A colonização da mucosa respiratória é a primeira etapa na patogênese de Streptococcus pneumoniae, bactéria causadora de pneumonia, meningite, e otite média, responsável por mais de um milhão de mortes por ano no mundo. As proteínas de superfície PsaA e PspA têm sido investigadas como candidatos vacinais para estas doenças. CTB é a porção não tóxica da toxina colérica (CT), responsável pela ligação da toxina ao receptor celular GM1 e descrita como adjuvante de mucosas. Neste trabalho, estes genes de S. pneumoniae foram clonados em pAE, um vetor de expressão de E. coli, que utiliza o promotor T7, ou a 3\' de ctxB no plasmídeo pAE-ctxB. As proteínas recombinantes CTB, PsaA, CTB-PsaA, PspA1, CTB-PspA1, PspA3 e CTB-PspA3 foram expressas em E. coli BL21 (SI) e purificadas através de coluna carregada com níquel. Ensaios de ligação ao receptor GM1 mostraram que CTB e a porção CTB das proteínas de fusão foram obtidas na forma funcional. Imunização por via intranasal com CTB-PsaA e, por via intranasal e intradérmica com CTB-PspA1 e CTB-PspA3 induziu a produção de IgG no soro. Em compensação, somente a imunização com a fusão CTB-PsaA induziu produção de IgA nas secreções de mucosa. Ensaios de colonização da nasofaringe de camundongos BALB/C e C57BL/6 mostraram que a imunização intranasal com CTB-PsaA resulta em diminuição de colonização por S. pneumoniae. Desafios letais com linhagem virulenta de S. pneumoniae mostraram que a imunização intradérmica com CTB-PspA3, ao contrário da imunização intranasal, é capaz de proteger os animais. Uma vez que estas proteínas de fusão induziram resposta imune protetora, estas deverão ser investigadas como componentes de uma nova vacina para infecções causadas por S. pneumoniae. / The colonization of the respiratory mucosa is the first step in the pathogenesis of Streptococcus pneumoniae, bacterium that causes pneumonia, meningitis and otitis media. It is responsible for more than one million deaths per year worldwide. The surface proteins PsaA and PspA have been investigated as vaccine candidates against these diseases. CTB is the non-toxic portion of cholera toxin (CT), responsible for the toxin binding to the cellular receptor GM1 and described as mucosal adjuvant. In this study, these genes from S. pneumoniae were cloned in pAE, an E. coli expression vector that uses T7 promoter, or downstream to ctxB gene in the pAE-ctxB plasmid. The recombinant proteins CTB, PsaA, CTB-PsaA, PspA1, CTB-PspA1, PspA3 and CTB-PspA3 were expressed in E. coli BL21 (SI) and purified through a chelating resin charged with nickel. GM1 binding assays showed that CTB and CTB portion of the fusion proteins were functional. Intranasal immunization with CTB-PsaA and, intranasal and intradermal administration of CTB-PspA1 and CTB-PspA3 induced IgG production in the serum. On the other hand, only CTB-PsaA fusion protein induced IgA in the mucosal secretions. Nasopharyngeal colonization assays in BALB/C and C57BL/6 mice showed that intranasal immunization with CTB-PsaA results in a decrease of colonization by S. pneumoniae. Lethal challenges with S. pneumoniae virulent strains indicated that intradermal immunization with CTB-PspA3, in contrast to the intranasal immunization, is able to protect mice. Since the fusion proteins induced a specific immune response, they should be further investigated as components of a new vaccine against infections caused by S. pneumoniae.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16092007-181850 |
| Date | 18 May 2005 |
| Creators | Arêas, Ana Paula de Mattos |
| Contributors | Ho, Paulo Lee |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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