La transcétolase thermostable de Geobacillus stearothermophilus (TKgst, EC 2.2.1.1) permet de synthétiser efficacement à haute température des cétoses à 4, 5 et 6 atomes de carbone de configuration d-thréo (3S, 4R), par formation stéréosélective d’une liaison C-C, à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2R) à courte chaîne. L’objectif de ces travaux est d’utiliser la TKgst à 60°C pour gagner en efficacité et étendre son spectre de substrats à de nouveaux donneurs et accepteurs par Evolution dirigée, selon une approche semi-rationnelle, basée sur la mutagenèse par saturation de site. Ainsi, à l’issue du criblage des banques générées, les TKgst mutées les plus performantes (L382D/D470S, L191I, L382F/F435Y, R521Y/H462N et R521V/S385D/H462S) ont été sélectionnées pour leurs activités spécifiques supérieures à celle de la TKgst sauvage (gain de 3,3 à 5) vis-à-vis d’aldéhydes α-hydroxylés (2S) et d’aldéhydes α-hydroxylés (2R) à longue chaîne polyhydroxylée (C5-C6). La TKgst sauvage, ainsi que ces TKgst mutées performantes ont permis d’obtenir, à 60°C, onze cétoses, dont neuf de configuration l-érythro (3S, 4S) à 5 à 6 atomes de carbone et de configuration d-thréo (3S, 4R) de 4 à 8 atomes de carbone d’intérêt biologique, avec de très bons rendements, quatre étant inaccessibles avec les TKs microbiennes utilisées jusqu’alors. D’autres TKgst mutées ont par ailleurs conduit à une amélioration significative de l’activité de la TKgst vis-à-vis d’aldéhydes aliphatiques et aromatiques, mais également vis-à-vis d’un nouveau substrat donneur, l’acide pyruvique et d’analogues, ouvrant le champs des applications aux 1-désoxycétoses. De plus, ces travaux ont permis de développer un procédé multi-enzymatique innovant et éco-comptatible, dans lequel les substrats donneurs et accepteurs de la TKgst sont générés par voie enzymatique, via l’utilisation d’une transaminase ou d’une d-aminoacide oxydase et d’une aldolase, à partir de composés naturels et peu coûteux. Cette stratégie pourra être appliquée aux TKgst mutées, afin d’accéder efficacement et à moindre coût, à d’autres cétoses rares hautement valorisables. / Thermostable transketolase from Geobacillus stearothermophilus (TKgst, EC 2.2.1.1) catalyzes efficiently the synthesis of d-threo (3S, 4R) ketoses having 4, 5 and 6 carbon atoms, by the stereoselective formation of a new C-C bond, from short chain (2R)-α-hydroxylated aldehydes. The aim of this work is to use TKgst at 60°C, in order to increase reaction rates and to broad its substrate scope to new donors and acceptors by Directed Evolution, according to a semi-rationnal approach, based on site saturation mutagenesis. Thus, the screening of the libraries led to TKgst variants (L382D/D470S, L191I, L382F/F435Y, R521Y/H462N and R521V/S385D/H462S) having significantly improved specific activities towards (2S)-α-hydroxylated aldehydes and (2R)-α-hydroxylated aldehydes having a long polyhydroxylated chain (C5-C6), compared to wild type TKgst (3,3 to 5-fold increased activity). Wild-type TKgst as well as these TKgst variants were used, at 60°C, to obtain eleven, including nine l-erythro (3S, 4S) ketoses having 5 and 6 carbon atoms and d-threo (3S, 4R) ketoses having from 4 to 8 carbon atoms of biological interest, with good yields, four being inaccessible using common TK sources. Besides, other TKgst variants led to significantly improved activities towards hydrophobic aldehydes and towards a new donor substrate, pyruvic acid and derivatives, extending TKgst product scope to 1-deoxyketoses. In addition, a multienzymatic innovative and environmentally friendly process, in which TKgst substrates are generated through enzymatic pathways, using a transaminase or a d-aminoacid oxidase and an aldolase, from non-expensive and natural compounds was developed, in the presence of wild-type TKgst and will be able to be applied to TKgst variants, in order to synthesize efficiently and at lower cost, other highly valuable rare ketoses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017CLFAC080 |
| Date | 11 December 2017 |
| Creators | Lorillière, Marion |
| Contributors | Clermont Auvergne, Hecquet, Laurence |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French, English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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