Das Pankreaskarzinom hat bei steigender Inzidenz eine äußerst schlechte Prognose und ist häufig bei Diagnosestellung nicht mehr kurativ operabel. Die laserinduzierte Thermotherapie (LITT) gewann in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung als ein minimal invasives Verfahren zur perkutanen Ablation von parenchymatösen Tumoren. Dabei ist die Magnetresonanztomographie (MRT) eine Methode, mit der eine präzise Prozesskontrolle der Thermoablation und eine suffiziente Erfolgskontrolle zur Verfügung stehen. Ziel der vorliegenden Studie war es, im Tierexperiment die Anwendung der LITT zur Ablation von Pankreasgewebe am Schwein zu erproben, sowie die Möglichkeiten der MRT als Online-Monitoringverfahren mit Hilfe einer histopathologischen Korrelation zu untersuchen. Dazu wurde an 15 Läuferschweinen das Pankreas einer perkutanen laserinduzierten Thermotherapie mit einer Leistung von 5, 10 und 20 Watt sowie zwei mal 5 Watt in Multiapplikatortechnik unter MRT Prozesskontrolle unterzogen. Anschließend wurde das Pankreasgewebe histologische aufgearbeitet und die magnetresonanztomographisch detektierten Läsionen histopathologisch korreliert. Das Auftreten einer schwerwiegenden Komplikation wie einer generalisierten Pankreatitis, Peritonitis oder Blutung wurde nicht beobachtet. Die durchgeführten Korrelationsanalysen zeigen eine hohe Übereinstimmung zwischen magnetresonanztomographisch dokumentiertem Thermoeffekt und histopathologisch verifizierter thermisch induzierter Nekrose. Interessanterweise wurden bei Anwendung von zwei Lasern niedriger Leistung in Multiapplikatortechnik, im Vergleich zur Anwendung von einem Laser mit höherer Leistung, größere Nekrosen induziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die LITT ein geeignetes und sicheres minimalinvasives Verfahren zur Ablation von Pankreasparenchym unter MRT-Monitoring ist. Weiterführende Untersuchungen zur Durchführbarkeit und Ermittlung der Genauigkeit der MRT als Monitoringverfahren sind erforderlich. / Pancreatic carcinoma has an increasing incidence and a poor prognosis. Frequently at diagnosis pancreatic tumors are surgically unresectable. Laser-induced thermotherapy has become an area of considerable interest during the past few years as a minimally invasive method for percutanous ablation of parenchymatous tumors. With magnetic resonance imaging (MRI) an accurate process control of thermocoagulation and a sufficient control of performance are possible. Control of carcinoma growth of is still a problem. Therefore the aim of this study was to investigate the application of laser induced thermotherapy for ablation of pancreas in a porcine model and the possibility of MRI as an online-monitoring with histopathologic correlation. Laser applicators with energy of 5, 10, 20 and two lasers of 5 watt were placed in the pancreas of 15 female pigs. After sacrifice a pathological examination was performed and histological lesions were correlated with magnetic resonance detected lesions. No serious adverse event like generalized pancreatitis, peritonitis or bleeding was observed. Correlation analysis showed a high correspondence between magnetic resonance documented thermoeffects and histopathologic verified lesions. Thermally induced lesions were best visualised on contrast-enhanced T1-weighted images. Interestingly application of two lasers with each 5 watt, greater lesions were generated than on application of one laser with higher energy. Over a period of 7 days increasing inhomogeneity and contraction of lesions were observed. Our results show that laser-induced thermotherapy of pancreatic tissue was feasible in this porcine model, and online monitoring was practicable. Further studies are necessary to increase the accuracy of online MR imaging of thermal effects.

Im Vergleich zu anderen Krebsentitäten, konnten Patienten mit PDAC bisher kaum von Therapieerfolgen der Präzisionsmedizin profitieren. Um diese Problematik zu adressieren, habe ich eine umfassende molekularbiologische Studie durchgeführt, um prädiktive Biomarker zu identifizieren und die Risikostratifizierung der Patienten zu verfeinern. Mittels gen-spezifischer Sequenzierung und gezielter RNA-Expressionsanalyse wurden 293 R0-resezierte Patienten aus einer multizentrischen Phase-III-Studie untersucht. Ziel der klinischen Studie war der Vergleich von adjuvanter Chemotherapie mit Gemcitabin entweder mit oder ohne Zusatz von Erlotinib. Für meine Arbeit wurden die Patientenproben unter Verwendung einer nicht-negativen Matrixfaktorisierung (NMF) basierend auf ihren Einzelnukleotidvarianten (SNV) und ihren Kopienzahlveränderungen (CNA) gruppiert und auf klinische und molekularbiologische Unterschiede untersucht. Um die biologischen Hintergründe der identifizierten genetischen Besonderheiten zu verstehen, wurden anschließend Zelllinien genetisch modifiziert und in vitro modelliert. Es wurden 1086 SNVs und 4157 CNAs identifiziert. Dabei wiesen 99% aller Patienten mindestens eine genetische Veränderung auf, mit durchschnittlich 18 Aberrationen pro Patient. In Übereinstimmung mit früheren Berichten waren KRAS, TP53, CDKN2A und SMAD4 die am häufigsten betroffenen Gene. Alterationen in diesen Genen konnten in 63-93 % der Fälle nachgewiesen werden. Basierend darauf konnte ich fünf Patientengruppen identifizieren die sich in ihren biologischen Charakteristika unterscheiden und Angriffspunkte für gezielte Therapien bieten. Mittels NMF wurden zudem SMAD4alt MAPK9low als prognostische Biomarker für Erlotinib identifiziert. Anschließende in vitro Experimente zeigten, dass dies nicht auf eine Erhöhung der Erlotinib-Zelltoxizität zurückzuführen ist. Zuletzt definiere ich einen prognostischen Score der genutzt werden kann um das Überleben von R0-resizierten PDAC Patienten abzuschätzen. / In contrast to other cancer entities, PDAC patients have not benefited from recent improvements in precision medicine. To address this gap, I embarked on a comprehensive molecular study to identify predictive biomarkers and refine risk stratification. I performed targeted sequencing and targeted RNA expression analysis of 293 R0-resected patients from a multicenter phase III trial comparing adjuvant chemotherapy of gemcitabine with or without erlotinib. Patients were clustered using non-negative matrix factorization (NMF) based on their single nucleotide variant (SNV) and copy number alteration (CNA) statuses. Overall (OS) and disease-free survival (DFS) were analysed with the multivariate cox hazard and log rank tests. Finally, using a method based on CRISPR/Cas, findings from the patient cohort where modeled in vitro to assess their biological backgrounds. A total of 1,086 SNVs and 4,157 CNAs were found with at least one genetic alteration in 99% of all patients, and an average of 18 aberrations per patient. In line with previous reports, KRAS, TP53, CDKN2A, and SMAD4 were the most frequently affected genes, detected in 63–93 % of cases. In this thesis, I identified five biologically distinct patient subgroups with different actionable lesions that may serve for refined PDAC classification and tailored treatment approaches. NMF based clustering and subsequent differential expression analysis revealed SMAD4alt (SNV and/or CAN in SMAD4) MAPK9low (MAPK9 expression below median) as prognostic erlotinib biomarker. Modeling of SMAD4alt MAPK9low status in vitro showed that the effect is not based on increased erlotinib toxicity. Finally, I proposed a genetic risk score for prognostic evaluation of newly diagnosed R0-resected PDAC patients.

Bakterielle Toxine stellen eine wirkungsvolle und effektive Alternative zur Therapie von Tumorerkrankungen dar. Das vom Clostridium perfringens Typ A produzierte Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) gehört zu der Gruppe der porenbildenden Toxine und weist eine rezeptorspezifische zytotoxische Wirkung auf, welche über die Membranrezeptoren Cldn3 und Cldn4 entfaltet wird. Diese liegen vor allem in Epithelialkarzinomen wie dem Brust-, Prostata-, oder Kolon-, sowie dem Pankreaskarzinom (PK) stark hochreguliert vor. Ziel dieser Arbeit war die Anwendung des neuen selektiven und effizienten „Onkoleaking“ Suizid-Gentherapie Konzepts für die Behandlung von Cldn3 / 4 überexprimierender PK unter Verwendung eines nicht-viralen translations-optimierten CPE exprimierenden Vektors (optCPE). Weiterhin sollte in dieser Arbeit der genaue molekulare Mechanismus der CPE-vermittelten Zytotoxizität in vitro und auch in vivo analysiert werden. Für die in vitro Analysen wurden verschiedene humane PK Zelllinien, Patienten abgeleitete Xenotransplantate (PDX) und deren abgeleiteten Zellen bezüglich ihrer Cldn3 / 4 Expression und Sensitivität sowohl gegenüber rekombinantem CPE (rekCPE) als auch nach optCPE Gentransfer untersucht. Es konnte eine positive Korrelation zwischen der Effizienz CPE vermittelter Zytotoxizität und der Höhe der Cldn3 / 4 Überexpression gezeigt werden. Des Weiteren wurde die Verfügbarkeit und Zugänglichkeit der CPE Rezeptoren für die Toxinbindung als kritischer Faktor für die durch Porenbildung induzierte Zytotoxizität beschrieben. Auch eine detaillierte Analyse verschiedener apoptotischer und nekrotischer Signalwege und deren Schlüsselmoleküle waren vom besonderen Interesse. Von noch größerer Wichtigkeit war jedoch die Anwendbarkeit und der Nachweis der antitumoralen Wirksamkeit der optCPE-basierten Suizid-Gentherapie mit Hilfe des intratumoralen Jet-Injektion Gentransfers in verschiedenen Luziferase-exprimierenden CDX und PDX Modellen des PK. Alle in vivo Studien zeigten eine selektive optCPE vermittelte Verminderung der Tumorvitalität in Verbindung mit Nekrose, die in fast allen Fällen mit einer Reduktion des Tumorvolumens einher ging. Die tierexperimentellen Studien belegen damit die Effektivität der CPE-basierten Gentherapie im Pankreaskarzinom. Mit diesen neu gewonnenen Erkenntnissen zum „Onkoleaking“ Konzept der CPE Suizid-Gentherapie und deren Wirkungsmechanismen sind Kombinationen mit konventionellen Therapien möglich. / Bacterial toxins have evolved to an effective therapeutic option for cancer therapy and numerous studies demonstrated their antitumoral potential. The Clostridium perfringens enterotoxin (CPE), produced by the anaerobic Clostridium perfringes bacteria, is a pore-forming (oncoleaking) toxin, which binds to its receptors claudin-3 and -4 (Cldn3 / 4) and exerts a selective, receptor-dependent cytotoxicity. The transmembrane tight junction proteins Cldn3 and Cldn4 are known CPE receptors and are highly upregulated in several human epithelial cancers such as breast, colon, ovarian and pancreatic cancer. This study aimed at the evaluation of the potential of oncoleaking gene therapy using a non-viral translation optimized CPE vector (optCPE) as a new suicide approach for the treatment of Cldn3  /  4 overexpressing pancreatic cancer (PC) in vitro and in vivo. We demonstrated the successful in vitro use of optCPE gene transfer in a panel of human PC cells and more importantly patient derived PC xenograft (PDX) derived cells. We showed significant reduction of cell viability in all Cldn3 / 4 overexpressing PC cells after optCPE transfection. Furthermore a positive correlation between CPE cytotoxicity and level of claudin expression was shown. We revealed accessibility of CPE receptors for toxin binding as determining for optCPE mediated cytotoxicity. Since investigation of optCPE induced cell death mechanism was of particular interest, detailed analyses of apoptotic and necrotic key players were performed. By this, caspase dependent- and independent apoptosis and necrosis activation after gene transfer was demonstrated, which was dependent on amount of expressed optCPE and accessibility of Cldn. More importantly, this study demonstrated the applicability and antitumoral efficacy of optCPE gene therapy by the non-viral intratumoral jet-injection gene transfer in vivo in different luciferase-expressing CDX and PDX pancreatic cancer models. The animal experiments demonstrated the selective CPE mediated tumor growth inhibition, associated with reduced tumor viability and effective induction of tumor necrosis. This further corroborated the advantages of this novel oncoleaking strategy. With this gain of knowledge about our new oncoleaking concept of suicidal gene therapy and its mechanism of action, novel combinations with conventional therapies are possible to further improve therapeutic efficacy and to overcome resistance in pancreas carcinoma.