Bakterielle Toxine stellen eine wirkungsvolle und effektive Alternative zur Therapie von Tumorerkrankungen dar. Das vom Clostridium perfringens Typ A produzierte Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) gehört zu der Gruppe der porenbildenden Toxine und weist eine rezeptorspezifische zytotoxische Wirkung auf, welche über die Membranrezeptoren Cldn3 und Cldn4 entfaltet wird. Diese liegen vor allem in Epithelialkarzinomen wie dem Brust-, Prostata-, oder Kolon-, sowie dem Pankreaskarzinom (PK) stark hochreguliert vor.
Ziel dieser Arbeit war die Anwendung des neuen selektiven und effizienten „Onkoleaking“ Suizid-Gentherapie Konzepts für die Behandlung von Cldn3 / 4 überexprimierender PK unter Verwendung eines nicht-viralen translations-optimierten CPE exprimierenden Vektors (optCPE). Weiterhin sollte in dieser Arbeit der genaue molekulare Mechanismus der CPE-vermittelten Zytotoxizität in vitro und auch in vivo analysiert werden. Für die in vitro Analysen wurden verschiedene humane PK Zelllinien, Patienten abgeleitete Xenotransplantate (PDX) und deren abgeleiteten Zellen bezüglich ihrer Cldn3 / 4 Expression und Sensitivität sowohl gegenüber rekombinantem CPE (rekCPE) als auch nach optCPE Gentransfer untersucht. Es konnte eine positive Korrelation zwischen der Effizienz CPE vermittelter Zytotoxizität und der Höhe der Cldn3 / 4 Überexpression gezeigt werden. Des Weiteren wurde die Verfügbarkeit und Zugänglichkeit der CPE Rezeptoren für die Toxinbindung als kritischer Faktor für die durch Porenbildung induzierte Zytotoxizität beschrieben. Auch eine detaillierte Analyse verschiedener apoptotischer und nekrotischer Signalwege und deren Schlüsselmoleküle waren vom besonderen Interesse. Von noch größerer Wichtigkeit war jedoch die Anwendbarkeit und der Nachweis der antitumoralen Wirksamkeit der optCPE-basierten Suizid-Gentherapie mit Hilfe des intratumoralen Jet-Injektion Gentransfers in verschiedenen Luziferase-exprimierenden CDX und PDX Modellen des PK. Alle in vivo Studien zeigten eine selektive optCPE vermittelte Verminderung der Tumorvitalität in Verbindung mit Nekrose, die in fast allen Fällen mit einer Reduktion des Tumorvolumens einher ging. Die tierexperimentellen Studien belegen damit die Effektivität der CPE-basierten Gentherapie im Pankreaskarzinom. Mit diesen neu gewonnenen Erkenntnissen zum „Onkoleaking“ Konzept der CPE Suizid-Gentherapie und deren Wirkungsmechanismen sind Kombinationen mit konventionellen Therapien möglich. / Bacterial toxins have evolved to an effective therapeutic option for cancer therapy and numerous studies demonstrated their antitumoral potential. The Clostridium perfringens enterotoxin (CPE), produced by the anaerobic Clostridium perfringes bacteria, is a pore-forming (oncoleaking) toxin, which binds to its receptors claudin-3 and -4 (Cldn3 / 4) and exerts a selective, receptor-dependent cytotoxicity. The transmembrane tight junction proteins Cldn3 and Cldn4 are known CPE receptors and are highly upregulated in several human epithelial cancers such as breast, colon, ovarian and pancreatic cancer. This study aimed at the evaluation of the potential of oncoleaking gene therapy using a non-viral translation optimized CPE vector (optCPE) as a new suicide approach for the treatment of Cldn3 / 4 overexpressing pancreatic cancer (PC)
in vitro and in vivo. We demonstrated the successful in vitro use of optCPE gene transfer in a panel of human PC cells and more importantly patient derived PC xenograft (PDX) derived cells. We showed significant reduction of cell viability in all Cldn3 / 4 overexpressing PC cells after optCPE transfection. Furthermore a positive correlation between CPE cytotoxicity and level of claudin expression was shown. We revealed accessibility of CPE receptors for toxin binding as determining for optCPE mediated cytotoxicity. Since investigation of optCPE induced cell death mechanism was of particular interest, detailed analyses of apoptotic and necrotic key players were performed. By this, caspase dependent- and independent apoptosis and necrosis activation after gene transfer was demonstrated, which was dependent on amount of expressed optCPE and accessibility of Cldn. More importantly, this study demonstrated the applicability and antitumoral efficacy of optCPE gene therapy by the non-viral intratumoral jet-injection gene transfer in vivo in different luciferase-expressing CDX and PDX pancreatic cancer models. The animal experiments demonstrated the selective CPE mediated tumor growth inhibition, associated with reduced tumor viability and effective induction of tumor necrosis. This further corroborated the advantages of this novel oncoleaking strategy. With this gain of knowledge about our new oncoleaking concept of suicidal gene therapy and its mechanism of action, novel combinations with conventional therapies are possible to further improve therapeutic efficacy and to overcome resistance in pancreas carcinoma.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/20059 |
| Date | 17 July 2018 |
| Creators | Pahle, Jessica |
| Contributors | Walther, Wolfgang, Landthaler, Markus, Piontek, Jörg |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-ND 3.0 DE) Namensnennung - Nicht-kommerziell - Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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