Die Interleukin 1β (IL-1β) vermittelte Signaltransduktion ist für die akute Entzündung von entscheidender Bedeutung, muss aber gleichzeitig streng reguliert werden. Wie setzt das intrazelluläre IL-1β-Signalnetzwerk den extrazellulären Nachweis von IL-1β effizient in eine präzise und angemessene zelluläre Reaktion um? Welche Kontrollmechanismen kommen zum Einsatz, um eine angemessene Antwort zu gewährleisten und eine Hypo- oder Hyperantwort zu verhindern? Diese Arbeit charakterisiert die IL-1β-vermittelte Signalwegdynamik in EL4-Zellen mithilfe der Immunpräzipitations-Massenspektrometrie (IP-MS), konkret von MyD88, IRAK4 und IRAK1. Statistischer Analysen identifizierten das Interaktom dieser Proteine nach 15-, 30- und 60-minütiger IL-1β-Stimulation, sowie Proteine, die potenziell an der Runterregulierung des IL-1β-Signalwegs beteiligt sind. Um zu verstehen, wie das IL-1β-Signalwegnetzwerk die Translationsmaschinerie in EL4 Zellen beeinflusst, um eine angemessene Reaktion zu gewährleisten, untersuchte ich den IL-1β-abhängigen Proteinumsatz mittels gepulste stabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur (pSILAC) in Kombination mit Azidohomoalanin (AHA)- Klickchemie und MS nach IL-1β-Stimulation. Das Ergebnis aller Proteomik-Untersuchungen war die Identifizierung des TNFα-induzierten Proteins 3 (Tnfaip3) interagierendes Protein 1 (TNIP1) als potenziellen Kandidaten für die Herunterregulierung des IL-1β-Signalwegs. Nach IL-1β-Stimulation kolokalisiert TNIP1 mit allen Myddosomen-Proteinen sowie mit der Deubiquitinase Tnfaip3. Mittels CRISPR/Cas9 erzeugte ich eine TNIP1-KO-EL4 Zelllinie. Nach IL-1β Stimulation zeigten TNIP1-KO-Zellen vermehrt phosphoryliertes p65, aber verringertes phosphoryliertes JNK sowie eine langfristig verringerte IL-2-Sekretion. Daher ist TNIP1 nicht nur an der Herunterregulierung des NF-κB-Signalwegs beteiligt, sondern aktiviert auch den MAPK-Signalweg. / Interleukin 1β (IL-1β)-mediated signal transduction is crucial for acute inflammation, but at the same time needs tight regulation. The IL-1β-mediated signal transduction is encoded by the spatial and temporal dynamics of downstream signaling networks. How does the intracellular IL-1β signaling network efficiently convert the extracellular detection of IL-1β into a precise and proportionate cellular response? What control mechanisms apply in order to ensure a proportionate response and pre- vent a hypo- or hyper response? This study characterizes the IL-1β mediated signaling dynamics using immunoprecipitation purification mass spectrometry (IP-MS). specifically, of MyD88, IRAK4, and IRAK1. Statistical analyses identified the interactome of these proteins after 15-, 30-, and 60-minute of IL-1β stimulation, as well as proteins potentially involved in IL-1β signaling downregulation using pathway annotation analysis. Further, in order to understand how the IL-1β signaling network affects the translational machinery in EL4 cells to ensure a proportionate response, , I investigated IL-1β-dependent protein turnover in EL4 cells. Specifically, I applied pulsed stable isotope labeling by amino acids in the culture (pSILAC) combined with azidohomoalanine (AHA)-click chemistry and MS after 30-, 60-, 120- and 240-min of IL-1β stimulation. The result of these proteomics approaches was the identification of TNFα induced protein 3 (Tnfaip3) interacting protein 1 (TNIP1) as a potential candidate in IL-1β signal downregulation. TNIP1 co-localizes with all myddosome proteins and the deubiquitinase Tnfaip3 after IL-1β stimulation. I generated a TNIP1 KO EL4 cell line using CRISPR/Cas9. After IL-1β stimulation, TNIP1 KO cells show increased levels of phosphorylated p65, but decreased levels of phosphorylated JNK as well as decreased levels of long-term IL-2 secretion. Therefore, TNIP1 is not only involved in downregulatory NF-κB signaling but activates MAPK pathway.

Measurements of the signals proportional to the radiation intensities or the number densities of the charged particles in argon ICP plasma are between the most popular methods of analysis of low concentrations of elements. But the relationships between the signals and the quantity of element in the sample are very complicated, depend on many physical phenomena and chemical reactions and must be calibrated by application of the reference materials. The accuracy of analysis depends on the level of agreement between the compositions of the RM matrices and the sample. As the exact matching is not possible the signal formation in the argon plasma and the effects of matrices on the analytical results should be studied. A method of calibration of the dependence of the sensitivity of the mass spectrometer on the ion masses and methods to determine the electron density and temperature from the mass spectrometric measurement data were proposed. Those aid estimation of the ion signals for analysis and assessment of the measurement uncertainty. The largest matrix effects usually are due to easy to ionize elements. The results show that those elements in argon plasma, depending on the ionization potentials and the structure of the atomic energy levels, differ in possibilities to increase the temperature, the temperature and density gradients, deviation from the local thermodynamic equilibrium, take part in charge transfer reaction between doubly ionized ions and argon atoms. The phenomena... [to full text] / Mažos elementų koncentracijos šiuo metu dažniausiai yra nustatomos fizikiniais metodais. Dažnai matuojamas spinduliuotės stipris arba elektringų dalelių skaičius. Tačiau ryšys tarp signalo dydžio ir elemento atomų kiekio yra labai sudėtingas daugelio fizikinių (garavimo ar dulkėjimo, disociacijos, atomų sužadinimo bei jonizacijos, srautų ir kt.) reiškinių bei cheminių reakcijų rezultatas. Jų išeiga kol kas pakankamu tikslumu negali būti numatyta. Todėl tokie matavimai yra tik santykiniai, t.y. jie kalibruojami etaloninėmis medžiagomis. Kalibravimo tikslumas priklauso nuo to kiek bendroji etaloninės medžiagos sudėtis artima tiriamajai medžiagai. Tai įmanoma padaryti tik tam tikru artutinumu. Todėl darbe tiriamos signalo formavimosi sąlygos indukcinėje argono plazmoje ir paskirų paveikiųjų elementų bei bendros bandinio sudėties įtaka bandinių analizinių masių spektrometrinių matavimų rezultatams. Pasiūlytas būdas masių spektrometro jautrio priklausomybei nuo jono masės kalibruoti bei būdai elektronų temperatūrai ir koncentracijai nustatyti iš jonų spektrometrinių matavimų. Tai leidžia įvertinti jonų signalus santykinei pusiaukiekybinei analizei, padeda nustatant matavimų neapibrėžtis. Nustatyta, kad labiausiai analizinį signalą argono plazmos šaltiniuose įtakojantys lengvai jonizuojami elementai, priklausomai nuo jų jonizacijos potencialų ir atominių energijos lygmenų išsidėstymo, gali padidinti plazmos temperatūrą ir gradientus bei nukrypimus nuo dalinės termodinaminės... [toliau žr. visą tekstą]

Mažos elementų koncentracijos šiuo metu dažniausiai yra nustatomos fizikiniais metodais. Dažnai matuojamas spinduliuotės stipris arba elektringų dalelių skaičius. Tačiau ryšys tarp signalo dydžio ir elemento atomų kiekio yra labai sudėtingas daugelio fizikinių (garavimo ar dulkėjimo, disociacijos, atomų sužadinimo bei jonizacijos, srautų ir kt.) reiškinių bei cheminių reakcijų rezultatas. Jų išeiga kol kas pakankamu tikslumu negali būti numatyta. Todėl tokie matavimai yra tik santykiniai, t.y. jie kalibruojami etaloninėmis medžiagomis. Kalibravimo tikslumas priklauso nuo to kiek bendroji etaloninės medžiagos sudėtis artima tiriamajai medžiagai. Tai įmanoma padaryti tik tam tikru artutinumu. Todėl darbe tiriamos signalo formavimosi sąlygos indukcinėje argono plazmoje ir paskirų paveikiųjų elementų bei bendros bandinio sudėties įtaka bandinių analizinių masių spektrometrinių matavimų rezultatams. Pasiūlytas būdas masių spektrometro jautrio priklausomybei nuo jono masės kalibruoti bei būdai elektronų temperatūrai ir koncentracijai nustatyti iš jonų spektrometrinių matavimų. Tai leidžia įvertinti jonų signalus santykinei pusiaukiekybinei analizei, padeda nustatant matavimų neapibrėžtis. Nustatyta, kad labiausiai analizinį signalą argono plazmos šaltiniuose įtakojantys lengvai jonizuojami elementai, priklausomai nuo jų jonizacijos potencialų ir atominių energijos lygmenų išsidėstymo, gali padidinti plazmos temperatūrą ir gradientus bei nukrypimus nuo dalinės termodinaminės... [toliau žr. visą tekstą] / Measurements of the signals proportional to the radiation intensities or the number densities of the charged particles in argon ICP plasma are between the most popular methods of analysis of low concentrations of elements. But the relationships between the signals and the quantity of element in the sample are very complicated, depend on many physical phenomena and chemical reactions and must be calibrated by application of the reference materials. The accuracy of analysis depends on the level of agreement between the compositions of the RM matrices and the sample. As the exact matching is not possible the signal formation in the argon plasma and the effects of matrices on the analytical results should be studied. A method of calibration of the dependence of the sensitivity of the mass spectrometer on the ion masses and methods to determine the electron density and temperature from the mass spectrometric measurement data were proposed. Those aid estimation of the ion signals for analysis and assessment of the measurement uncertainty. The largest matrix effects usually are due to easy to ionize elements. The results show that those elements in argon plasma, depending on the ionization potentials and the structure of the atomic energy levels, differ in possibilities to increase the temperature, the temperature and density gradients, deviation from the local thermodynamic equilibrium, take part in charge transfer reaction between doubly ionized ions and argon atoms. The phenomena... [to full text]