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Estudio y caracterización del gen OFD1 de la levadura carotenogénica Xanthophyllomyces dendrorhous

Gárate Castro, Carla 05 1900 (has links)
Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniería en Biotecnología Molecular / Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza astaxantina, un carotenoide de interés biotecnológico. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. La regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles se encuentran relacionadas. A su vez, ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. En el núcleo, los niveles de Sre1N son regulados por la proteína Ofd1 de manera oxígeno-dependiente, ya que esta proteína inhibe la unión de Sre1N al DNA y promueve su degradación proteosómica en presencia de oxígeno. El objetivo de este trabajo fue caracterizar y estudiar el posible gen de Ofd1 de X. dendrorhous mediante la construcción de cepas que carecen de dicho gen y ensayos de complementación en S. pombe. Mediante análisis bioinformático se identificó el posible gen OFD1 de X. dendrorhous, se dedujo la proteína y se realizó un modelo tridimensional por homología. Se comprobó la conservación del motivo HXD/E…H en el sitio activo, característico de las 2-oxoglutarato oxigenasas. Se realizó la deleción del gen OFD1 en tres cepas de X. dendrorhous: CBS-6938 (silvestre), CBS-cyp61- (mutante que no produce ergosterol y sobre produce carotenoides) y CBS-SRE1N (mutante que expresa solo la forma activa del factor de transcripción Sre1). Se evaluó el fenotipo de las mutantes Δofd1 respecto a sus parentales mediante análisis de carotenoides y esteroles totales por espectrofotometría, en tanto la composición de ambos tipos de xii metabolitos se determinó por RP-HPLC. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGR, el cual posiblemente es regulado por Sre1 en X. dendrorhous. Además, se estudió el fenotipo de crecimiento de la levadura en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol, en la presencia de cloruro de cobalto (compuesto que imita las condiciones de hipoxia) y en anaerobiosis. Los resultados indican que el producto génico de OFD1 no regularía los niveles de Sre1N en el núcleo debido a que no hubo cambio de fenotipo en ningún caso, por lo que OFD1 no participaría en la vía SREBP de X. dendrorhous. Adicionalmente, los ensayos de complementación heteróloga del gen OFD1 de X. dendrorhous en una cepa mutante para este gen en S. pombe, también indican que Ofd1 de X. dendrorhous no regularía los niveles de Sre1N, ya que no se observaron cambios en los niveles de Sre1N de S. pombe mediante Western blot. En conclusión, el gen OFD1 de X. dendrorhous no participa en la regulación del factor transcripcional Sre1N como se había planteado. Posiblemente exista otro mecanismo de regulación aún no descrito. / Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes astaxanthin, a carotenoid of biotechnological interest. The astaxanthin synthesis is produced through mevalonate pathway metabolites, which are also necessary for sterol synthesis. The regulation of the carotenoid and sterol biosynthesis is related. At the same time, both pathways have been shown to be regulated by the SREBP pathway, which in mammal cells controls cholesterol levels. In fungi as well as in the yeast Schizosaccharomyces pombe the SREBP pathway is conserved. Particularly in the yeast, the transcription factor Sre1N regulates the sterol synthesis and the hypoxia response. In the nucleus, the levels of Sre1N are controlled by the Ofd1 protein in an oxygen-dependent way, due to the fact that this protein acts inhibiting the binding of Sre1N to DNA and promoting its proteosomal degradation under oxygen availability. The aim of this work was to characterize and study the possible Ofd1 gene in X. dendrorhous through strain construction lacking this gene and complementation assays in S. pombe. Bioinformatic analysis shown the possible X. dendrorhous OFD1 gene, the protein was deduced and a three-dimensional homology model was performed. The 2-oxoglutarate oxygenases characteristic motif HXD/E ... H was identified at the active site. Deletion of the OFD1 gene was done in three X. dendrorhous strains: CBS-6938 (wild-type), CBS-cyp61- (mutant that does not produce ergosterol and over produces carotenoids) and CBS-SRE1N (mutant expressing only the active form of transcription factor Sre1). Carotenoid and total sterol content was measured spectrophotometrically, while carotenoid and total sterol composition was determined by RP-HPLC. Expression analysis of HMGR gene, which is possibly regulated by Sre1 in X. dendrorhous, was also performed by RT-qPCR. In addition, the phenotype of the yeast growing in the xiv presence of the azole clotrimazole and ketoconazole, was studied in the presence of cobalt chloride (simulating hypoxic conditions) and in anaerobiosis. The results indicate that the OFD1 gene product would not regulate the levels of Sre1N in the nucleus because there was no change in yeast phenotype, so that OFD1 would not participate in the X. dendrorhous SREBP pathway. In addition, heterologous complementation assays of X. dendrorhous OFD1 gene in a mutant strain for this gene in S. pombe also indicate that X. dendrorhous Ofd1 would not regulate Sre1N levels, due to the fact that no changes were observed in the levels of S. pombe Sre1N by Western blot. In conclusion, the OFD1 gene of X. dendrorhous does not participate in the regulation of Sre1N transcription factor as was previously proposed. There may be another regulation mechanism not described yet. / Proyecto FONDECYT 1160202
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Construcción y estudio funcional de mutantes de la biosíntesis de ergosterol de la levadura carotenogénica Xanthophyllomyces dendrorhous

Venegas Ruiz, Maximiliano Alberto. 06 1900 (has links)
Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es capaz de sintetizar astaxantina, un carotenoide utilizado en la industria acuícola. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. El ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) es un componente de las membranas celulares de los hongos y el producto final de la ruta de esteroles. Ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. Se ha visto que la regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles está relacionada, ya que la deleción del gen CYP61 que participa en la síntesis de ergosterol (mutante CBS-6938cyp61-), resultó en un fenotipo que sobreproduce carotenoides. Estas observaciones podrían ser explicadas por un efecto negativo del ergosterol sobre la regulación de la biosíntesis de carotenoides y esteroles, especialmente a nivel de la transcripción de genes de la ruta del mevalonato como el gen HMGR. Es así como en este seminario de título se planteó poner a prueba dicha hipótesis construyendo otros mutantes de la biosíntesis de ergosterol (mutantes de los genes ERG3 y ERG4) para evaluar si estos mantienen el mismo fenotipo que la mutante CBS-6938cyp61- (ausencia de ergosterol y sobreproducción de carotenoides). Mediante análisis bioinformático se identificaron los genes ERG3 y ERG4 de X. dendrorhous y se construyeron los plásmidos para la deleción de ambos genes en la cepa CBS-6938, obteniendo las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. Se evaluó el fenotipo de las mutantes con respecto a la cepa CBS-6938 mediante análisis xiii de carotenoides y esteroles totales, obrservando un aumento en los niveles de esteroles, aunque no se afectó el nivel de carotenoides totales. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGS, el cual posiblemente es regulado por vía SREBP en X. dendrorhous, donde solo observó un aumento en el nivel de transcrito de este gen en la mutante del gen ERG4. Además, las cepas mutantes presentaron una disminución en el crecimiento en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol y el antifúngico Anfotericina B. Los resultados indican que la via SREBP no se encuentra activa en las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. En conclusión, no es la ausencia de ergosterol lo que estaría activando la via SREBP, sino más bien la acumulación de esteroles específicos como sería el caso la cepa CBS-6938cyp61-. / The yeast Xanthophyllomyces dendrorhous is able to synthesize astaxanthin, a carotenoid used in the aquaculture industry. This pigment is synthesized from metabolites of the mevalonate pathway, which are also necessary for the synthesis of sterols. Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) is a component of fungal cell membranes and the final product of the sterol pathway. Both routes have been reported to be regulated by the SREBP pathway, which in mammals regulates cholesterol levels in cells. In fungi the SREBP pathway is conserved, as in the yeast Schizosaccharomyces pombe where the transcription factor Sre1N regulates the synthesis of sterols and the response to hypoxia. It has been found that the regulation of the biosynthetic pathways of carotenoids and sterols is related, since the deletion of the CYP61 gene involved in the synthesis of ergosterol (mutant CBS-6938cyp61-), resulted in a phenotype that overproduces carotenoids. These observations could be explained by a negative effect of ergosterol on the regulation of the biosynthesis of carotenoids and sterols, especially at the level of the transcription of genes of the mevalonate route such as the HMGR gene. Thus, in this work it was proposed to test this hypothesis by the mutation other mutants of ergosterol biosynthesis (mutants of the ERG3 and ERG4 genes) to evaluate whether they maintain the same phenotype as the mutant CBS-6938cyp61- (absence of ergosterol and overproduction of carotenoids). By bioinformatic analysis, the ERG3 and ERG4 genes of X. dendrorhous were identified and the plasmids were constructed for the deletion of both genes in strain CBS-6938, obtaining the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. The phenotype of the mutants was evaluated with respect to the aforementioned strain CBS-6938 by analysis xv of carotenoids production and total sterols, were an increase in sterol levels was observed although no change was observed in total carotenoids. . An expression analysis was also performed by RT-qPCR of the HMGS gene, which is suggested to be regulated via SREBP in X. dendrorhous. In this case, the mutants presented only increase in the transcript level in the mutant of ERG4. In addition, a decrease in the growth of the mutant strains was observed in the presence of the azoles clotrimazole and ketoconazole and the antifungal agent Amphotericin B. The results indicate that the SREBP pathway is not active in the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. In conclusion, it is not the absence of ergosterol that would be activating the SREBP pathway, but rather the accumulation of specific sterols as would be the case with the strain CBS-6938cyp61-.
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Caracterización de la vía SREBP dependiente de los niveles de ergosterol y oxígeno en la biosíntesis de carotenoides y ergosterol en Xanthophyllomyces dendrorhous.

Gutiérrez Gutiérrez, María Soledad 01 1900 (has links)
Tesis para optar al grado de Doctora en Ciencias con mención en Microbiología / Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza carotenoides, siendo el principal de ellos astaxantina. Esta característica la hace de gran interés comercial y objeto de numerosos estudios; sin embargo, existen muchos aspectos desconocidos relacionados con los mecanismos de regulación transcripcional del proceso de carotenogénesis. Estudios recientes proponen la participación del ergosterol, principal esterol en levaduras, en la regulación de genes carotenogénicos y otros esenciales en la vía del mevalonato. En este aspecto, se ha demostrado en otros hongos que el mecanismo por el que el ergosterol regula la transcripción génica es mediante la vía SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein). El factor transcripcional Sre1 posee el dominio activador de la transcripción en el amino terminal (Sre1N) y su activación ocurre cuando bajan los niveles de esteroles y/u oxígeno en la célula regulando la transcripción de genes involucrados en la biosíntesis de esteroles y respuesta a hipoxia, entre otros. El objetivo general de este trabajo fue estudiar el mecanismo de regulación de la expresión génica mediada por la vía SREBP dependiente de los niveles de ergosterol y oxígeno en la biosíntesis de carotenoides y esteroles en X. dendrorhous, enfocándose en la función del regulador transcripcional Sre1. En primer lugar, se identificaron y caracterizaron bioinformaticamente posibles genes de la vía SREBP: SRE1, SCP1, STP1 y OFD1 de X. dendrorhous. Para estudiar la funcionalidad del gen SRE1, se construyó mutantes por deleción de este gen: CBS.sre1- y CBS.cyp61-/sre1- que provienen de las cepas parentales CBS 6938 y CBS.cyp61- (esta última no produce ergosterol), respectivamente. Además, se construyó la cepa mutante CBS.gSRE1N, que expresa sólo el dominio activador de la transcripción (Sre1N). Se evaluó el fenotipo de estas cepas en cuanto a la producción de esteroles y carotenoides, crecimiento en presencia de un inhibidor de la síntesis de esteroles (clotrimazol) y la expresión a nivel de transcritos de algunos genes. Como resultado, se observó que la deleción del gen disminuye la producción de ambos tipos de metabolitos y además, SRE1 es esencial para el crecimiento en clotrimazol. Adicionalemente, la cepa CBS.gSRE1N produce doble cantidad de carotenoides y esteroles, respecto a la cepa silvestre. Paralelamente, se realizó un ensayo de complementación heteróloga vía expresión del gen SRE1 de X. dendrorhous en una cepa mutante sre1- de Schizosaccharomyces pombe y se observó que existe una complementación parcial, dado que la cepa complementada presenta un mejor crecimiento en anaerobiosis y cloruro de cobalto, respecto al control sre1-. Por otra parte, se realizaron análisis transcriptómicos de las cepas mutantes en condiciones de normoxia, hipoxia y cloruro de cobalto, dado que este último compuesto se ha descrito como un agente que imita las condiciones de hipoxia. De estos análisis se desprende que Sre1 es necesario para la respuesta a hipoxia y que el cloruro de cobalto imitaría esta respuesta transcripcional en la levadura al menos en algunos genes de la biosíntesis de esteroles. Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio se concluyó que el gen SRE1 identificado en X. dendrorhous es funcional y participa en la regulación de la biosíntesis de esteroles y carotenoides. / Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes carotenoids, mainly astaxanthin, this characteristic is of great commercial interest and subject of numerous studies. However, there are many unknown aspects related to transcriptional regulation mechanisms of carotenogenesis. Recent studies propose that ergosterol, the main sterol in yeast, is involved in the regulation of carotenogenic genes expression and on other genes of the mevalonate pathway. In this aspect, in other fungi it has been demonstrated that the mechanism by which ergosterol regulates gene transcription is through the SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein) pathway. The transcriptional factor Sre1 contains a transcriptional activation domain at its amino terminal end (Sre1N) that is activated when cellular sterols and/or oxygen levels decrease and by this way, it regulates the transcription of genes involved in the biosynthesis of sterols and response to hypoxia, among others. The general goal of this work was to study if this mechanism, the SREBP pathway, regulates the biosynthesis of carotenoids and sterols in X. dendrorhous, focusing on the function of the transcriptional regulator Sre1. First, X. dendrorhous potential genes of the SREBP pathway, SRE1, SCP1, STP1 and OFD1, were identified and bioinformatically characterized. To study the functionality of the SRE1 gene, deletion mutants of this gene were constructed: CBS.sre1- and CBS.cyp61- / sre1- that derived from the parental strains CBS 6938 and CBS.cyp61- (which does not produce ergosterol), respectively. In addition, the mutant strain CBS.gSRE1N was generated, which expresses only the transcription activating domain (Sre1N). The phenotype of these strains was evaluated in relation to sterol and carotenoids production, growth in the presence of sterol synthesis inhibitor (clotrimazole) and transcript level of some genes. As a result, it was observed that the SRE1 gene deletion, decreases the production of both types of metabolites and also this gene is essential for growth in the presence of clotrimazole. In addition, the production of carotenoids and sterols in the CBS.gSRE1N strain was increased 2-fold compared to the wild-type strain. In parallel, a heterologous complementation assay was performed by expressing the X. dendrorhous SRE1 gene in a Schizosaccharomyces pombe sre1- mutant strain. Partial complementation was observed as the complemented strain displayed better growth in anaerobiosis and in the presence of cobalt chloride (an agent that imitates hypoxia conditions), regarding to the controls strains. On the other hand, transcriptomic analyses of the mutant strains were carried out in conditions of normoxia, hypoxia and cultures in the presence of cobalt chloride. In general, it was observed that Sre1 is necessary for the response to hypoxia conditions and that cobalt chloride would imitate these conditions in the transcriptional response in the yeast, at least in some genes of the sterol biosynthesis. In conclusion, the SRE1 gene identified in X. dendrorhous is functional and it is involved in the regulation of the biosynthesis of sterols and carotenoids in this yeast. / Beca Doctoral y Proyecto FONDECYT 1160202. / 20 de febrero 2020.

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