Neuroendokrine Neoplasmen der Bauchspeicheldrüse (PanNEN) sind eine seltene und vielfältige Form von Krebs. PanNENs umfassen hochgradige PanNECs und NETG3 PanNETs, sowie die öfter diagnostizierten NETG1 und NETG2 PanNETs. Hochgradige PanNENs weisen eine schlechte Prognose auf, und sind histologisch schwierig zu diagnostizieren. In dieser Studie wird eine auf Methylierung basierende Klassifizierung vorgestellt, die PanNETs von PanNECs unterscheidet und die zugrunde liegende Komplexität in Bezug auf molekularen Merkmalen und den Ursprungszellen der PanNENs aufzeigt. Zuerst wurden PanNENs auf Grundlage ihrer Methylierungsprofile gruppiert, wodurch sich die PanNETs und PanNECs in zwei Gruppen A und B aufteilten. Während Tumore der Gruppe B häufig Veränderungen in KRAS, TP53 und SMAD4 aufweisen, umfasst das Mutationsspektrum von Gruppe A Veränderungen in klassischen PanNEN-Genen wie MEN1, DAXX, ATRX und VHL. Darüber hinaus ist Gruppe A durch chromosomale Aberrationen geprägt, während Gruppe B eine signifikante fokale Deletion des RB1-Lokus aufweist. Anhand von Methylierungsprofilen von alpha-, beta-, duktalen und azinären Pankreaszellen sowie von Expressionsmustern normaler Zelltyp Markergene innerhalb der Tumore folgt, dass die PanNETs alpha-, beta- und intermediär-ähnliche Tumore endokrinen Ursprungs sind, während die PanNECs azinäre Tumore vermutlich exokrinen Ursprungs sind. Ausprägung des Azinuszellenprofils und Expression des SOX9-Proteins in Gruppe B sind vergleichbar mit denen des duktalen Adenokarzinoms der Pankreas (PDAC), einer Tumorentität mit nachgewiesen exokrinen Zellursprung. Insgesamt ergeben die neuen Erkenntnisse dieser Arbeit ein umfassendes Profil, das PanNET- und PanNEC-Tumore genetisch und epigenetisch eindeutig charakterisiert. Weiterhin liefert diese Arbeit starke Beweise für die aufkommende, aber unbewiesene Theorie des exokrinen Ursprungs von PanNECs und somit einen neuen Ansatz für die Behandlung dieser seltenen, aber oft tödlichen Krankheit. / Pancreatic Neuroendocrine Neoplasm (PanNEN) is a rare form of cancer comprising a heterogeneous set of high-grade tumors PanNECs and NETG3, in addition to the more commonly diagnosed NETG1 and NETG2 PanNETs. High-grade PanNENs display poor prognosis among patients and remains challenging to diagnose histologically. This study presents a methylation-based classification, which precisely distinguishes PanNETs and PanNECs, exposing the complexity evident in molecular and tumor cell-of-origin features of PanNENs. My work establishes distinct PanNEN subgroups based on methylation profiles. The PanNETs and PanNECs were separated into two groups: Group A and Group B, respectively. While Group B tumors are enriched for recurring alterations in KRAS, TP53 and SMAD4, the mutational spectrum of Group A encompasses alterations in classical PanNEN genes including MEN1, DAXX, ATRX and VHL. Recurring whole chromosomal aberrations are evident in Group A tumors, in contrast to Group B tumors, which reveal a significant focal deletion of the RB1 locus. Using methylation profiles of normal pancreatic cell types, in addition to expression patterns of normal cell type marker genes within tumors, the study concluded that the PanNET tumors are alpha-like, beta-like, and intermediate-like tumors of endocrine origin, while PanNECs of Group B are acinar-like tumors with a potential exocrine origin. The proportion of acinar-cell methylation profile and expression of SOX9 protein in Group B tumors are comparable to Pancreatic Ductal adenocarcinoma (PDAC), a tumor entity of exocrine cell-of-origin. Together, the novel findings of this thesis establish a comprehensive profile distinctly characterizing PanNET and PanNEC tumors at the genetic and epigenetic molecular level. Importantly, this work provides strong evidence for the emerging yet unproven theory of an exocrine origin of PanNECs, offering a new approach for treating patients with this rare but often fatal disease.

Bakterielle Toxine stellen eine wirkungsvolle und effektive Alternative zur Therapie von Tumorerkrankungen dar. Das vom Clostridium perfringens Typ A produzierte Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) gehört zu der Gruppe der porenbildenden Toxine und weist eine rezeptorspezifische zytotoxische Wirkung auf, welche über die Membranrezeptoren Cldn3 und Cldn4 entfaltet wird. Diese liegen vor allem in Epithelialkarzinomen wie dem Brust-, Prostata-, oder Kolon-, sowie dem Pankreaskarzinom (PK) stark hochreguliert vor. Ziel dieser Arbeit war die Anwendung des neuen selektiven und effizienten „Onkoleaking“ Suizid-Gentherapie Konzepts für die Behandlung von Cldn3 / 4 überexprimierender PK unter Verwendung eines nicht-viralen translations-optimierten CPE exprimierenden Vektors (optCPE). Weiterhin sollte in dieser Arbeit der genaue molekulare Mechanismus der CPE-vermittelten Zytotoxizität in vitro und auch in vivo analysiert werden. Für die in vitro Analysen wurden verschiedene humane PK Zelllinien, Patienten abgeleitete Xenotransplantate (PDX) und deren abgeleiteten Zellen bezüglich ihrer Cldn3 / 4 Expression und Sensitivität sowohl gegenüber rekombinantem CPE (rekCPE) als auch nach optCPE Gentransfer untersucht. Es konnte eine positive Korrelation zwischen der Effizienz CPE vermittelter Zytotoxizität und der Höhe der Cldn3 / 4 Überexpression gezeigt werden. Des Weiteren wurde die Verfügbarkeit und Zugänglichkeit der CPE Rezeptoren für die Toxinbindung als kritischer Faktor für die durch Porenbildung induzierte Zytotoxizität beschrieben. Auch eine detaillierte Analyse verschiedener apoptotischer und nekrotischer Signalwege und deren Schlüsselmoleküle waren vom besonderen Interesse. Von noch größerer Wichtigkeit war jedoch die Anwendbarkeit und der Nachweis der antitumoralen Wirksamkeit der optCPE-basierten Suizid-Gentherapie mit Hilfe des intratumoralen Jet-Injektion Gentransfers in verschiedenen Luziferase-exprimierenden CDX und PDX Modellen des PK. Alle in vivo Studien zeigten eine selektive optCPE vermittelte Verminderung der Tumorvitalität in Verbindung mit Nekrose, die in fast allen Fällen mit einer Reduktion des Tumorvolumens einher ging. Die tierexperimentellen Studien belegen damit die Effektivität der CPE-basierten Gentherapie im Pankreaskarzinom. Mit diesen neu gewonnenen Erkenntnissen zum „Onkoleaking“ Konzept der CPE Suizid-Gentherapie und deren Wirkungsmechanismen sind Kombinationen mit konventionellen Therapien möglich. / Bacterial toxins have evolved to an effective therapeutic option for cancer therapy and numerous studies demonstrated their antitumoral potential. The Clostridium perfringens enterotoxin (CPE), produced by the anaerobic Clostridium perfringes bacteria, is a pore-forming (oncoleaking) toxin, which binds to its receptors claudin-3 and -4 (Cldn3 / 4) and exerts a selective, receptor-dependent cytotoxicity. The transmembrane tight junction proteins Cldn3 and Cldn4 are known CPE receptors and are highly upregulated in several human epithelial cancers such as breast, colon, ovarian and pancreatic cancer. This study aimed at the evaluation of the potential of oncoleaking gene therapy using a non-viral translation optimized CPE vector (optCPE) as a new suicide approach for the treatment of Cldn3  /  4 overexpressing pancreatic cancer (PC) in vitro and in vivo. We demonstrated the successful in vitro use of optCPE gene transfer in a panel of human PC cells and more importantly patient derived PC xenograft (PDX) derived cells. We showed significant reduction of cell viability in all Cldn3 / 4 overexpressing PC cells after optCPE transfection. Furthermore a positive correlation between CPE cytotoxicity and level of claudin expression was shown. We revealed accessibility of CPE receptors for toxin binding as determining for optCPE mediated cytotoxicity. Since investigation of optCPE induced cell death mechanism was of particular interest, detailed analyses of apoptotic and necrotic key players were performed. By this, caspase dependent- and independent apoptosis and necrosis activation after gene transfer was demonstrated, which was dependent on amount of expressed optCPE and accessibility of Cldn. More importantly, this study demonstrated the applicability and antitumoral efficacy of optCPE gene therapy by the non-viral intratumoral jet-injection gene transfer in vivo in different luciferase-expressing CDX and PDX pancreatic cancer models. The animal experiments demonstrated the selective CPE mediated tumor growth inhibition, associated with reduced tumor viability and effective induction of tumor necrosis. This further corroborated the advantages of this novel oncoleaking strategy. With this gain of knowledge about our new oncoleaking concept of suicidal gene therapy and its mechanism of action, novel combinations with conventional therapies are possible to further improve therapeutic efficacy and to overcome resistance in pancreas carcinoma.