden. Die angereicherten Zellen wurden als Effektor-Gedächtnis-T-Zellen charakterisiert. Ausgehend von den Streptamer-isolierten CD8+ T-Zellen eines Spenders erfolgte die Generierung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zell-Klone. Im Rahmen der Klonierung wurden 32 WT1126-spezifische CD8+ T-Zell-Klone generiert. Drei vielversprechende Klone wurden genauer hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Diese exprimierten hoch-avide T-Zell-Rezeptoren und zeigten einen heterogenen Phänotyp von zentralen Gedächtnis-T-Zellen hin zu terminal differenzierten Effektor-Gedächtnis-T-Zellen. Zudem führten sie zu einer effizienten Lyse der HLA-A*02:01+ und WT1+ Zelllinien T2 und SET-2. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die untersuchten Klone auch HLA-A*02:01- und WT1-exprimierende primäre Blasten von AML-Patienten effektiv lysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Streptamer-basierte Anreicherung stimulierter Tumorpeptid-spezifischer CD8+ T-Zellen vor anschließender Klonierung eine geeignete Strategie für die Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone mit anti-tumoraler Aktivität darstellt. So generierte CD8+ T-Zell-Klone mit Reaktivität gegen AML-assoziierte Antigene können für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien zur Therapie eines Rezidivs bei AML-Patienten nach allogener SZT verwendet werden.

Les surrénales sont des glandes endocrines permettant la réponse au stress de l’organisme. Alors que la medulla produit des catécholamines, la corticosurrénale sécrète des minéralocorticoïdes au niveau de la zone glomérulée, et des glucocorticoïdes grâce aux cellules de la zone fasciculée. Ces hormones sont notamment impliquées dans l’homéostasie hydrominérale, la réponse immunitaire et la maturation pulmonaire au cours de la vie fœtale. Les insuffisances surrénaliennes peuvent donc être très délétère en absence de traitement. Pour maintenir l’intégrité tissulaire au cours de la vie et pour mieux répondre aux variations des besoins de l’organisme, le cortex surrénalien est en renouvellement cellulaire constant. Des expériences de lignage ont mis en évidence que ce renouvellement repose sur le recrutement de cellules progénitrices capsulaires et situées dans la partie externe du cortex. Lorsqu’ils sont mobilisés, ces progéniteurs se différencient en cellules de la zone glomérulée, qui vont alors migrer de façon centripète le long du cortex et se différencier en cellules de la zone fasciculée après une conversion de lignage, au cours de leur migration. Cette conversion de lignage est orchestrée via un équilibre entre l’activation des voies Wnt/β-caténine, imposant une identité glomérulée, et PKA, permettant une différenciation fasciculée. Les facteurs épigénétiques jouent de nombreux rôles essentiels, du développement embryonnaire jusqu’à la tumorigenèse, en passant par l’homéostasie des tissus. Nous avons montré que la méthyltransférase EZH2 était le facteur épigénétique le plus surexprimé dans les carcinomes corticosurrénaliens et que cette surexpression était associée à l’agressivité de ces cancers. EZH2 est la sous-unité catalytique du complexe multi-protéique PRC2 qui permet, entre autres, la répression de la transcription de ses gènes cibles en posant la marque H3K27me3. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les potentiels rôles physiologiques de EZH2 dans la surrénale, qui n’avaient jusque là, jamais été recherchés.En développant un modèle murin d’invalidation génétique de Ezh2 dans le cortex surrénalien, dès l’émergence de l’ébauche surrénalienne au cours du développement embryonnaire, nous avons pu mettre en évidence une hypoplasie corticosurrénalienne, résultant d’une forte atrophie de la zone fasciculée, et associé à une insuffisance primaire en glucocorticoïdes. Nos analyses nous ont permis de démontrer le rôle original et inattendu de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA, en réprimant l’expression d’inhibiteurs de cette voie comme les phosphodiestérases (PDE) et la sous-unité régulatrice Prkar1b. EZH2 régule ainsi la zonation fonctionnelle du cortex surrénalien via son activité histone méthyltransférase. A l’inverse, on n’observe pas d’altération marquée de la voie Wnt/β-caténine, suggérant que Ezh2 n’est pas essentiel au contrôle de cette voie dans la surrénale. Nous avons également pu mettre en évidence une dédifférenciation de cellules corticales qui retrouvent, suite à la perte de Ezh2, une identité progénitrice en exprimant des marqueurs adréno-gonadique tels que Gata4 et Wt1. Cette dédifférenciation est un phénomène naturel que l’on retrouve avec le vieillissement et qui pourrait être associée avec la diminution progressive de l’expression de Ezh2 dans les cellules stéroïdogènes. L’ensemble de ces résultats, met en évidence une nouvelle fonction de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA et de l’homéostasie de la glande surrénale. / Adrenals are endocrine glands allowing the stress response of the organism. While the medulla produces catecholamines, the adrenal cortex secretes mineralocorticoids in the glomerular zone, and glucocorticoids through cells in the fasciculated zone. These hormones are notably involved in hydromineral homeostasis, the immune response and pulmonary maturation during fetal life. Adrenal insufficiency can therefore be very deleterious in the absence of treatment. To maintain tissue integrity over the course of life and to better respond to the changing needs of the body, the adrenal cortex is in constant cell renewal. Lineage experiments have shown that this renewal is based on the recruitment of capsular progenitor cells and progenitors located in the outer part of the cortex. When mobilized, these progenitors differentiate into cells of the glomerular zone, which then migrate centripetally along the cortex and differentiate into cells of the fasciculated zone after lineage conversion, during their migration. This lineage conversion is orchestrated via a balance between the activation of the Wnt/β-catenin pathway, imposing a glomerular identity, and PKA pathway, allowing fasciculated differentiation. Epigenetic factors play many important roles, from embryonic development to tumorigenesis, passing by tissue homeostasis. We have shown that methyltransferase EZH2 is the most overexpressed epigenetic factor in adrenocortical carcinomas and this overexpression is associated with cancer agressivity. EZH2 is the catalytic subunit of the multiprotein complex PRC2 that allow, among others things, the repression of the transcription of its target genes by posing the mark H3K27me3. The aim of my thesis was to indentify the putative physiological roles of EZH2 in the adrenal, never investigated yet.By developing a murine model of genetic invalidation of Ezh2 in the adrenal cortex, from the emergence of the adrenal anlagen during embryonic development, we have been able to demonstrate adrenocortical hypoplasia, resulting from a strong atrophy of the zona fasciculata, and associated with primary glucocorticoid insufficiency. Our analyses allowed us to demonstate the original and unexpected role of EZH2 in the controle of the PKA pathway, by repressing expression of this pathway inhibitors such as phosphodiesterases (PDE) and regulatory subunit Prkar1b. EZH2 thus regulate functionel zonation of adrenal cortex via its histone methyltransferase activity. On the contrary, we don’t observe marked alteration of the Wnt/β-catenin pathway, suggesting EZH2 is not essential for the control of this pathway in the adrenal. We could also show a dedifferenciation of cortical cells which, after the loss of Ezh2, exhibit progenitors identity by expressing adreno-gonadal marks as Gata4 and Wt1. This dedifferenciation is a natural phenomenon that appear with ageing and could be associated with processive decrease of Ezh2 expression in steroidogenic cells. All of these results, highlights a new function of Ezh2 in the control of the PKA signaling pathway and in the homeostasis of the adrenal gland.

Das ADAMTS16-Gen kodiert für eine Metalloproteinase, deren Funktion und Regulation bislang nicht beschrieben sind. Die ADAMTSs werden von Zellen verschiedener Organsysteme sezerniert und sind für den Abbau extrazellulärer Matrixbestandteile und die Prozessierung von Oberflächenrezeptoren, Signalmolekülen oder Wachstumsfaktoren verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wurden die gewebespezifische Lokalisation von Adamts16 und die möglichen Funktionen der Metalloproteinase im Urogenitalsystem untersucht. Weiterhin konnte die Regulation der Adamts16-Expression durch das Wilms-Tumor Protein beschrieben werden. In verschiedenen Zelllinien des Urogenitalsystems konnte eine Wt1-abhängige Adamts16-Expression festgestellt werden. Zudem erfolgte im Urogenitalsystem eine Koexpression von Adamts16 und Wt1 in embryonalen und adulten Podozyten, somatische Zellen der XX-Gonadenanlage und Granulosazellen und Epithelzellen des adulten Ovars. Im Testis war Adamts16 ohne signifikante Wt1-Koexpression in Spermatozyten und elongierten Spermatiden lokalisiert. Außerhalb des Urogenitalsystems waren Adamts16 und Wt1 im Epikard koexprimiert. Ein Wt1-Knockdown in Epikardzellen und embryonalen Nieren zeigte jeweils einen Rückgang des Adamts16-Expressionsniveaus. Ein Adamts16-Knockdown in embryonalen Nieren resultierte in verminderten Ureterverästelungen, was eine funktionelle Rolle von Adamts16 in der murinen Nierenentwicklung ex vivo andeutet. Der Wt1-Knockdown in Gonadenkulturen zeigte, dass Wt1 die Adamts16-Expression in XY-Gonaden hemmt, in XX-Gonaden hingegen aktiviert. Innerhalb des Adamts16-Gens konnten drei Wt1-Konsensusmotive identifiziert werden. Mit Hilfe von EMSAs und ChIPs konnte die Bindung der Wt1(-KTS)-Isoform an diese Konsensusmotive belegt werden. Ein Reportergenassay zeigte die Aktivierung des Adamts16-Promotors durch Wt1(-KTS) in Granulosazellen, wobei eine Verkürzung der Adamts16-Promotorsequenz zu einer Reduktion der Promotoraktivität führte. / The Adamts16 gene encodes for a metalloproteinase, whose function and regulation is hardly explored. ADAMTSs are secreted by different cells of various organs and are responsible for breaking down extracellular matrix compounds and processing signaling molecules, growth factors and surface receptors. In this work the tissue specific localization of Adamts16 and its possible function and regulation within the genito-urinary system were analyzed. Furthermore the regulation of Adamts16 through the wilms tumor transcription factor Wt1 is described. Different cell lines derived from the genito-urinary system showed a Wt1-dependent mRNA expression of Adamts16. In addition both proteins were co-expressed in embryonic and adult podocytes, somatic cells of the embryonic XX-gonad and granulosa and epithelial cells of the adult ovary. The testes showed a Wt1-independent Adamts16 expression in spermatocytes and elongated spermatids. Outside the genito-urinary system Adamts16 and Wt1 were co-expressed in the epicardium. Knockdown of Wt1 in both epicardial cells and embryonic kidney explants showed a decrease in the Adamts16 mRNA expression level. In turn the Knockdown of Adamts16 led to an inhibited branching morphogenesis in embryonic kidney explants. This indicates a functional role of Adamts16 in the ex vivo kidney development. Knockdown of Wt1 in cultured embryonic gonads revealed that Wt1 inhibits the expression of Adamts16 in XY-gonads but activates it in XX-gonads. Three Wt1 consensus motives were identified within the Adamts16 gene. Using EMSA and ChIP the binding of the Wt1(-KTS)-isoform to all three consensus motives was verified. The ability of Wt1 to activate the Adamts16 promoter was confirmed through reporter gene assays in granulosa cells.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde retrospektiv die Minimale Resterkrankung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und Myelodysplastischen Syndrom nach allogener Stammzelltransplantation mit minimaler Konditionierung untersucht. Hierfür wurden vier unterschiedliche Methoden zur Detektion der Minimalen Resterkrankung analysiert. Nach Etablierung einer quantitativen Real-Time PCR für das Wilms Tumor Gen 1 (WT1) im peripheren Blut wurden diese Ergebnisse mit bereits routinemäßig erhobenen Daten des Chimärismus im Gesamtknochenmark und in CD34+ Zellen sowie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) krankheitsspezifischer chromosomaler Aberrationen von insgesamt 88 Patienten verglichen und statistisch ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die Genexpressionanalysen des WT1 sowie die Chimärismusanalysen ein Rezidiv im Gegensatz zu den FISH Analysen vier Wochen im Voraus detektieren können. In Reiceiver Operating Curve Analysen wurden eine WT1 Expression von > 24 WT1/10.000 ABL1 Kopien und der Abfall des CD34+ Spenderchimärismus von ≥ 5% als diagnostisch stärkste Methoden identifiziert. In uni- und multivariaten Analysen von insgesamt 20 Parametern wurden die beiden Methoden als unabhängige Variablen für ein frühes Rezidiv, progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben bestätigt. Kombiniert man beide Methoden, so kann bei jeweiligem negativen Testergebnis ein Rezidiv innerhalb der nächsten vier Wochen nahezu ausgeschlossen werden.

Le développement du rein est un exemple intriguant d’un équilibre délicat entre la prolifération des cellules progénitrices, la différentiation et l’apoptose. Le gène Wt1 est indispensable pour la survie des cellules progénitrices. Le but de cette thèse a été de définir les voies de signalisation activées par Wt1 pendant le développement du rein. En utilisant les souris Wt1 KO, nous avons démontré que WT1 coordonne l’action de deux voies de signalisation opposées : Fgf et Bmp/Smad intervenant dans la survie des cellules progénitrices rénales. Dans une deuxième étude, nous avons analysé le rôle du modificateur épigénétique, le gène Phf19 pendant le développement du rein. Nous avons démontré que l’expression de ce gène est Wt1-dependant et il est exclusivement exprimé dans les cellules progénitrices rénales au cours du développement et que son inactivation dans le rein embryonnaire en culture, conduit à l’apoptose des cellules progénitrices. Nous avons généré des souris knockout de Phf19 par l’approche de CRISPR/Cas9. Dans le cas d’une létalité précoce des embryons homozygotes, nous opterons pour la production du model animal knockout conditionnel et procéderons à la caractérisation de leur profile épigénétique. Cette thèse a permis d’une part, de découvrir deux voies de signalisation antagonistes, régulées par le Wt1et impliquées dans le contrôle de la survie des cellules progénitrices rénales et d’autre part de nous orienter vers le contrôle de la survie et la prolifération de ces cellules par modifications épigénétiques. Ceci nous permettra de contribuer à la connaissance de l’étiologie d’une grande proportion des malformations rénales restant à ce jour inconnues. / Kidney organogenesis requires the tight control of proliferation, differentiation and apoptosis of renal progenitor cells. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is required for renal progenitor survival. The aim of this thesis was to elucidate the molecular cause for renal agenesis in Wt1 mutant mouse. Here we demonstrate that lack of Wt1 abolishes FGF and induces BMP/pSMAD signaling within the metanephric mesenchyme. We further show that recombinant BMP4, but not BMP7, induces an apoptotic response within the early kidney that can be suppressed by simultaneous addition of FGFs. These data reveal an unknown sensitivity of early renal progenitors to pSMAD signalling, establishes FGF and pSMAD signalling as antagonistic forces in early kidney development and places WT1 as a key regulator of pro-survival FGF signalling pathway genes. In a second study, we demonstrated, that Phf19, an epigenetic modifier, is essential both for maintaining Wt1 expression in renal progenitor cells and their survival in an ex-vivo culture. We further generated a Phf19 knockout mouse by CRISPR/Cas9. The homozygous embryos will be analyzed to further decipher the contribution of Phf19 to potential kidney malformations and the epigenetic profile of renal progenitor cells will be characterized. Overall, the new insights into the molecular mechanisms controlling the survival of renal progenitor cells, reported in this thesis, provide one more step in our understanding of renal malformations. In addition, our results conducted us toward the epigenetique modifications that could open up promising new avenue of understanding the etiology of an important proportion of renal malformation that remains unknown.

Previous studies in our laboratory demonstrated the expression of WT1 in a significant number of glioma cells and established its role in promoting tumor cell proliferation. Here, we noted the effect(s) of manipulating WT1 levels on the expression levels of genes that were previously shown to be regulated by WT1. We found no correlation between the expression levels of WT1 and PDGF-A, Snai1 and E-cadherin and a consistent inverse correlation between WT1 and IGF-1R expression in U251-MG cells. To ascertain whether the increased IGF-1R levels resulting from WT1 silencing could account for decreased cellular proliferation, we utilized siRNA mediated knockdown of IGF-1R and found a modest decrease in cellular proliferation. Gene expression profiling in U251-MG cells was then used to identify candidate target genes for WT1. Several genes whose levels directly correlated with WT1 were observed to have putative or established oncogenic role(s) in glioma cells or other malignancies. Among the genes correlated inversely, meanwhile, a tumor-suppressor role was attributed to some. Real time RT-PCR helped to substantiate these microarray findings in U251-MG cells. We also characterized the expression and function of WT1 in U1242-MG and GBM6 cells. Interestingly, in these cells WT1 facilitated cell invasiveness but had no discernible influence on cellular proliferation. The expressions of the candidate WT1 target genes were studied also determined in these 2 cell lines. At least 3 genes were consistently down-regulated with WT1 silencing in the three cell lines- INPP5A, CD97, and TYMS. To determine whether CD97 assisted WT1 in facilitating cellular invasion, we silenced CD97 expression using siRNA and noted a significant decrease in the cells’ ability to invade through Matrigel-coated filters. We propose that WT1 profoundly impacts the glioma cells’ invasive ability, and this function is mediated by CD97 alone or in conjunction with other pro-invasive molecules. Our findings argue for the oncogenic role of WT1 in the specific context of glioma cells. They also point to a novel pro-invasive protein- CD97- in glioma cells. Further studies are necessary to confirm the mechanism by which CD97 promotes invasion as well as to explore its potential as a diagnostic and/or therapeutic target.

Les prokinéticines sont des hormones angiogéniques qui exercent leurs fonctions biologiques par l’intermédiaire de deux récepteurs couplés aux protéines G : PKR1 et PKR2. PKR1 a été révélé comme crucial dans l’homéostasie cardiovasculaire. L’objectif de ce projet de thèse était de développer un nouvel agoniste non–peptidique à PKR1 pour la cardioprotection et la régénération cardiaque. Les premiers résultats ont permis de caractériser le premier ligand spécifique à PKR1 : IS20. L’étude in vivo a démontré qu’IS20 est capable de prévenir les lésions après induction d’un infarctus du myocarde chez la souris. Ce composé améliore les fonctions cardiaques en activant la prolifération de cellules progénitrices cardiaques et la néovascularisation (Gasser et al, PlosOne, 2015). Dans une deuxième étude, nous avons évalué le potentiel cardioprotecteur d’IS20 face à la toxicité induite par la doxorubicine (DOX), un anticancéreux de la famille des anthracyclines très efficace mais cardiotoxique. Les résultats montrent qu’IS20 atténue l’apoptose des cardiomyocytes H9c2 et des cellules progénitrices humaines de types EPDC, induite par la doxorubicine, sans affecter la cytotoxicité de la doxorubicine sur les cellules cancéreuses. In vivo, le traitement par IS20 atténue la diminution de la prolifération provoquée par la doxorubicine dans un modèle de cardiotoxicité juvénile. Dans un modèle de cardiotoxicité chronique, IS20 maintient l’intégrité cellulaire et tissulaire des vaisseaux et protège des défaillances produites par DOX. Par ses effets cytoprotecteurs des cardiomyocytes et des cellules progénitrices cardiaques, l’IS20 présente un potentiel thérapeutique prometteur pour protéger les patients cancéreux des effets cardiotoxiques des anthracyclines. / Prokineticins are angiogenic hormones that activate two G protein-coupled receptors (GPCRs): PKR1 and PKR2. PKR1 has emerged as a critical mediator of cardiovascular homeostasis and cardioprotection. The aim of this thesis project was to develop a first non-peptide PKR1 agonist stimulates cardioprotection and cardiac regeneration in mouse model of myocardial infarction (MI) or anti-cancer drug mediated cardiotoxicity. Collaboration with chemist and biomodelization team, we characterized the first selective/specific PKR1 agonist, named IS20. In vivo study demonstrated IS20 prevented cardiac lesion formation and improved cardiac function after myocardial infarction in mice, promoting proliferation of cardiac progenitor cells and neovasculogenesis (Gasser et al., 2015). Since use of a very potent anthracycline chemotherapeutic, Doxorubicin (DOX) is limited by cardiotoxicity, we hypothesized that IS20 could protect heart against DOX-mediated cardiotoxicity. Indeed, IS20 attenuated apoptosis induced by DOX in H9c2 cardiomyocytes and human epicardial progenitors in vitro. However, IS20 did not affect antineoplastic or cytostatic effect of DOX in cancer cell lines. In vivo, in the juvenile model of cardiotoxicity, IS20 significantly attenuated DOX-induced decrease in viability and proliferation cardiac progenitor cells. In the chronic cardiotoxicity model by DOX, IS20 improves heart structure and function by the activation of cardiac progenitor cells, diminishing cardiac cell death, improving vascular stability. IS20 has translational potential for cardioprotection in patients with cancer receiving anthracyclines.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 122-135).

Telomerase is a ribonucleoprotein complex that catalyses telomeric repeat addition at the ends of chromosomes. The catalytic subunit, hTERT, acts as a key determinant for telomerase activity control; the induction of hTERT expression is required for telomerase activity. hTERT participates in cellular immortalization and is elevated in certain malignant tissues. Several tumours exhibit telomerase activity, which contributes to the infinite proliferation capacity that promotes tumour progression. Renal cell carcinoma (RCC) represents 2% of all adult malignancies and has a high mortality rate. The WHO classifies RCC into several sub-types based on cytogenetic aberrations and morphological features; the most prevalent sub-types are clear cell (ccRCC), papillary (pRCC), and chromophobe RCC (chRCC). The aims of this thesis were to study the expression patterns of various signalling molecules, to elucidate the functional links among them, and to define the roles of these signalling molecules in the regulation of hTERT gene expression and telomerase activity in RCC. The first paper included in this thesis revealed mRNA overexpression of DJ-1 (a PTEN inhibitor), cMyc, and hTERT in clinical ccRCC samples compared to tumour-free kidney cortex tissues. Significant, positive correlations were detected for DJ-1, cMyc, and hTERT mRNA levels in ccRCC, but not in pRCC. In vitro knockdown of DJ-1 by siRNA in ccRCC cells induced downregulation of p-Akt, cMyc, hTERT, and telomerase activity. Forced overexpression of DJ-1 in an ovarian carcinoma cell line was followed by increased hTERT promoter activity, which appeared to be dependent on cMYC binding to the promoter. Collectively, the in vitro studies verified a functional link among DJ-1, cMyc, and hTERT as implied in the clinical ccRCC samples. The second paper included in this thesis demonstrated overexpression of NBS1 mRNA levels in ccRCC compared to the kidney cortex. NBS1 mRNA levels exhibited significant, positive correlations with DJ-1, cMyc, and S phase, but not with hTERT. In vitro experiments suggested that DJ-1 could regulate NBS1 gene expression. The role of the hTERT transcriptional repressor WT1 in RCC was evaluated in the third paper included in this thesis. ccRCC samples displayed low WT1 mRNA levels compared to kidney cortex samples. Interestingly, WT1 expression was negatively associated with hTERT and cMyc both of which were elevated in ccRCC. Forced overexpression of WT1 isoforms in a ccRCC cell line increased the expression of several negative transcriptional regulators of hTERT and diminished the expression of hTERT positive regulators. In consequence, hTERT mRNA levels and telomerase activity were reduced. Chromatin immunoprecipitation verified direct binding of WT1 to the cMyc, Smad3, and hTERT promoters. Taken together, these data suggested that in ccRCC, WT1 affects hTERT at the transcriptional level via a combined effect on both positive and negative regulators. In conclusion, DJ-1 can regulate hTERT and telomerase activity through the PI3K pathway encompassing PTEN, NBS1, p-Akt, and cMyc in ccRCC, but not in pRCC. WT1 negatively regulates hTERT and telomerase activity directly and indirectly through multiple pathways in ccRCC.