Enhancer regulieren die Transkription ihrer Zielgene und deren Expression. Sie bieten eine Bindestelle für verschiedenste Transkriptionsfaktoren (TF) und RNA Polymerase II (RNAPII) und unterstützen die Gentranskription durch das Zustandekommen von Chromatinkontakten. Zusätzlich transkribiert RNAPII in Enhancer-Regionen kurze, non-polyadenylierte Transkripte, die man Enhancer-RNA (eRNA) nennt. Der Mechanismus der RNAPII-Rekrutierung und –Regulation an Enhancern ist bisher wenig verstanden, insbesondere wie das Vorhandensein von RNAPII-Modifikationen den Chromatinstatus, -faltung sowie die Genaktivierung beeinflusst. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Enhancer-Bestimmung miteinander verglichen. Während eine klare Bestimmung des besten Ansatzes sich als komplex erwies, konnte gezeigt werden, dass die Bindung von RNAPII an regulatorische Regionen in Zusammenhang mit TF eine universelle Konstante darstellte. Weiterhin wurden der Status der Enhancer-gekoppelten RNAPII-Aktivierung und deren Transkriptionsaktivität untersucht. Als Hauptergebnis ergab sich, dass der RNAPII-Status mit der Enhancer-Aktivität und daraus folgend mit veränderter Transkriptionsaktivität korreliert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein extragenischer RNAPII ein neues Werkzeug zur Identifikation von regulatorischen Regionen ist. Erfolgreich konnten regulatorische Regionen in embryonalen Stammzellen der Maus sowie während der neuronalen Differenzierung vorhergesagt und mittels Enhancer-Aktivität in-vivo bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass im Laufe der der neuronalen Differenzierung extragenische RNAPII-Bindung spezifische Aktivierungsmuster aufweist: ihr Transkriptionslevel wird durch Kinasen feinmaschig reguliert und es werden verschiedene Formen maturierter RNA erzeugt. Zusammenfassend konnte RNAPII als Werkzeug zur Identifikation und Charakterisierung regulatorischer Regionen in verschiedenen Zelltypen ausgemacht werden. Selbst mit minimalen RNAPII-Datensätzen ist es möglich, gleichzeitig regulatorische Regionen zu identifizieren als auch ihren eigenen Aktivierungsstatus sowie den ihrer kodierender Genpromotoren zu bestimmen. / Enhancers regulate transcription of target genes and gene expression. They act as recruitment sites for multiple transcription factors (TFs) and RNA polymerase II (RNAPII) and favour transcription of target genes through chromatin contacts. RNAPII at enhancer regions transcribes short and mostly non-polyadenylated transcripts, called enhancer RNAs (eRNAs). The mechanisms of RNAPII recruitment and regulation at enhancers remain ill understood, in particular how signalling through RNAPII modifications may influence chromatin states, looping and gene activation. In this study, I compare enhancer lists defined with different approaches and find that their relation is very complex. However, I find that RNAPII binding co-occurs with TF binding at regulatory regions, independently of the identification approach used. I characterize the state of RNAPII activation at enhancers and its transcriptional activity. I find that RNAPII state reflects enhancer activation state and correlates with different transcriptional outputs. In addition, I demonstrate that extragenic RNAPII is a novel tool to identify regulatory regions. I successfully identified putative regulatory regions in mESC and during neuronal differentiation, with enhancer activity in vivo. Extragenic RNAPII regions have specific activation patterns during neuronal differentiation, are finely regulated at the transcriptional level by kinases and transcribe differently mature RNAs. In conclusion, I establish RNAPII as a tool to identify and characterise regulatory regions in a cell type of interest. With minimal RNAPII datasets it is possible to simultaneously identify regulatory regions, infer their state of activation, and the state of activation of coding gene promoters.

Condensine sind essentiell für die Faltung von Chromatin und wurden auch mit der Transkriptionsregulation in Verbindung gebracht. Der zugrunde liegende Mechanismus für die Transkriptionsregulation ist jedoch unklar. Condensin DC in C. elegans ist ein gutes Modell zur Erforschung der Transkriptionsregulation durch Condensine, da es spezifisch für die Dosiskompensation der Gene auf dem X Chromosom benutzt wird. Condensin DC bindet an beide X Chromosome in C. elegans Hermaphroditen und reduziert deren Transkription um die Hälfte. In meiner Dissertation habe ich untersucht, welche Rolle ein dynamisches Binden von Condensin DC an Chromatin spielt und wie dies die Transkription während der Embryogenese reguliert. Condensine binden dynamisch an Chromatin, um es zu komprimieren und durch Bildung von Schlaufen die Transkription zu regulieren. Mit Hilfe von „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) habe ich in adulten Darmzellen von C. elegans untersucht, welche Faktoren das dynamische Binden von Condensin DC an die X Chromosomen beeinflussen. Meine Daten zeigen, dass sowohl die ATPase-Domäne von Condensin DC, als auch eine nicht-katalytische Aktivität einer Histon-Demethylase die Bindedynamik von Condensin DC beeinflussen und damit Transkription regulieren. Zusätzlich habe ich mit einem Mikroskopieansatz, der auf dem Nachweis von einzelnen RNA Molekülen beruht (smFISH), die Transkription von mehreren Genen untersucht, die durch Condensin DC während der Embryonalentwicklung reguliert werden. Die aus diesen Daten ermittelten Transkriptionskinetiken deuten darauf hin, dass Condensin DC vorrangig die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation reguliert. Zusammenfassend liefert meine Forschung neue Einblicke in die Transkriptionsregulation durch Condensine und kann als Basis für detailliertere, mechanistische Studien der Rolle von Condensinen in der Transkriptionsregulation in C. elegans und auch in anderen Organismen dienen. / Condensins are essential for chromosome compaction and have been implicated in transcription regulation. The mechanistic foundation of this regulatory function is poorly understood. A clear paradigm to address this question is the X-specific condensin DC in C. elegans, which specifically binds to and transcriptionally represses X chromosomes in XX hermaphrodites by 2-fold. In my thesis, I studied condensin DC binding dynamics to the X chromosome and how condensin DC affects transcription kinetics in single embryos. The binding of condensins to chromatin has been described in recent microscopy-based studies as dynamic in processes including loop formation, chromatin compaction and transcription regulation. To study the dynamics of condensin DC binding, I established fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in C. elegans adult intestinal cells. With this method, I studied how the ATPase domain and different histone modifiers regulate the dynamic binding of condensin DC. I found that the ATPase domain is critical for binding of the complex and that the noncatalytic activity of a histone demethylase increases the dynamics of condensin DC binding, which is crucial for its role in transcription regulation. To further study the mechanism of condensin DC in transcription regulation, I used an imaging approach based on widefield single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). I obtained thousands of smFISH images for a set of condensin DC-regulated genes and extracted mature and nascent RNA counts in 3D, which I used to determine transcription burst characteristics throughout embryonic development. My data show that condensin DC regulates the frequency of transcription initiation to down-regulate X-chromosomal genes. Taken together, my results provide new insight into condensin-mediated transcription regulation, which can be used to inform future studies on the mechanism of condensins in transcription regulation in C. elegans and other organisms.

Der RAF-MEK-ERK-Signalweg steuert grundlegende, oftmals entgegengesetzte zelluläre Prozesse wie die Proliferation und Apoptose von Zellen. Die Dauer des vermittelten Signals wurde als entscheidener Faktor für die Steuerung dieser Prozesse identifiziert. Es ist jedoch nicht eindeutig geklärt, wie die verschiedenen früh und spät reagierenden Genexpressionsmodule kurze und lange Signale unterscheiden können und durch welche kinetischen Merkmale ihre Antwortzeit bestimmt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Proteinphosphorylierungsdaten als auch Genexpressionsdaten aus HEK293-Zellen gewonnen, die ein induzierbares Konstrukt des Proto-Onkogens RAF tragen. Hierbei wurde ein neues Genexpressionsmodul identifiziert, dass sich aus sofort induzierten aber spät antwortenden Genen zusammensetzt. Es unterscheidet sich in der Genexpressionsdynamik und Genfunktion von anderen Modulen, und wurde mit Hilfe mathematischer Modellierung experimenteller Daten identifiziert. Es wurde festgestellt, dass diese Gene aufgrund von langen Halbwertszeiten der vermitteltenden mRNA in der Lage sind spät auf das eingehende Signal zu reagieren und die Dauer des Signals in die Amplitude der Genantwort zu übersetzen. Trotz der langsamen Akkumulation und damit späten Antwortzeit, konnte aufgrund einer GC-reichen Promoterstruktur zunächst vermutet und mit Hilfe eines Markerverfahrens bestätigt werden, dass die Transkription dieser Gene instantan mit Beginn der ERK-Aktivierung startet. Eine vergleichende Analyse zeigte, dass das Prinzip der Signaldauer-Entschlüsselung in PC12-Zellen und MCF7-Zellen, zwei paradigmatischen Zellsystemen für die ERK-Signaldauer, konserviert ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse der Untersuchung darauf hin, dass das neu identifizierte Genexpressionsmodul der Entschlüsselung der ERK-Signaldauer dient und das mRNA Halbwertszeiten sowohl hierfür, als auch für die zeitliche Abfolge der Genantwort eine entscheidende Rolle spielen. / The RAF-MEK-ERK signalling pathway controls fundamental, often opposing cellular processes such as proliferation and apoptosis. Signal duration has been identified to play a decisive role in these cell fate decisions. However, it remains unclear how the different early and late responding gene expression modules can discriminate short and long signals and what features govern their timing. Both protein phosphorylation and gene expression time course data was obtained from HEK293 cells carrying an inducible construct of the proto-oncogene RAF. A new gene expression module of immediate-late genes (ILGs) distinct in gene expression dynamics and function was identified by mathematical modelling. It was found that mRNA longevity enables these ILGs to respond late and thus translate ERK signal duration into response amplitude. Despite their late response, their GC-rich promoter structure suggested and metabolic labelling with 4SU confirmed that transcription of ILGs is induced immediately. A comparative analysis showed that the principle of duration decoding is conserved in PC12 cells and MCF7 cells, two paradigm cell systems for ERK signal duration. Altogether, the findings of this study indicate that ILGs decode ERK signal duration and that both decoding capacity and gene expression timing are governed by mRNA half-life.

Wie regulatorische Sequenzen die Genexpression steuern, ist von grundlegender Bedeutung für die Erklärung von Phänotypen in Gesundheit und Krankheit. Die Funktion regulatorischer Sequenzen muss letztlich in ihrer genomischen Umgebung und in entwicklungs- oder gewebespezifischen Zusammenhängen verstanden werden. Da dies eine technische Herausforderung ist, wurden bisher nur wenige regulatorische Elemente in vivo charakterisiert. Hier verwenden wir Induktion von Cas9 und multiplexed-sgRNAs, um hunderte von Mutationen in Enhancern/Promotoren und 3′ UTRs von 16 Genen in C. elegans zu erzeugen. Wir quantifizieren die Auswirkungen von Mutationen auf Genexpression und Physiologie durch gezielte RNA- und DNA-Sequenzierung. Bei der Anwendung unseres Ansatzes auf den 3′ UTR von lin-41, bei der wir hunderte von Mutanten erzeugen, stellen wir fest, dass die beiden benachbarten Bindungsstellen für die miRNA let-7 die lin-41-Expression größtenteils unabhängig voneinander regulieren können, mit Hinweisen auf eine mögliche kompensatorische Interaktion. Schließlich verbinden wir regulatorische Genotypen mit phänotypischen Merkmalen für mehrere Gene. Unser Ansatz ermöglicht die parallele Analyse von genregulatorischen Sequenzen direkt in Tieren. / How regulatory sequences control gene expression is fundamental for explaining phenotypes in health and disease. The function of regulatory sequences must ultimately be understood within their genomic environment and development- or tissue-specific contexts. Because this is technically challenging, few regulatory elements have been characterized in vivo. Here, we use inducible Cas9 and multiplexed guide RNAs to create hundreds of mutations in enhancers/promoters and 3′ UTRs of 16 genes in C. elegans. We quantify the impact of mutations on expression and physiology by targeted RNA sequencing and DNA sampling. When applying our approach to the lin-41 3′ UTR, generating hundreds of mutants, we find that the two adjacent binding sites for the miRNA let-7 can regulate lin-41 expression largely independently of each other, with indications of a compensatory interaction. Finally, we map regulatory genotypes to phenotypic traits for several genes. Our approach enables parallel analysis of gene regulatory sequences directly in animals.

Das Ubiquitin-Proteasom-System eukaryotischer Zellen spielt eine zentrale Rolle beim Abbau von fehlgefalteten und nicht mehr benötigten Proteinen. Damit erfüllt es regulatorische Funktionen bei zellulären Prozessen wie z.B. dem Zellzyklus und der Transkription. Das Protein Proteasominhibitor 31 (PI31) wurde als Inhibitor des Proteasoms in vitro charakterisiert. Des weiteren wurde gezeigt, daß überexprimiertes PI31 im murinen System ein Modulator der Assemblierung des Immunoproteasoms (i20S) ist. Über die Funktion und Regulation von PI31 im humanen System war bisher nichts bekannt und wurde deshalb in dieser Arbeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß neben dem PI31-Transkript mindestens neun weitere alternative Spleißvarianten des humanen PI31 Gens PSMF1 existieren. Die PI31-Isoformen V2 bis V10 unterscheiden sich von PI31 (V1) teils durch eine fehlende N-terminale Domäne oder einen veränderten C-Terminus. Die Isoform V5 wird als einzige gewebespezifisch in Testikeln exprimiert und ist im Zellkern lokalisiert. Ausschließlich die Überexpression der Isoform V3 führt zur Inhibition der proteasomalen Aktivität in vivo. Ein modulatorischer Einfluß von PI31 oder einer der Isoformen auf die Assemblierung des humanen i20S bestätigte sich dagegen nicht. Die Überexpression von PI31 und V3 in humanen Zellen führte indes zu einer Akkumulation und verzögerten Degradation von proteasomalen Substraten. Es wurde außerdem gezeigt, daß die Expression von humanem PI31 durch virusassoziierte Stimuli wie dsRNA und Typ I-Interferone induziert werden kann. Für die 3kb lange 3’UTR der PI31-mRNA konnte zusätzlich nachgewiesen werden, daß sie inhibitorisch auf die Expression wirkt und somit eine regulatorische Funktion besitzt. In Zusammenhang mit der von Kirk et al. (2008) gezeigten Heterodimerisierung von PI31 mit dem F-Box Protein Fbxo7, weisen die hier vorgestellten Ergebnisse auf eine Funktion von PI31 und dessen Isoformen bei der Ubiquitinierung von proteasomalen Substraten hin. / The ubiquitin–proteasome pathway is the major intracellular system for protein degradation. It plays an important role in the regulation of cellular processes like cell cycle control, signal transduction and gene transcription. The protein proteasome inhibitor 31 (PI31) was initially characterized as a potent inhibitor of proteasomal activity in vitro. Furthermore it was shown that PI31 modulates the assembly of the murine immunoproteasome (i20S). The function and regulation of PI31 in the human system is so far unexplored and therefore the topic of this study. It was shown that at least nine alternatively spliced variants of the PI31 gene PSMF1 exist additionally to the PI31 transcript. The PI31 isoforms V2 to V10 differ from PI31 (V1) in parts of the N-terminus and in a modified C-terminus. Only the isoform V5 is tissue specific expressed in testis and localized in the nucleus. After overexpression only the isoform V3 has the ability to inhibit the proteasomal activity in vivo. In contrast to the murine system neither PI31 nor the isoforms showed a modulatory effect on the assembly of the i20S. The overexpression of PI31 and V3 in human cells results instead in the accumulation and delayed degradation of proteasomal substrates. Furthermore the expression of human PI31 can be induced by virus associated stimuli like dsRNA and type I interferones. In addition, for the 3kb long 3’UTR of the PI31-mRNA an inhibitory effect on the expression and therefore a regulatory role was shown. Together with data from Kirk et al. (2008), who show the heterodimerization of PI31 with the F-box protein Fbxo7, the presented results suggest a function of PI31 and its isoforms in the process of ubiquitination of proteasomal substrates.

Genomweite Bemühungen haben eine große Anzahl langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs) identifiziert, obwohl ihre möglichen Funktionen weitgehend rätselhaft bleiben. Hier verwendeten wir ein System zur synchronisierten Blüteninduktion in Arabidopsis, um 4106 blütenbezogene lange intergene RNAs (lincRNAs) zu identifizieren. Blütenbezogene lincRNAs sind typischerweise mit funktionellen Enhancern assoziiert, die bidirektional transkribiert werden und mit verschiedenen funktionellen Genmodulen assoziiert sind, die mit der Entwicklung von Blütenorganen zusammenhängen, die durch Koexpressionsnetzwerkanalyse aufgedeckt wurden. Die Master-regulatorischen Transkriptionsfaktoren (TFs) APETALA1 (AP1) und SEPALLATA3 (SEP3) binden an lincRNA-assoziierte Enhancer. Die Bindung dieser TFs korreliert mit der Zunahme der lincRNA-Transkription und fördert möglicherweise die Zugänglichkeit von Chromatin an Enhancern, gefolgt von der Aktivierung einer Untergruppe von Zielgenen. Darüber hinaus ist die Evolutionsdynamik von lincRNAs in Pflanzen, einschließlich nicht blühender Pflanzen, noch nicht bekannt, und das Expressionsmuster in verschiedenen Pflanzenarten war ziemlich unbekannt. Hier identifizierten wir Tausende von lincRNAs in 26 Pflanzenarten, einschließlich nicht blühender Pflanzen. Ein direkter Vergleich von lincRNAs zeigt, dass die meisten lincRNAs speziesspezifisch sind und das Expressionsmuster von lincRNAs einen hohen Transkriptionsumsatz nahe legt. Darüber hinaus zeigen konservierte lincRNAs eine aktive Regulation durch Transkriptionsfaktoren wie AP1 und SEP3. Konservierte lincRNAs zeigen eine konservierte blütenbezogene Funktionalität sowohl in der Brassicaceae- als auch in der Grasfamilie. Die Evolutionslandschaft von lincRNAs in Pflanzen liefert wichtige Einblicke in die Erhaltung und Funktionalität von lincRNAs. / Genome-wide efforts have identified a large number of long non-coding RNAs (lncRNAs), although their potential functions remain largely enigmatic. Here, we used a system for synchronized floral induction in Arabidopsis to identify 4106 flower-related long intergenic RNAs (lincRNAs). Flower-related lincRNAs are typically associated with functional enhancers which are bi-directionally transcribed and are associated with diverse functional gene modules related to floral organ development revealed by co-expression network analysis. The master regulatory transcription factors (TFs) APETALA1 (AP1) and SEPALLATA3 (SEP3) bind to lincRNA-associated enhancers. The binding of these TFs is correlated with the increase in lincRNA transcription and potentially promotes chromatin accessibility at enhancers, followed by activation of a subset of target genes. Furthermore, the evolutionary dynamics of lincRNAs in plants including non-flowering plants still remain to be elusive and the expression pattern in different plant species was quite unknown. Here, we identified thousands of lincRNAs in 26 plant species including non-flowering plants, and allow us to infer sequence conserved and synteny based homolog lincRNAs, and explore conserved characteristics of lincRNAs during plants evolution. Direct comparison of lincRNAs reveals most lincRNAs are species-specific and the expression pattern of lincRNAs suggests their high evolutionary gain and loss. Moreover, conserved lincRNAs show active regulation by transcriptional factors such as AP1 and SEP3. Conserved lincRNAs demonstrate conserved flower related functionality in both the Brassicaceae and grass family. The evolutionary landscape of lincRNAs in plants provide important insights into the conservation and functionality of lincRNAs.

Der Gen-Knockdown mittels RNAi hat sich als essentiell erwiesen, um Inhibitoren der induzierten Transdifferenzierung in C. elegans zu identifizieren (Tursun et al., 2011). Bakterienstämme, die dsRNA exprimieren, das die Expression spezifischer Gene mindert, können dem Wurm direkt zugefüttert werden, um einen genomweiten RNAi-screen der insgesamt 20.000 Gene in C. elegans durchzuführen. Allerdings werden die meisten biologischen Prozese durch mehr als ein Gen reguliert, was den Bedarf nach einer Methode generiert, die es erlaubt, zwei oder mehr Gene gleichzeitig herunter zu regulieren, um die Steuerung biologischer Prozesse studieren zu können. Die derzeitig vorhandenen Methoden liefern entweder nicht reproduzierbare Ergebnisse oder sind nicht skalierbar. Wir nutzen baktierelle Konjugation, die es durch ein konjugatives Plasmid ermöglicht Bakterienzellen zu generieren, die zwei verschiedene RNAi-Plasmide enthalten. Das Ziel war es, modifizierte RNAi-Donor-Plasmide mittels bakterieller Konjugation an eine Vielzahl anderer Bakterienzellen zu übertragen, die bereits ein anderes RNAi-Plasmid enthalten und dies dann im Hochdurchsatzverfahren durchführen zu können. Um Enhancer induzierter Expression von unc-25::gfp in der Keimbahn, ermöglicht durch den Knockdown des Histonchaperons LIN-53 (RbAp46/48 in Menschen), zu finden, wurden RNAi-Klone generiert, die gleichzeitig lin-53 als auch eines von insgesamt 800 verschiedenen Chromatin-bezogenen Gene herunter regulieren. Dabei identifizierten wir RBBP-5, Mitglied des Set1/ MLL-Methyltransferase-Komplexes, als neuen Barrierefaktor der induzierten Transdifferenzierung. RBBP-5 agiert dabei mutmaßlich parallel zu LIN-53. Doppelte RNAi, ermöglicht durch bakterielle Konjugation, erlaubt den simultanen Knockdown zweier oder mehr Gene, um genetische Interaktionen studieren zu können und erweitert damit die Einsatzmöglichkeiten von RNAi-Screens, um untereinander verbundene biologische Prozesse zu studieren. / The knock down of genes by RNAi has been fundamental to identify inhibitors of induced cell transdifferentiation in C. elegans (Tursun et al., 2011). Bacteria strains expressing dsRNA that target specific genes can be fed to the worm allowing straightforward whole-genome RNAi screens of the 20,000 genes in theC. elegans genome. However, many biological processes are regulated by more than one gene raising the need for simultaneous knock down of two or more genes to more fully interrogate the regulation of complex biological processes. Two approaches are currently available for double RNAi knockdown, − two bacteria strains expressing specific dsRNA can be mixed and grown together and fed simultaneously, which gives highly variable results. Alternatively, a new bacterial clone can be generated carrying a plasmid on which two RNAi targets of interest are 'stitched' together, which is not scalable. To address this challenge, we have developed a protocol using bacterial conjugation mediated by the 'Fertility Factor' (F) Episome in order to combine two different RNAi plasmids in a single bacterium. The objective was to be able to transfer a single RNAi plasmid to a large number of bacterial cells carrying different RNAi clones in one step in a high-throughput manner for large scale 'double' or even 'triple' RNAi screens. To find enhancers of induced unc-25::gfp expression in the germ line enabled by the depletion of histone chaperone LIN-53 (RbAp46/48 in humans), double RNAi clones targeting lin-53 and a total of 800 chromatin-related genes were generated and screened. We identified the Set1/MLL methyltransferase complex member RBBP-5 as a novel reprogramming barrier that putatively acts in a parallel pathway to LIN-53. Double RNAi by conjugation permits to reliably knock down two genes simultaneously in order to study genetic interactions at a genome-wide level, thus further increasing the versatility of RNAi screens to investigate interconnected biological processes.

Cis-regulatorische Elemente wie Promotoren und Enhancer, die die Regulation der Transkription von Genen steuern, befinden sich in Regionen des dekondensierten Chromatins. DNase-seq und ATAC-seq sind weit verbreitete Verfahren, um solche offenen Chromatinregionen genomweit zu untersuchen. Die einzel-Nukleotid-Auflösung von DNase-seq wurde des Weiteren genutzt, um Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBS) in regulatorischen Regionen durch TF-Footprinting zu bestimmen. Kürzlich durchgeführte Studien haben jedoch gezeigt, dass DNase I einen Sequenzbias aufweist, welcher nachteilige Auswirkungen auf die Footprinting-Effizienz hat. Auch wurden das Footprinting und die Auswirkungen des Sequenzbias auf ATAC-seq noch nicht umfassend untersucht. In dieser Arbeit nehme ich einen systematischen Vergleich der beiden Methoden vor und zeige, dass die beiden Methoden unterschiedliche Sequenzbiases haben und korrigiere diese protokollspezifischen Biases beim Footprinting. Der Einfluss von Bias-Korrekturen der Footprinting Ergebnisse ist für DNase-seq größer als für ATAC-seq, und Footprinting mit DNase-seq führt zu besseren Ergebnissen in unserer Datensätze. Trotz dieser Unterschiede zeige ich, dass die Integration replizierter Experimente die Ableitung von qualitativ hochwertigen Footprints ermöglicht, wobei die beiden Techniken weitgehend übereinstimmen. Diese Techniken werden ferner eingesetzt, um die cis-regulatorischen Elemente zu charakterisieren, die die Embryogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster bestimmen. Durch die Verwendung von Embryonen die sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden, sowie gewebespezifischer Kernsortierung mit offenem Chromatin-Profiling können zeitlich und gewebespezifisch aufgelöste vermeintliche cis-regulatorische Elemente definiert werden. Zusammengenommen demonstrieren diese Analysen die Fähigkeit der offenen Chromatin-Profilierung und der Computeranalyse zur Aufklärung der Mechanismen der Genregulation. / Cis-regulatory elements such as promoters and enhancers, that govern transcriptional gene regulation, reside in regions of open chromatin. DNase-seq and ATAC-seq are broadly used methods to assay open chromatin regions genome-wide. The single nucleotide resolution of DNase-seq has been further exploited to infer transcription factor binding sites (TFBS) in regulatory regions through TF footprinting. However, recent studies have demonstrated the sequence bias of DNase I and its adverse effects on footprinting efficiency. Furthermore, footprinting and the impact of sequence bias have not been extensively studied for ATAC-seq. In this thesis, I undertake a systematic comparison of the two methods and demonstrate that the two methods have distinct sequence biases and correct for these protocol-specific biases when performing footprinting. The impact of bias correction on footprinting performance is greater for DNase-seq than for ATAC-seq, and footprinting with DNase-seq leads to better performance in our datasets. Despite these differences, I show that integrating replicate experiments allows the inference of high-quality footprints, with substantial agreement between the two techniques. These techniques are further employed to characterize the cis-regulatory elements governing the embryogenesis of a complex organism, the fruit fly Drosophila melanogaster. Combining tight staging of embryos and tissue-specific nuclear sorting with open chromatin profiling, enables the definition of temporally and tissue-specifically resolved putative cis-regulatory elements. Taken together, these analyses demonstrate the power of open chromatin profiling and computational analysis in elucidating the mechanisms of transcriptional gene regulation.

Der TGFβ-Signalweg ist ein multifunktionales System, das zelluläre Prozesse reguliert, die von Proliferation und Migration bis zu Differenzierung und Zelltod reichen. Nach Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung translozieren SMAD-Proteine zum Zellkern und induzieren die Expression zahlreicher Zielgene. Während viele Komponenten des TGFβ-Signalweges identifiziert wurden, verstehen wir noch nicht genau, wie die Aktivierung des Signalwegs in verschiedene zelluläre Antworten übersetzt wird. Da die zelluläre Antwort auf einen gegebenen Stimulus oft sogar in genetisch identischen Zellen variiert, konzentrierte ich mich auf die Messung der Signalwegaktivität auf der Einzelzellebene. Durch die Kombination fluoreszierender Reporterzelllinien mit Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie und automatisierter Bildanalyse beobachtete ich die zytoplasmatische und nukleäre Translokation von SMADs mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in Hunderten einzelner Zellen. Unsere Experimente zeigten, dass die Signalwegaktivität in eine erste synchrone Phase der SMAD-Translokation, gefolgt von einer Adaption und einer zweiten Signalphase mit hoher Variabilität in Stärke und Dauer der nuklearen Akkumulation unterteilt werden kann. Darüber hinaus beobachtete ich, dass Zellen, die aufgrund ihrer dynamischen Eigenschaften in Subpopulationen gruppiert sind, unterschiedliche phänotypische Reaktionen zeigen. Ich war nun daran interessiert, die Netzwerkinteraktionen zu identifizieren, die diese Dynamiken formen und fokussierte mich auf den Crosstalk mit nicht-kanonischen Komponenten des TGFβ-Signalweges. Ich konnte zeigen, dass die Hemmung der MAP Kinasen p38 und ERK die zweite Signalphase spezifisch aufhebt. Diese dynamische Remodellierung führt zu Veränderungen in der Zielgenexpression und den Zellschicksalen. Dies wird zu einem tieferen Verständnis der molekularen Netzwerke führen, die die TGFβ-Signaltransduktion regulieren und Möglichkeiten eröffnen, es in erkrankten Zellen zu modulieren. / The TGFβ pathway is a multi-functional signaling system regulating cellular processes ranging from proliferation and migration to differentiation and cell death. Upon ligand binding and receptor activation, SMAD proteins translocate to the nucleus and induce expression of numerous target genes. While many components of the TGFβ pathway have been identified, we are still challenged to understand how pathway activation is translated into distinct cellular responses. As the cellular response to a given stimulus often varies even in genetically identical cells, I focused on measuring pathway activity on the single cell level. By combining fluorescent reporter cell lines with time-lapse live-cell microscopy and automated image analysis, I monitored the cytoplasmic to nuclear translocation of SMADs with high temporal and spatial resolution in hundreds of individual cells. Our experiments demonstrated that pathway activity can be divided into a first synchronous phase of SMAD translocation, followed by adaptation and a second signaling phase with high variability in the extent and duration of nuclear accumulation. Furthermore, I observed that cells clustered into subpopulations according to their dynamic features show different phenotypic responses. I was interested in identifying the network interactions that shape these dynamics and focus on crosstalk with non-canonical components of the TGFβ pathway. I could show that inhibition of the MAP kinases p38 and ERK specifically abrogates the second signaling phase. This dynamic remodeling led to changes in target gene expression and cell fate decisions. I explored the molecular mechanisms underlying this interaction of the canonical and non-canonical pathways. This will provide a deeper understanding of the molecular networks regulating TGFβ signaling and open opportunities to modulate it in diseased cells.

Die physische Nähe zwischen Genpromotoren und regulatorischen Elementen (Enhancer) spielt eine entscheidene Rolle in der Genexpression, um präzise räumliche und zeitliche Genexpressionmuster während der Embryogenese zu erzeugen. Abhängig von der Aktivität der Zielgene lassen sich zwei Typen von Interaktionen unterscheiden. Zum einen führen dynamische Enhancer-Promoter Interaktionen unmittelbar zur Genexpression, wohingegen in anderen Fällen stabile Interaktionen bereits vor der Genexpression existieren. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle der stabilen Interaktion zwischen dem Shh Gen und dem Extremitätenenhancer, der ZRS, während der Embryonalentwicklung in der Maus untersucht. Der Verlust der konstitutiven Transkription, die den ZRS Enhancer abdeckt, führte zu einer Verschiebung innerhalb der Shh-ZRS Kontakte und einer moderaten Reduzierung der Shh Genexpression. Im Gegensatz dazu führte die Mutation von CTCF Bindungsstellen, die den ZRS Enhancer umgeben, zu einem Verlust der stabilen Shh-ZRS Interaktion und einem 50%igen Rückgang in der Shh Genexpression. Dieser Expressionsverlust hatte jedoch keine phänotypischen Auswirkungen in den Deletionsmutanten, was darauf hindeutet, dass die restliche Genaktivität und Enhancer-Promotor-Interaktion über einen zusätzlichen, CTCF-unabhängigen Mechanismus erfolgt. Erst die kombinierte Deletion von CTCF-Bindungsmotiven und einem hypomorphen ZRS-Allel führte zu einem fast vollständigen Expressionsverlust von Shh und damit zu einem schweren Funktionsverlust und Gliedmaßen-Agenesie. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die stabile Chromatinstruktur am Shh Locus von mehreren Komponenten getragen wird und die physicalische Interaktion zwischen Enhancern und Promotern für eine robuste Transkription während der Embryonalentwicklung benötigt werden. / Long-range gene regulation involves physical proximity between enhancers and promoters to generate precise patterns of gene expression in space and time. However, in some cases proximity coincides with gene activation, whereas in others preformed topologies already exist before activation. In this study, we investigate the preformed configuration underlying the regulation of the Shh gene by its unique limb enhancer, the ZRS, in vivo during mouse development. Abrogating the constitutive transcription covering the ZRS region led to a shift within the Shh-ZRS contacts and a moderate reduction in Shh transcription. Deletion of the CTCF binding sites around the ZRS resulted in a loss of the Shh-ZRS preformed interaction and a 50% decrease in Shh expression but no phenotype, suggesting an additional, CTCF-independent mechanism of promoter-enhancer communication. This residual activity, however, was diminished by combining the loss of CTCF binding with a hypomorphic ZRS allele resulting in severe Shh loss-of-function and digit agenesis. Our results indicate that the preformed chromatin structure of the Shh locus is sustained by multiple components and acts to reinforce enhancer-promoter communication for robust transcription.