Nos últimos anos a incidência do câncer tem crescido significativamente mundialmente, porém, as técnicas atualmente empregadas para a detecção da doença não são individualmente conclusivas, além de serem extremamente invasivas e não permitirem seu diagnóstico precoce, o que justifica o desenvolvimento de novas tecnologias alternativas para a detecção do câncer. Células cancerígenas possuem receptores específicos de alta afinidade com folato e por serem altamente replicativas, são extremamente dependentes do suprimento de folato reduzido. Os alfa-receptores de folato (FR α) são proteínas com propriedades bioquímicas específicas as quais podem ser exploradas pela estratégia de marcação para detecção e tratamento do câncer (biomarcadores). Com raras exceções, são induzidos seletivamente em tecidos cancerígenos e raramente expressos em células normais, mostrando-se, assim, altamente seletivos e específicos. Sendo assim, neste projeto objetivou-se a expressão e a purificação dos FR α, além da sua imobilização em microssistema para estudos subsequentes em biossensores. Foram promovidos testes de expressão da proteína heteróloga (rFR α) em E. coli em diferentes linhagens, temperaturas e tempos de indução da expressão sendo observada a expressão da proteína recombinante de forma insolúvel. Paralelamente foram promovidos testes de expressão da proteína rFR α em P. pastoris, os quais não se mostraram eficientes, uma vez que não foi possível a detecção da proteína em estudo. Como alternativa, uma nova construção, em fusão com a proteína Trigger fator (TF) de E. coli, uma chaperona molecular de alta solubilidade, foi testada. Através de análises por SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL e espectrometria de massas, foi possível comprovar a produção da proteína recombinante TFFRα. Ainda, a proteína foi imobilizada em lipossomos, o que proporcionou o desenvolvimento de um padrão analítico que poderá ser utilizado em estudos subsequentes com biossensores de FR α. Este estudo será útil para o desenvolvimento de drogas visando a inativação desta proteína, como os anti-folatos, que são hoje os agentes anti-neoplásicos mais investigados, e possibilitará a caracterização bioanalítica da proteína FR α recombinante (rFR α) bem como o desenvolvimento de novos biossensores. / In recent years the incidence of cancer has grown significantly globally. Even though, the techniques currently employed for the detection of cancer are not individually conclusive due to the subjectivity of the analysis, inherently invasive, and are unable to provide early diagnosis. Therefore, the development of new technologies for cancer detection and prognostic are justified. Cancer cells have specific receptors with high affinity towards folate and are highly replicative. Alpha folate receptor (FR α) are extracellular proteins with specific biochemical properties since, with rare exceptions, are induced selectively in cancerous tissues and rarely expressed in normal cells, being highly sensitive and specific. In this work we produced FR α heterologously and we immobilized it on a microsystem mimicking a cancer cell that will become an analytical standard for studies with biosensors. Firstly, we produced rFR α in different E. coli strains, exploring variation of temperature and induction times, in which we observed the expression of insoluble protein. We also tried the expression in P. pastoris system, which was not efficient as well. Alternatively, we cloned FOLR1 gene in a special vector that enables the expression of FR α fusioned with the Trigger fator from E. coli, a highly soluble molecular chaperone. Using SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL and mass espectrometry we observed the production of soluble TFFR α. The recombinant protein was immobilized in liposomes, producing an analytical standard for studies with FR α-based biosensors. Our findings open research possibility in drug development, like anti-folates, besides the development of new biosensors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29012015-171032 |
| Date | 22 August 2014 |
| Creators | Miranda, Beatriz Nogueira Messias de |
| Contributors | Carrilho, Emanuel |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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