Die Interleukin 1β (IL-1β) vermittelte Signaltransduktion ist für die akute Entzündung von entscheidender Bedeutung, muss aber gleichzeitig streng reguliert werden. Wie setzt das intrazelluläre IL-1β-Signalnetzwerk den extrazellulären Nachweis von IL-1β effizient in eine präzise und angemessene zelluläre Reaktion um? Welche Kontrollmechanismen kommen zum Einsatz, um eine angemessene Antwort zu gewährleisten und eine Hypo- oder Hyperantwort zu verhindern?
Diese Arbeit charakterisiert die IL-1β-vermittelte Signalwegdynamik in EL4-Zellen mithilfe der Immunpräzipitations-Massenspektrometrie (IP-MS), konkret von MyD88, IRAK4 und IRAK1. Statistischer Analysen identifizierten das Interaktom dieser Proteine nach 15-, 30- und 60-minütiger IL-1β-Stimulation, sowie Proteine, die potenziell an der Runterregulierung des IL-1β-Signalwegs beteiligt sind.
Um zu verstehen, wie das IL-1β-Signalwegnetzwerk die Translationsmaschinerie in EL4 Zellen beeinflusst, um eine angemessene Reaktion zu gewährleisten, untersuchte ich den IL-1β-abhängigen Proteinumsatz mittels gepulste stabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur (pSILAC) in Kombination mit Azidohomoalanin (AHA)- Klickchemie und MS nach IL-1β-Stimulation.
Das Ergebnis aller Proteomik-Untersuchungen war die Identifizierung des TNFα-induzierten Proteins 3 (Tnfaip3) interagierendes Protein 1 (TNIP1) als potenziellen Kandidaten für die Herunterregulierung des IL-1β-Signalwegs. Nach IL-1β-Stimulation kolokalisiert TNIP1 mit allen Myddosomen-Proteinen sowie mit der Deubiquitinase Tnfaip3. Mittels CRISPR/Cas9 erzeugte ich eine TNIP1-KO-EL4 Zelllinie. Nach IL-1β Stimulation zeigten TNIP1-KO-Zellen vermehrt phosphoryliertes p65, aber verringertes phosphoryliertes JNK sowie eine langfristig verringerte IL-2-Sekretion. Daher ist TNIP1 nicht nur an der Herunterregulierung des NF-κB-Signalwegs beteiligt, sondern aktiviert auch den MAPK-Signalweg. / Interleukin 1β (IL-1β)-mediated signal transduction is crucial for acute inflammation, but at the same time needs tight regulation. The IL-1β-mediated signal transduction is encoded by the spatial and temporal dynamics of downstream signaling networks. How does the intracellular IL-1β signaling network efficiently convert the extracellular detection of IL-1β into a precise and proportionate cellular response? What control mechanisms apply in order to ensure a proportionate response and pre- vent a hypo- or hyper response?
This study characterizes the IL-1β mediated signaling dynamics using immunoprecipitation purification mass spectrometry (IP-MS). specifically, of MyD88, IRAK4, and IRAK1. Statistical analyses identified the interactome of these proteins after 15-, 30-, and 60-minute of IL-1β stimulation, as well as proteins potentially involved in IL-1β signaling downregulation using pathway annotation analysis.
Further, in order to understand how the IL-1β signaling network affects the translational machinery in EL4 cells to ensure a proportionate response, , I investigated IL-1β-dependent protein turnover in EL4 cells. Specifically, I applied pulsed stable isotope labeling by amino acids in the culture (pSILAC) combined with azidohomoalanine (AHA)-click chemistry and MS after 30-, 60-, 120- and 240-min of IL-1β stimulation.
The result of these proteomics approaches was the identification of TNFα induced protein 3 (Tnfaip3) interacting protein 1 (TNIP1) as a potential candidate in IL-1β signal downregulation. TNIP1 co-localizes with all myddosome proteins and the deubiquitinase Tnfaip3 after IL-1β stimulation. I generated a TNIP1 KO EL4 cell line using CRISPR/Cas9. After IL-1β stimulation, TNIP1 KO cells show increased levels of phosphorylated p65, but decreased levels of phosphorylated JNK as well as decreased levels of long-term IL-2 secretion. Therefore, TNIP1 is not only involved in downregulatory NF-κB signaling but activates MAPK pathway.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/27154 |
| Date | 03 May 2023 |
| Creators | Gerpott, Fenja Helga Ursel |
| Contributors | Zychlinsky, Arturo, Reber, Simone, Mick, David |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY 4.0) Attribution 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ |
| Relation | 10.1083/jcb.202012071 |
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