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Previous issue date: 2015-03-30 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Por análises in silico, um domínio B conservado e antigênico foi previamente
identificado em nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) de plantas e
parasitos. O r-potDomB, um recombinante derivado do domínio B (r78-117) da
apirase de batata, foi obtido por expressão heteróloga, e a sua reatividade com
anticorpos policlonaisanti-apirase de batata confirmaram a existência de epitopos
indutores de resposta imune humoral em mamíferos. A clonagem do gene da
NTPDase1 de Leishmania amazonensis (LamNTPDase1; NCBI: AFJ22627.1) e as
análises in silico reforçaram a hipótese de conservação do domínio B de NTPDases.
O r-potDomB, os peptídeos sintéticos LbB1LJ e LbB2LJ derivados do domínio B de
NTPDase1 de Leishmania, e os anticorpos produzidos contra estas biomoléculas,
foram usados como ferramentas moleculares para estudos específicos da
NTPDase1 de L. amazonensis e da leishmaniose. Por “Western blots”, a NTPDase1
foi identificada como bandas de 48 e 63 kDa em frações de membrana, microssomal
e flagelo de promastigotas. Por análise imunocitoquímicaultraestrutural, os
anticorpos localizaram a NTPDase1 na superfície de membrana plasmática, núcleo,
mitocôndria e cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo, confirmando sua ampla
distribuição neste parasito. Análises in silico sugeriram as possíveis modificações
pós-traducionais da NTPDase1, incluindo a sua conjugação com proteína SUMO. Os
polipeptídeos de 48 e 63 kDa e um co-migrante de 12 kDa foram isolados de
promastigotas por eletroforese em gel não-desnaturante. Por “Western blots” e
espectrometria de massas, a identidade da NTPDase1 foi confirmada
nospolipeptídeos de 48 e 63 kDa. Por espectrometria de massas, o polipeptídeo de
12 kDa foi identificado como pertencente à família de proteínas SUMO e, também,
adicionado aopolipeptídeo de 63 kDa. Os polipeptídeos de 63 kDa e 12 kDa, mas
não o de 48 kDa, foram reconhecidos em “Western blots” pelo soro imune anti-
SUMO1, sugerindo a ligação entre NTPDase1 e SUMO, uma modificação descrita
pela primeira vez entre os membros da família das NTPDases. Camundongos
BALB/c foram infectados com promastigotas, e os anticorpos destes animais
reconheceram a NTPDase1 pura, mas não SUMO, confirmando sua antigenicidade.
Durante a progressão da doença, alta reatividade entre r-potDomB, LbB1LJ ou
LbB2LJ e anticorpos IgG2a dos camundongos infectados foi observada aos 40 dias
pós-infecção, revelando a antigenicidade do domínio B e a sua habilidade de induzir
a produção deste subtipo nos estágios iniciais da doença. A reatividade de IgG1 foi
significativamente maior aos 90-120 dias pós-infecção, coincidindo com o estágio
mais ativo da doença, sugerindo participação do domínio em eventos
imunoregulatórios. O r-potDomB induziu reação de hipersensibilidade tardia em
camundongos Suíços, uma resposta imune celular, com elevação concomitante dos
níveis de IgG2a e IFN-y. O r-potDomB, na ausência de adjuvante, usado na préimunização
de camungondos Suíços infectados com amastigotas, estimulou a
produção de IgG2a e IFN-y, e promoveu proteção parcial contra a progressão da
leishmaniose como observado por medida de edema de patas e análises
histopatológicas.Os resultados estimulam o aproveitamento biotecnológico do rpotDomB,
ou derivados desta biomolécula, em formulações e em protocolos
experimentais de imunoterapia e/ou vacinação contra leishmanioses. / By in silico analysis, an antigenic conserved B domain was previously identified
within nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and
parasites. The r-potDomB, a recombinant belonging to the conserved B domain (r78-
117) from the potato apyrase, was obtained by heterologous expression, and its
reactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies confirmed the existence of
epitopes which induce humoral immune response in mammalian. The cloning of the
gene from the Leishmania amazonensisNTPDase 1 (LamNTPDase1; NCBI
AFJ22627.1) and in silico analysis reinforced the hypothesis of B-domain
conservation within NTPDases. The r-potDomB, synthetic peptides LbB1LJ and
LbB2LJ derived from the B-domain from LeishmaniaNTPDase 1, and the antibodies
raised against these biomolecules, were used as molecular tools for specific studies
of the L. amazonensisNTPDase 1 and leishmaniasis. By Western blots, theNTPDase
1 was identified as bands of 48 and 63 kDa in membrane, microsomal and flagellar
fractions of promastigotes. By ultrastructural immunocytochemical, the antibodies
localized the NTPDase 1 at the surface of plasma membrane, nucleus, mitochondria
and kinetoplast, at flagellar pocket and flagellum, confirming its widespread
distribution in this parasite. In silico analysis suggested possible post-translational
modifications of the NTPDase 1, including its conjugation with SUMO protein. The
polypeptides of 48 and 63 kDa and one co-migrant of 12 kDa were isolated of
promastigotes by non-denaturing gel electrophoresis. By Western blots and mass
spectrometry, the identity of NTPDase1 in the polypeptides of 48 e 63 kDa was
confirmed. By mass spectrometry, the polypeptide of 12 kDa was identified belonging
to the SUMO protein family and, also, added to the polypeptide of 63 kDa. The
polypeptides of 63 and 12 kDa, but not 48 kDa, were recognized in Western blots by
immune serum anti-SUMO1, suggesting binding between NTPDase 1 and SUMO, a
modification described for the first time among members of the NTPDase family.
BALB/c mice were infected with promastigotes, and the antibodies from these
animals recognized the pure NTPDase, but not SUMO, confirming its antigenicity.
During disease progression, high reactivity between r-potDomB, LbB1LJ or LbB2LJ
and IgG2a antibodies of the promastigote-infected mice was observed at 40 days
post-infection, revealing both the B-domain antigenicity and its ability for induce the
production of this subtype in early disease stages. The IgG1 reactivity was
significantly higher at 90-120 days post-infection, coinciding with the most active
stage of the disease, suggesting participation of the domain in immuneregulatory
events. The r-potDomB induced delayed type-hypersensitivity reaction in Swiss mice,
a cellular immune response, with a concomitant increase in the levels of IgG2a and
IFN-y. The r-potDomB, in the absence of adjuvant, used in pre-immunization of
amastigotes-infected Swiss mice, stimulated the production of IgG2a and IFN-y, and
promoted partial protection against leishmaniasis progression, as observed by
measuring of footpad swelling and histopathological analysis. The results stimulate
biotechnological use of the r-potDomB, or derivatives of this biomolecule, in
formulations and experimental protocols of immunotherapy and/or vaccination
against leishmaniasis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:hermes.cpd.ufjf.br:ufjf/7001 |
| Date | 30 March 2015 |
| Creators | Detoni, Michelle de Lima |
| Contributors | Vasconcelos, Eveline Gomes, Faria, Suzana Côrte-Real, Valle, Tânia Zaverucha do, Pinto, Priscila de Faria, Cupolilo, Sônia Maria Neumann |
| Publisher | Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia, UFJF, Brasil, ICB – Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFJF, instname:Universidade Federal de Juiz de Fora, instacron:UFJF |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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