In dieser Dissertation haben wir das Verhalten menschlicher Zellen in Raum und Zeit untersucht. Hochwertige Datensätze subzellulärer Regionen in HEK293-Zellen wurden mit Hilfe der BirA* Proximity-Labelling-Aktivität erstellt, wobei die Lokalisierung auf zelluläre Regionen beschränkt wurde, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu reinigen sind (d. h. die dem Zytosol zugewandten Seiten des ER, Mitochondrien und Plasma-membranen). Wir entwickelten daraufhin einen Ansatz zur Kartierung der Verteilung von Proteinen, die aktiv an RNA binden, und nannten ihn f-XRNAX. Wir stellten hintergrundkorrigierte Proteome für Zellkerne, Zytoplasma und Membranen von HEK293-Zellen her. Überraschenderweise wurden viele nicht-kanonische RBPs in der Membranfraktion identifiziert, und ihre Peptidprofile waren in Regionen mit hoher Dichte an intrinsisch ungeordneten Regionen angereichert, was auf eine möglicherweise schwache, durch diese nicht-strukturellen Motive vermittelte Interaktion mit RNA hinweist. Schließlich konnten wir die unterschiedliche Bindung desselben Proteins an RNA in verschiedenen HEK293-Kompartimenten nachweisen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Bestimmung und Quantifizierung von neu transkribierten RNAs auf Einzelzellebene. Die Kinetik der RNA-Transkription und -Degradation war bis vor kurzem auf Einzelzellebene nicht messbar. Daher haben wir einen neuen Ansatz (SLAM-Drop-seq genannt) entwickelt, indem wir die veröffentlichte SLAM-seq-Methode an Einzelzellen angepasst haben. Wir haben SLAM-Drop-seq verwendet, um die zeitabhängigen RNA-Kinetikraten der Transkription und des Umsatzes für Hunderte von oszillierenden Transkripten während des Zellzyklus von HEK293-Zellen zu schätzen. Wir fanden heraus, dass Gene ihre Expression mit unterschiedlichen Strategien regulieren und spezifische Modi zur Feinabstimmung ihrer kinetischen Raten entlang des Zellzyklus haben. / In this PhD dissertation we investigated the behaviour of human cells through space and time. High quality datasets of subcellular regions in HEK293 cells were generated using BirA* proximity labelling activity and restricting its localization at cellular regions difficult to purified with traditional methods (i.e., the cytosol-facing sides of the endoplasmic reticulum, mitochondria, and plasma membranes). We then developed an approach to map the distribution of proteins actively binding to RNA, and named it f-XRNAX. We recovered background-corrected proteomes for nuclei, cytoplasm and membranes of HEK293 cells. Surprisingly, many non-canonical RBPs were identified in the membrane fraction, and their peptide profiles were enriched in regions with high density of intrinsically disordered regions, indicating a possibly weak interaction with RNA mediated by these non-structural motives. Lastly, we provided evidence of the differential binding to RNA of the same protein in different HEK293 compartments. In the second part of this thesis, we focused on the determination and quantification of newly transcribed RNAs at the single-cell level. The kinetics of RNA transcription, processing and degradation were until recently not measurable at the single-cell level. Thus, we have developed a novel approach (called SLAM-Drop-seq ) by adapting the published SLAM-seq method to single cells. We used SLAM Drop-seq to estimate time-dependent RNA kinetics rates of transcription and turnover for hundreds of oscillating transcripts during the cell cycle of HEK293 cells. We found that genes regulate their expression with different strategies and have specific modes to fine-tune their kinetic rates along the cell cycle.

Knochentumore stellen mit nur 0,2% aller menschlichen Tumore sehr seltene primäre Neoplasien des skelettalen Systems dar. Diese Dissertation beschreibt die genomweite Microarray Analyse von Osteosarkomen und Riesenzelltumoren. Mit einer Microarray Analyse von konventionellen und metastatischen Osteosarkom-Geweben verglichen zu einer Osteoblasten-Primärkultur (HOBc) wurden Gene ermittelt, die im Prozess der Entstehung und Entwicklung sowie im Verlauf der Metastasierung von Osteosarkomen eine Rolle spielen könnten. EFNA1, EphA2, EphA3 und EFNB2 wiesen sehr hohe relative Expressionswerte und eine deutliche Aufregulierung in den Osteosarkomen im Vergleich zu HOBc auf. Mittels RT-PCR und immunhistochemischer Färbung wurde die Expression von EFNA1, EFNA2, EFNB1, EFNB3, EphA1 und EphA2 validiert. Da die deutliche Aufregulation von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom bestätigt werden konnte, wurden beide Ephrine funktionell untersucht. EphA2 wird in Osteosarkom-Zellen durch seinen Liganden EFNA1 Zeit- und Dosis-abhängig internalisiert und vermutlich degradiert. Die Stimulierung des EphA2 Rezeptors durch EFNA1/Fc führt zu einer Aktivierung von Mek, Erk und den Transkriptionsfaktoren Elk1 und cJun. In Wachstumsassays wurde eine signifikant erhöhte Proliferation der stark EphA2 exprimierenden MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen durch EFNA1/Fc beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass die Überexpression von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom eine Rolle während der osteogenen Tumorgenese spielen. Interessanterweise scheinen EphA2 und EFNA1 direkte Zielgene des Mek/Erk-Signalweges zu sein. Wir vermuten einen positiven „feedback-loop“, der die EphA2-Expression über die Aktivierung des Ras/Erk-Signalweges reguliert. Mittels Microarray Analyse wurden auch primäre und rezidivierende Riesenzelltumor-Gewebe analysiert. Riesenzelltumore sind osteolytische Neoplasien mit einem variablen Grad der Aggressivität. Durch diese molekulare Charakterisierung konnten neue Gene (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 und FGFR3) als differentiell exprimiert detektiert werden. Sie wurden bisher noch nicht mit Riesenzelltumoren assoziiert und spielen vermutlich eine Rolle in der Tumorprogression. Weitere Analysen größerer Patientenkollektive sowie funktionelle Studien sind notwendig, um interessante Gene wie AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun und MMP13 weiter zu untersuchen, und um ihre mögliche Beteiligung an Entstehung und Entwicklung von Riesenzelltumoren zu verfestigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die extrazelluläre und intrazelluläre Expression von CD52 in mesenchymalen Tumoren beschrieben. Die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD52 in den Microarray Analysen der Riesenzelltumore und Osteosarkome veranlassten uns, CD52 näher zu analysieren. Wir bestätigten die in vivo und in vitro Expression von CD52 in Osteosarkomen, Chondrosarkomen und Riesenzelltumoren sowie in weiteren benignen und malignen skelettalen Entitäten verglichen zu deren nicht-neoplastischen Gegenstücken. Generell wiesen die malignen Tumore eine höhere Expression verglichen mit den benignen Entitäten auf, was eine Rolle des CD52-Antigens bei der Entwicklung von Knochentumoren vermuten lässt. Weiterhin zeigte unsere Analyse erstmals, dass der derzeit bei der chronisch lymphatischen Leukämie eingesetzte CAMPATH-1H-Antikörper auch in der Lage ist, die Proliferation von MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen Komplement- und Antikörper-vermittelt zu reduzieren. / Bone tumors are rare neoplasms of the skeletal system amounting to only 0.2% of the overall human tumor burden. This dissertation describes a genome wide microarray analysis of osteosarcoma and giant cell tumor of the bone as well as a functional analysis of ephrins in osteosarcoma cell lines. We used a microarray analysis to detect genes differentially expressed between a normal bone osteoblast primary culture (HOBc) and primary and metastatic osteosarcoma tissue. For EFNA1, EphA2, EphA3 and EFNB2 an increased expression was detected in the osteosarcoma tissue samples compared to HOBc. The study verified the increased expression of EFNA1 and EphA2 through RT-PCR and immunohistochemical staining in human osteosarcomas and so the effects of their interaction in osteosarcoma cell lines were analyzed. We observed time- and dosedependent suppression of EphA2 expression via internalisation and degradation in osteosarcoma cell lines through the EFNA1 ligand. The stimulation of the EphA2 receptor by EFNA1/Fc led to an activation of Mek and Erk. In addition, this stimulation resulted in an activation of the transcription factors Elk1 and cJun. In MTT-assays a significantly higher proliferation of high expressing EphA2 MNNG/HOS osteosarcoma cells was observed by ligand-treatment. Our results show that EphA2 and EFNA1 are overexpressed in osteosarcomas suggesting a role of the EphA2 receptor during osteogenic tumorigenesis. We further showed that EphA2 and EFNA1 are targets of the Mek/Erk pathway. We suggest that a possible positive feedback loop regulates EphA2-expression through the activation of Mek/Erk activity. Further one, a molecular characterization of primary and relapse giant cell tumor tissue (GCT) was performed via microarray hybridization. GCTs are osteolytic neoplasms with variable degrees of aggressiveness. We established gene expression profiles and discovered a number of new genes (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 and FGFR3) that have not been described in GCTs before. Further studies and functional analyses are necessary in order to verify genes like AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun and MMP13 that may be involved in the progression of the GCTs and to identify potential targets for future therapy. In this study we described for the first time the extracellular and intracellular expression of CD52 in mesenchymal tumors. We confirmed the expression of the CD52 mRNA and protein both in vivo and in vitro of osteosarcomas, chondrosarcomas, GCTs and other benign and malign skeletal tumors compared to their non-neoplastic counterpart. In general, the malignant tumors showed a higher CD52-expression compared to the benign entities suggesting a role in the progression of bone tumors. Our results obtained in osteosarcoma MNNG/HOS cells showed that CAMPATH-1H, a CD52 antibody currently used in the treatment of chronic lymphatic leukaemia, led to a complement- and antibody-dependent reduction of viable osteosarcoma cells.

Die Untersuchung von Proteininteraktionen ist unerlässlich um die komplexen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle von Zugänglichkeit zum Chromatin und dessen Struktur zu verstehen. Zellspezifizierung während der Entwicklung von Organismen kann nur durch strikte Regulation von Chromatin gewährleistet werden, was auch für den Schutz von Zellenidentitäten im späteren Lebensverlauf wichtig ist. Die Modifizierung von Histon-Proteinen, welche integrale Komponenten des Chromatins sind, fördert entweder positive oder negative Genregulation. Eine Vielzahl von Chromatin regulierenden Proteinen hat jedoch keine enzymatische Aktivität für Histon- Modifikationen, so dass sie nur such Interaktionen mit anderen Proteinen regulatorisch einwirken können. Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich als ein in vivo System, um die Schutzmechanismen der Zellen basierend auf Chromatinfaktoren zu untersuchen, indem systematisch Protein-Interaktionsnetzwerke bestimmt werden. Diese Dissertation beschriebt zunächst die Etablierung eines optimierten Verfahrens für die quantitative Analyse ohne Markierung von Proteinen in C. elegans, die mittels CRISPR mit einem Epitop fusioniert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden fünf Chromatin regulierende Proteine, die eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellidentitäten spielen, charakterisiert. Es wurden in vivo Proteininteraktions-Netzwerke erstellt und dabei neue funktionsrelevante Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus wurde eine vertiefende Analyse der Interaktionen des Chromatinfaktors MRG- 1 durchgeführt, das homolog zum humanen MRG15 ist. MRG-1 besitzt eine sogenannte Chromodomäne, um an methylierte Histone zu binden. Diese Studie zeigt, dass die Untersuchung der Proteininteraktionen von epigenetischen Faktoren in einem in vivo System ein bedeutendes Verfahren ist, um wichtige biologische Mechanismen der Schutzfunktion von Zellen zu entschlüsseln. / Elucidating protein-protein interactions has been instrumental to understand the complex mechanisms underlying epigenetic regulations to control chromatin accessibility and structure. Proper development and cell fate specification are established under strict chromatin regulation to safeguard cellular identities throughout an organism's life. Modifications of histone proteins as an integral component of chromatin can promote either positive or negative gene regulation. However, many chromatin-regulation proteins lack enzymatic activity and depend on protein-protein interaction to cooperate with other factors to regulate chromatin through histone modifications. The nematode Caenorhabditis elegans can be used as an in vivo system to study chromatin regulators that safeguard cell identity and offers an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. The presented thesis includes establishment of an optimized protocol for a quantitative approach based on label-free interaction proteomics to accurately identify interactions of chromatin-regulating proteins, which were epitope-tagged using CRISPR in C. elegans. This protocol was utilized to reveal the interaction partners of five bait proteins involved in essential chromatin regulation mechanisms during cell fate maintenance. The present study generated an in vivo protein interaction network identifying new interactions of high functional relevance. Moreover, in-depth protein-protein interaction analysis of the chromodomain protein MRG-1, homolog of human MRG15, detected a strong association with the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO), besides previously described and novel interactions with other proteins. In summary, in vivo interactome mapping of epigenetic regulators is a powerful approach that can reveal crucial biological insights into how cell fate decisions are regulated.

Die Chromatinstruktur spielt eine bedeutende Rolle bei der Stadien- und Gewebs-spezifischen Genexpression. Der epigenetische Status von Chromatindomänen wird mit Hilfe einer Anzahl von Proteinen und Histonmodifikationen etabliert und aufrechterhalten. Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Bedeutung und Funktion des Chriz Protein Komplexes bei Drosophila, der spezifisch in dekondensierten Regionen von Interphase Chromosomen gebunden ist. Meine RNAi Experimente an embryonalen S2 Zellen zeigten, dass die Rekrutierung von Z4 und der Kinase Jil-1 an das Chromatin sowie dessen H3S10 Phosphorylierung während der Interphase von Chriz abhängt. Diese Ergebnisse lieferten einen starken Hinweis auf eine Ähnlichkeit bei der Bildung des Komplexes in polytänen Zellen und diploiden S2 Zellen. Ich führte eine vergleichende Analyse der Bindungsprofile von Proteinen des Chriz Komplex zwischen Speicheldrüsen im 3.Larvenstadium und S2 Zellen im chromosomalen Intervall 61C7-8 durch. Ich fand heraus, dass die Chriz Bindungsprofile im proximalen Teil der Domäne konserviert waren. Dagegen beobachtete ich eine veränderte Chriz Bindung im distalen Teil, die mit einem veränderten Transkriptionsprofil in dieser Region übereinstimmte. Chriz und Z4 RNAi Experimente in S2 Zellen führten zu einer Veränderung der Expression vieler Chriz- und Z4- bindender Gene. Mittels Co-Immunpräzipitation und Protein „Pull-down“ konnte ich die Bindung der Insulator Proteine BEAF-32 und CP190 im Chriz-Komplex nachweisen und die für die Protein-Protein Interaktion notwendigen Proteinabschnitte grob kartieren. Schließlich überprüfte ich die Möglichkeit einer Rekrutierung des Chriz Komplexes durch BEAF-32 durch Induktion von Punktmutationen in bekannten BEAF-32 Bindemotiven. Meine Ergebnisse wiesen eine Wechselwirkung zwischen Chriz und Insulator Proteinen nach und zeigten, dass der Chriz-Komplex eine wichtige Bedeutung bei der strukturellen Organisation von Chromatin Domänen besitzt. / Chromatin structure is important for the correct stage and tissue-specific expression of the genetic material. The epigenetic state of chromatin domains is established and maintained by a number of proteins and histone modifications. The aim of current thesis is to investigate the role and function of Chriz protein complex, specifically bound to decondensed regions of interphase chromosomes in Drosophila. Several proteins were known to compose Chriz complex - chromodomain protein Chriz, zinc finger protein Z4 and H3S10 kinase Jil-1. I performed RNAi experiments on S2 cells which demonstrated that recruitment of Z4 and Jil-1 kinase to chromatin and interphase H3S10 phosphorylation are dependent on the presence of Chriz. I accomplished the comparative analysis of binding profiles of Chriz complex components between 3rd instar larvae salivary glands and S2 cell culture within 61C7-8 chromosomal interval. I found that Chriz binding profiles between two tissues are conserved at proximal part, however variant Chriz binding in distal part of 61C7-8 domain coincides with differences in transcription profile in the same region. Publicly available genome-wide data shows a tendency of Chriz to bind near Transcription Start Sites (TSS) and promoter regions of active genes. Chriz and Z4 RNAi experiments, performed in S2 cells resulted in expression changes of many Chriz- and Z4-binding genes. Using co-immunoprecipitation and pull-down assays, I identified insulator proteins BEAF-32 and CP190 to be present in the Chriz complex and performed rough mapping of interacting domains. Using BEAF-32 RNAi and introduced point mutations to BEAF-32 binding motifs I examined the possibility for recruitment of Chriz complex by BEAF-32. The obtained results revealed the interplay between Chriz and insulator proteins and point to important architectural role of Chriz complex in organizing chromatin domains.

Das ADAMTS16-Gen kodiert für eine Metalloproteinase, deren Funktion und Regulation bislang nicht beschrieben sind. Die ADAMTSs werden von Zellen verschiedener Organsysteme sezerniert und sind für den Abbau extrazellulärer Matrixbestandteile und die Prozessierung von Oberflächenrezeptoren, Signalmolekülen oder Wachstumsfaktoren verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wurden die gewebespezifische Lokalisation von Adamts16 und die möglichen Funktionen der Metalloproteinase im Urogenitalsystem untersucht. Weiterhin konnte die Regulation der Adamts16-Expression durch das Wilms-Tumor Protein beschrieben werden. In verschiedenen Zelllinien des Urogenitalsystems konnte eine Wt1-abhängige Adamts16-Expression festgestellt werden. Zudem erfolgte im Urogenitalsystem eine Koexpression von Adamts16 und Wt1 in embryonalen und adulten Podozyten, somatische Zellen der XX-Gonadenanlage und Granulosazellen und Epithelzellen des adulten Ovars. Im Testis war Adamts16 ohne signifikante Wt1-Koexpression in Spermatozyten und elongierten Spermatiden lokalisiert. Außerhalb des Urogenitalsystems waren Adamts16 und Wt1 im Epikard koexprimiert. Ein Wt1-Knockdown in Epikardzellen und embryonalen Nieren zeigte jeweils einen Rückgang des Adamts16-Expressionsniveaus. Ein Adamts16-Knockdown in embryonalen Nieren resultierte in verminderten Ureterverästelungen, was eine funktionelle Rolle von Adamts16 in der murinen Nierenentwicklung ex vivo andeutet. Der Wt1-Knockdown in Gonadenkulturen zeigte, dass Wt1 die Adamts16-Expression in XY-Gonaden hemmt, in XX-Gonaden hingegen aktiviert. Innerhalb des Adamts16-Gens konnten drei Wt1-Konsensusmotive identifiziert werden. Mit Hilfe von EMSAs und ChIPs konnte die Bindung der Wt1(-KTS)-Isoform an diese Konsensusmotive belegt werden. Ein Reportergenassay zeigte die Aktivierung des Adamts16-Promotors durch Wt1(-KTS) in Granulosazellen, wobei eine Verkürzung der Adamts16-Promotorsequenz zu einer Reduktion der Promotoraktivität führte. / The Adamts16 gene encodes for a metalloproteinase, whose function and regulation is hardly explored. ADAMTSs are secreted by different cells of various organs and are responsible for breaking down extracellular matrix compounds and processing signaling molecules, growth factors and surface receptors. In this work the tissue specific localization of Adamts16 and its possible function and regulation within the genito-urinary system were analyzed. Furthermore the regulation of Adamts16 through the wilms tumor transcription factor Wt1 is described. Different cell lines derived from the genito-urinary system showed a Wt1-dependent mRNA expression of Adamts16. In addition both proteins were co-expressed in embryonic and adult podocytes, somatic cells of the embryonic XX-gonad and granulosa and epithelial cells of the adult ovary. The testes showed a Wt1-independent Adamts16 expression in spermatocytes and elongated spermatids. Outside the genito-urinary system Adamts16 and Wt1 were co-expressed in the epicardium. Knockdown of Wt1 in both epicardial cells and embryonic kidney explants showed a decrease in the Adamts16 mRNA expression level. In turn the Knockdown of Adamts16 led to an inhibited branching morphogenesis in embryonic kidney explants. This indicates a functional role of Adamts16 in the ex vivo kidney development. Knockdown of Wt1 in cultured embryonic gonads revealed that Wt1 inhibits the expression of Adamts16 in XY-gonads but activates it in XX-gonads. Three Wt1 consensus motives were identified within the Adamts16 gene. Using EMSA and ChIP the binding of the Wt1(-KTS)-isoform to all three consensus motives was verified. The ability of Wt1 to activate the Adamts16 promoter was confirmed through reporter gene assays in granulosa cells.

Die zentromerischen Regionen eukaryotischer Chromosomen sind notwendig für die Segregation der Schwesternchromatiden während der Zellteilung. In den Nukleosomen in diesen Regionen ist das kanonische Histon H3 durch die zentromerische Histon H3 Variante CENP-A ersetzt. Diese wird in Saccharomyces cerevisiae Cse4 genannt. Indem CENP-A die geordnete Assemblierung einzelner Untereinheiten des Kinetochors vermittelt, spezifiziert es die zentromerische Chromosomenregion und ist damit essentiell für die korrekte Segregation der Chromosomen während der Zellteilung. Kürzlich wurde gezeigt, dass Cse4 posttranslational modifiziert wird. Von Bedeutung für diese Arbeit sind die in der essentiellen Domäne des N-terminus liegenden Methylierung von Arginin 37 und die Acetylierung von Lysin 49, die durch phänotypische Suppression eine genetische Interaktion und eine antagonistische Funktion bei der epigenetischen Regulation in der korrekten Assemblierung der Kinetochoruntereinheiten zeigen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Acetylierung an Cse4K49 von der Histonacetyltransferase Gcn5 abhängt, und dass dieses Enzym Komponenten des SAGA-Komplexes, aber nicht des ADA-Komplexes benötigt. Außerdem konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Acetylierung von K49 in der frühen S-Phase ansteigt und zum Ende der S-Phase abnimmt. Es konnte weiterhin eine biochemische Interaktion der N-terminalen Domäne von Cse4 mit der COMA-Untereinheit Ctf19, der zentralen Region des Kinetochors, nachgewiesen werden, möglicherweise mit einer Präferenz zu einer nicht acetylierten Form von Cse4K49. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Transkriptions-Co-Aktivator Komplex SAGA eine Funktion an der zentromerischen Region in S. cerevisiae aufweist. Des Weiteren ist die Acetylierung an Cse4K49 in die Rekrutierung der Kinetochoruntereinheit Ctf19 involviert, und gibt damit einen Hinweis auf einen epigenetischen Regulationsmechanismus während der Chromosomensegregation. / The centromeric regions of eukaryotic chromosomes are essential for proper chromosome segregation. The nucleosomal composition in these regions differs from that of canonical nucleosomes in that histone H3 is replaced by the H3 variant CENP-A, which is termed Cse4 in Saccharomyces cerevisiae. CENP-A is the most important epigenetic mark on centromeres and essential for accurate kinetochore establishment at centromeric sites, which in turn are necessary to connect the centromeric sites to the microtubules. Whereas the histone fold domain of Cse4 shares a sequence homology with canonical histone H3, the N-terminal domain is rather long as compared to canonical histone tails and the centromeric histone variants of higher eukaryotes. One part of this flexible, positively charged histone tail has been shown to represent an essential N-terminal domain (END). Lysine 49 was defined as an acetylation site in this region, but the modification remains to be characterized in detail. In this study, we found that the Cse4K49 acetylation is dependent on the histone acetyltransferase Gcn5, and that the enzyme in this context acts within the SAGA/SLIK complex, whereas an involvement of the smaller ADA complex was not observed. Furthermore, we addressed the cell-cycle dependence of the K49 acetylation and found an increase in early S-phase and a decrease in late S-phase, whereas the R37 methylation persisted throughout S-phase. Ctf19 was found to bind acetylated and unacetylated Cse4K49 with a preference for unacetylated Cse4. The findings presented here show that the transcriptional co-activator complex SAGA functions at centromeric regions in S. cerevisiae, and that the Cse4K49 acetylation has an influence on the recruitment of the kinetochore subunit Ctf19. This suggests an epigenetic regulatory mechanism involving a specific acetylation on the N-terminus of Cse4 in chromosome segregation.

Die Proteinkinase C (PKC) ist eine wichtige Signaltransduktionskomponente, deren Aktivierung die Expression zahlreicher Gene induziert und zur Zelldifferenzierung und Zellproliferation führt. Ein besonders hohes Expressionsniveau der PKC findet man in vielen Tumoren. So korreliert in malignen Gliazellen das Expressionsniveau der PKC mit deren Wachstumsgeschwindigkeit. Es wird angenommen, daß die aktivierte PKC eine wichtige Rolle in der Tumorpromotion hat. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob in Astrozytomzellinien Gene zu finden sind, die nach PKC-Aktivierung durch den Phorbol-Ester TPA differentiell exprimiert werden. Zunächst wurden kultivierte Zellen der Astrozytomzellinie LN-405 mit TPA respektive dem PKC-Inhibitor Chelerythrin behandelt. Nach Gewinnung der mRNA aus der zuvor isolierten RNA wurden in einem mehrstufigem PCR-Verfahren (SSH) cDNA-Abschnitte gewonnen, die zu vermeintlich differentiell exprimierten Genen gehören. Diese cDNA-Abschnitte wurden in Plasmid-Vektoren eingefügt, kloniert und zur Bestimmung sequenziert. Um falsch positive Sequenzen zu erkennen, wurden die zuvor radioaktiv markierten cDNA-Abschnitte mit Northernblots hybridisiert. Gleichzeitig ließ sich so ein zeitabhängiger Anstieg der Expression nach PKC-Stimulation untersuchen. Durch den PCR-Select-Assay (SSH) konnten insgesamt 11 Gene gefunden werden, die sich in der radioaktiven Northernblot-Hybridisierung, als nach PKC-Aktivierung differentiell exprimiert, darstellen ließen. Dabei bestätigt der gefundene Zusammenhang zwischen PKC-Aktivierung und differentieller Exprimierung bei fünf der 11 Gene (IL-8, Calpain, Interferon-gamma Rezeptor 2, Methionin Adenosyltransferase, beta-2 adrenerger Rezeptor) Ergebnisse anderer Autoren, wobei dieser Zusammenhang nur bei zwei Genen (IL-8 und Calpain) auch in Astrozytom- bzw. Gliom-Zellen schon früher gezeigt werden konnte. Sechs Gene (M-Phase Phosphoprotein-1, ect2-Onkogen, ERM-Gen, Ornithin-Decarboxylase-Antizym 2, MHC-bindendes Protein 2, Sequenz aus Cosmid F0811) wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig als PKC-abhängig exprimiert beschrieben. Die gefundenen Gene haben auf verschiedene Funktionen der Zellen Einfluß. So beeinflussen sie die Regulation des Zellzyklus (MPP1, ect2-Oncogen), die Immunregulation (MBP-2, IL-8, Interferon-gamma Rezeptor 2), die Signaltransduktion (beta-2 AR), die Transkription (ERM-Gen), die Proteinsynthese (ODC-Antizym, MAT), die Wachstumskontrolle (ODC-Antizym) und die Regulation der PKC selbst (Calpain). Für fünf Gene läßt sich ein eindeutiger Zusammenhang mit der Tumorpromotion herstellen: IL-8 (Angioneogenese), MBP-2 (Immunsuppression), ERM-Gen (Transkriptionspromotion), MAT (allgemein fördernder Einfluß auf den Metabolismus) und ect2-Oncogen (Oncogen). / The protein kinase C (PKC) is one of the major signal transduction systems and its activation leads to the induction of the expression of several genes, to cell differentiation and cell proliferation. Very high expressed PKC are found in many tumors. In malignant glia cells the expression of PKC correlates with their proliferation rate. The PKC activity has an important role for the tumor promotion. The object of this paper, was to investigated, if there are genes differentialy expressed after activation of PKC through the phorbol-ester TPA in astrocytoma cell lines. The astrocytoma cell line LN-405 was incubated with TPA and the PKC-inhibitor chelerythrine respectively. After isolation of RNA and mRNA the suppression subtractive hybridization (SSH) was used to isolate differentially expressed cDNA fragments. These cDNA fragments were inserted into the T/A cloning vector, cloned and sequenced. To detect false positives the cDNA fragments were analysed with northern blot technique. Examined was also a time-dependent acceleration of expression after TPA treatment. 11 genes were detected by suppression subtractive hybridization, showing differentially expressed in the northern blot hybridization. Five of the genes were found differentially expressed after PKC activation before (IL-8, calpain, interferon gamma receptor 2, beta-2-adrenergic receptor, methionine adenosyltransferase alpha), two of these genes (IL-8, calpain) also in astrocytoma- and glioma-cells respectively. Six genes (M-phase phosphoprotein 1, ect2-onkogene, erm gene, ornithine decarboxylase antizyme 2, MHC binding protein 2, sequence from Cosmid F0811) were described as PKC dependent expressed for the first time. The genes detected influence several cell functions. They are involved in cell-cycle regulation (MPP1, ect2-oncogene), immuneregulation (MBP-2, IL-8, interferon gamma receptor 2), signal transduction (beta 2 adrenergic receptor), transcription (erm-gene), synthesis of proteins (ODC-antizyme 2, MAT), growth control (ODC-antizyme) and regulation of PKC (Calpain). Five genes show a clear connection to tumor promotion: IL-8 (angioneogenesis), MPB-2 (immunesuppression), erm gene (promotion of transcription), MAT (promotion of metabolism) and ect2-oncogene (oncogene).

Als Schlüsselfaktor des hämatopoietischen Systems spielt PU.1 eine ent-scheidende Rolle in der Entwicklung der meisten hämatopoietischen Li-nien. Das PU.1 Expressionslevel bestimmt das Differenzierungspotential hämatopoietischer Stammzellen und Vorläufer. In den unterschiedlichen Zelltypen werden verschiedene Expressionsstärken etabliert. Wie diese zelltypischen Expressionslevel vonPU.1 generiert werden, ist bisher weit-gehend unbekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde mit Hilfe eines transgenen Maus-modells die cis-regulatorische Einheit von PU.1 definiert, um mit nachfol-genden molekularbiologischen und genomweiten Ansätzen Mechanismen der zellspezifischen Regulation von PU.1 zu aufzuzeigen. Die Definition der cis-regulatorischen Einheit von PU.1 erfolgte mit Hilfe eines transgenen Mausmodells, welches ein humanes PU.1 BAC Kons-trukt trägt. Es konnte gezeigt werden, dass humanes und murines PU.1 substituierbar sind und den gleichen Regulationsmechanismen unterlie-gen. Mit Hilfe genomweite DNaseI hypersensitivity Analysen, Methylie-rungs- und Bindungsstudien konnte ein neuer Regulationsmechanismus beschrieben werden, der eine spezifische kombinatorische Interaktion verschiedener cis-regulatorischer Elemente erfordert. Durch Reportergenassays in verschiedenen Zelltypen war es möglich, einen myeloischen Enhancer zu identifizieren. Es konnte gezeigt werden, dass PU.1 mit zelltyp-spezifischen Transkriptionsfaktoren interagiert, um unterschiedliche Bindungsmuster an seinen regulatorischen Elementen zu etablieren. Dadurch kommt es zu den spezifischen Expressionstärken von PU.1 / The transcription factor PU.1 occupies a central role in controlling myeloid and early B cell development and its correct lineage-specific expression is critical for the differentiation choice of hematopoietic progenitors. However, little is known of how this tissue-specific pattern is established. We previously identified an upstream regulatory cis-element (URE) whose targeted deletion in mice decreases PU.1 expression and causes leukemia. We show here that the URE alone is insufficient to confer physiological PU.1 expression, but requires the cooperation with other, previously unidentified elements. Using a combination of transgenic studies, global chromatin assays and detailed molecular analyses we present evidence that PU.1 is regulated by a novel mechanism involving cross-talk between different cis-elements together with lineage-restricted autoregulation. In this model, PU.1 regulates its expression in B cells and macrophages by differentially associating with cell-type specific transcription factors at one of its cis-regulatory elements to establish differential activity patterns at other elements.

Die Signalwege des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, -migration und -apoptose durch die Aktivierung von Smad-Proteinen. Untersuchungen haben gezeigt, dass die biologischen Wirkungen des TGF-β-Signalwegs stark vom Zellkontext abhängen. In dieser Arbeit ging es darum zu verstehen, wie TGF-β-Signale Zielgene unterschiedlich regulieren können, wie unterschiedliche Dynamiken der Genexpression durch TGF-β-Signale induziert werden und auf welche Weise Smad-Proteine zu unterschiedlichen Expressionsmustern von TGF- β-Zielgenen beitragen. Der Fokus dieser Studie liegt auf den transkriptionsregulatorischen Effekten des Nodal / Activin-Liganden, der zur TGF-β-Superfamilie gehört und ein wichtiger Faktor in der frühen embryonalen Entwicklung ist. Um diese Effekte zu analysieren, habe ich kinetische Modelle entwickelt und mit den Zeitverlaufsdaten von RNA-Polymerase II (Pol II) und Smad2-Chromatin-Bindungsprofilen für die Zielgene kalibriert. Unter Verwendung des Akaike-Informationskriteriums (AIC) zur Bewertung verschiedener kinetischer Modelle stellten wir fest, dass der Nodal / Activin-Signalweg Zielgene über verschiedene Mechanismen reguliert. Im Nodal / Activin-Smad2-Signalweg spielt Smad2 für verschiedene Zielgene unterschiedliche regulatorische Rollen. Wir zeigen, wie Smad2 daran beteiligt ist, die Transkriptions- oder Abbaurate jedes Zielgens separat zu regulieren. Darüber hinaus werden eine Reihe von Merkmalen, die die Transkriptionsdynamik von Zielgenen vorhersagen können, durch logistische Regression ausgewählt. Der hier vorgestellte Ansatz liefert quantitative Beziehungen zwischen der Dynamik des Transkriptionsfaktors und den Transkriptionsantworten. Diese Arbeit bietet auch einen allgemeinen mathematischen Rahmen für die Untersuchung der Transkriptionsregulation anderer Signalwege. / Transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathways play a crucial role in cell proliferation, migration, and apoptosis through the activation of Smad proteins. Research has shown that the biological effects of TGF-β signaling pathway are highly cellular-context-dependent. In this thesis work, I aimed at understanding how TGF-β signaling can regulate target genes differently, how different dynamics of gene expressions are induced by TGF-β signal, and what is the role of Smad proteins in differing the profiles of target gene expression. In this study, I focused on the transcriptional responses to the Nodal/Activin ligand, which is a member of the TGF-β superfamily and a key regulator of early embryonic development. Kinetic models were developed and calibrated with the time course data of RNA polymerase II (Pol II) and Smad2 chromatin binding profiles for the target genes. Using the Akaike information criterion (AIC) to evaluate different kinetic models, we discovered that Nodal/Activin signaling regulates target genes via different mechanisms. In the Nodal/Activin-Smad2 signaling pathway, Smad2 plays different regulatory roles on different target genes. We show how Smad2 participates in regulating the transcription or degradation rate of each target gene separately. Moreover, a series of features that can predict the transcription dynamics of target genes are selected by logistic regression. The approach we present here provides quantitative relationships between transcription factor dynamics and transcriptional responses. This work also provides a general computational framework for studying the transcription regulations of other signaling pathways.

Während der Entwicklung des Organismus führen naive Zellen aufgrund eines streng regulierten Transkriptionsprogramms zu differenzierten Zelltypen und Geweben. Obwohl viele Aspekte dieses Differenzierungsprozesses noch wenig verstanden sind, ist allgemein anerkannt, dass Transkriptionsfaktoren (TFs), die mit cis-regulatorischen Modulen (CRMs), nämlich Enhancern, interagieren, einen wesentlichen Beitrag zur Regulierung der räumlich-zeitlichen Genexpression leisten. Um die regulatorischen Wechselwirkungen von Enhancern zu verstehen, verwendete ich eine Technik namens inSTEP, von zwei wichtigen neurogenen Enhancern und einem mesodermalen Enhancer zu entschlüsseln. inSTEP ist eine Abkürzung für in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics und beinhaltet die Präzipitation eines ausgewählten Enhancers zusammen mit all seinen gebundenen Elementen aus einem bestimmten Gewebe zur Identifizierung durch Massenspektrometrie (MS), wodurch die Identifizierung von regulatorischen Kandidaten ermöglicht wird, die die Neurogenese vorantreiben. Das Herunterfallen von mindestens zwei der mutmaßlichen Regulierungskandidaten CG4707 und CG2962 führte zu einem veränderten Reportergen-Expressionsmuster, das vom vndenhancer gesteuert wurde, was darauf hindeutet inSTEP ist in der Lage, neue regulatorische Proteine zu identifizieren, die an der Regulation der Genexpression im sich entwickelnden Nervensystem beteiligt sind. Einer der Enhancer, an denen ich am meisten interessiert bin, ist ein Enhancer für das Gen vnd, das einen entscheidenden TF für die Neurogenese codiert. Ich habe mein Projekt daher über die Frage hinaus erweitert, wie vnd-Expression reguliert wird, um auch die Rolle einzubeziehen, die Vnd selbst bei der Neurogenese spielt. Ich habe ChIP-seq-Experimente durchgeführt, um die genomweiten Bindungsprofile von Vnd aufzuklären, und ich habe Werkzeuge entwickelt, die die isoformspezifische Rolle von Vnd aufklären. / During organismal development, naive cells give rise to differentiated cell types and tissues as a result of a tightly regulated transcriptional programs. Although many aspects of this differentiation process are still poorly understood, it is widely accepted that transcription factors (TFs) interacting with cis-regulatory modules (CRMs), namely enhancers, are major contributors to regulate spatio-temporal gene expression. In order to understand the regulatory interactions of enhancers, I used a technique called inSTEP to unravel the enhancer-protein interactions on two major neurogenic enhancers (for the vnd and rho genes) and one mesodermal enhancer (1070enhancer), for which no target genes are known. inSTEP is an acronym for in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics and entails precipitation of a chosen enhancer together with all its bound elements from a specific tissue, for identification by mass spectrometry (MS), thus enabling the identification of regulatory candidates driving neurogenesis. I have identified candidate regulators in the ventral column and selected ten to do follow-up experiments The knock down of at least two of the vndenhancer putative regulators, CG4707 and CG2962, led to an altered reporter gene expression pattern driven by the vndenhancer, suggesting that inSTEP is able to identify new regulatory proteins involved in the regulation of gene expression in the developing nervous system. One of the enhancers I am most interested in is an enhancer for the gene vnd, which encodes a crucial TF for neurogenesis. I have therefore expanded my project beyond the question of ‘how’ vnd expression is regulated, to also include the role Vnd itself plays in neurogenesis. I have conducted ChIP-seq experiments to elucidate the genome-wide binding profiles of Vnd and I have developed tools that will elucidate the isoform-specific role of Vnd.