A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada por Paracoccidioides spp., (P. brasiliensis e P. lutzii), geograficamente, limita-se a América Latina com as áreas endêmicas estendendo-se desde o México até a Argentina, constituindo uma das micoses sistêmicas de maior incidência na região, afetando principalmente trabalhadores rurais. O maior número de pacientes com PCM tem sido reportado principalmente no Brasil, Colômbia e Venezuela. A incidência real desta micose encontra-se subestimada no Brasil e pouco se conhece em relação a nova espécie descrita - P. lutzii. A maioria dos estudos em P. lutzii foram focados em genética, especiação e na geração de novos antígenos para melhorar a especificidade e sensibilidade dos testes sorológicos. Atualmente, as preparações antigênicas tradicionais, preparadas a partir de isolados de P. brasiliensis, são ineficientes. Raros são os trabalhos focados na biologia de P. lutzii e nos fatores de virulência que podem ser comparados com P. brasiliensis nos modelos experimentais. A nossa proposta de estudo foi avaliar alguns aspectos in vitro e in vivo relacionados com a patogenicidade e destacamos: a fagocitose e a morte intracelular de P. lutzii por macrófagos, peritoneais, de camundongos Knockouts (KO) e selvagens para PRRs (TLR2, TLR4 e Dectina) e ativadores intracelulares (MyD88 e NALP3). Paralelamente a este estudo, animais foram infectados com leveduras de P. lutzii e comparados com os modelos de infecção já estabelecidos com leveduras (Pb18) e conídios (ATCCPb60855) de P. brasiliensis. Nossos dados indicam que similar ao que ocorre com P. brasiliensis a fagocitose de P. lutzii depende de TLR2, TLR4 e Dectina- 1, resultados semelhantes também foram observadas na expressão de moléculas envolvidas na co-estimulação e a apresentação de antígenos (MHC II, CD80 e CD86). Contudo, a morte intracelular de leveduras de P. lutzii é claramente dependente de TLR4, e a produção de citocinas IL-6, MIP-2, IFN- e IL-12p40 são importantes para o controle das leveduras pelos macrófagos. No modelo experimental de P. lutzii, camundongos machos C57BL/6 (6-7 semanas) foram infectados intratraquealmente como 1x106 leveduras viáveis do isolado de P. lutzii Pb01. Encontramos duas fases da doença, a primeira de 0 hora até 2 a 4 semanas pós-infecção, e a segunda de 4 até 12 semanas. As leveduras parecem ser contidas na primeira semana de infecção e posteriormente não encontramos leveduras nos macerados de pulmão, diferente do modelo de BALB/c infetado com conídios de ATCC-Pb60855 no qual as UFC são recuperadas até a semana 16 pós-infeção. Como relação aos níveis de citocinas, encontramos que na lavagem broncoalveolar e macerado de pulmão um perfil misto Th1/Th2 porém, marcado por citocinas próinflamatórias no primeiro período e citocinas regulatórias tipo Th2 no segundo período (IL-12p70, IL-23, IL-10); similar ao descrito nos modelos de P. brasiliensis infectados tanto com conídios como com leveduras. No entanto, no primeiro período da doença, em camundongos C57BL/6, parece ter uma carga inflamatória maior que reflete nas citocinas que mantém seus níveis até o período crônico: TNF-alfa, MIP-2 e GM-CSF está última, regulada positivamente tanto em experimentos in vitro como in vivo. Também observamos que a partir das 48horas pós-infecção encontramos níveis aumentados de IL-12p70 até o período crônico onde junto com a IL-23 parecem ser as responsáveis pela diminuição da infecção no período tárdio. Esta é a primeira vez que se descreve um modelo experimental com P. lutzii (isolado Pb01) indicando o perfil imunopatológico com pequenas diferenças comparados ao P. brasiliensis porém, de importância na patogenicidade da doença auxiliando a compreender as diferentes formas da doença no modelo experimental / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides spp. (P. brasiliensis and P. lutzii), geographically, is limited to Latin America with endemic areas from Mexico to Argentina, as one of the systemic mycoses with the highest incidence in the region, mainly affecting rural workers. The largest number of patients with PCM has been mainly reported in Brazil, Colombia and Venezuela. The true incidence of this mycosis is underestimated in Brazil and little is known about the new species described - P. lutzii. Most studies in P. lutzii were focused on genetics, speciation and the generation of new antigens to improve the specificity and sensitivity of serological tests. Currently, traditional antigenic preparations, prepared with isolates of P. brasiliensis, are inefficient. There are few studies focused on P. lutzii biology and virulence factors that can be compared with P. brasiliensis in experimental models. Our study aimed to evaluate some in vitro and in vivo aspects related to pathogenicity: phagocytosis and intracellular killing of P. lutzii by peritoneal macrophages from knockouts (KO) for PRRs (TLR2, TLR4 and Dectin) and intracellular activators (MyD88 and NALP3). In addition, animals were infected with P. lutzii yeast and compared with the well-established models of infection with yeast cells (Pb18) and conidia (ATCC Pb60855) from P. brasiliensis. Our data indicate that similarly to what happens with the phagocytosis of P. brasiliensis, P. lutzii phagocytosis is dependent on TLR2, TLR4 and Dectin-1. Other molecules, involved in co-stimulation and presentation of antigens such as MHC II, CD80 and CD86 were also shown to participate in the P. lutzii-host interaction. However, intracellular killing of P. lutzii yeast cells was clearly dependent on TLR4, and the production of cytokines as IL-6, MIP-2, IFN- and IL-12p40 were important for the control of the yeast by macrophages. In the experimental model of P. lutzii, male C57BL/6 mice (6-7 weeks) were infected intratracheally with 1x106 viable yeasts of the isolate Pb01like. We found two phases of the disease, the first from the inoculation to 2 or 4 weeks after infection and the second from 4 to 12 weeks. Yeast appear to be contained within the first week of infection and subsequently are also absent from macerated lung, differently from the model of BALB/c mice infected with ATCC Pb60855 conidia in which CFUs were detected up to week 16 post-infection. We found a mixed Th1/Th2 pattern (IL-12p70, IL-23, IL-10) in bronchoalveolar lavage and lung, with the predominance of proinflammatory cytokines in the first phase and predominance of regulatory Th2 cytokines in the second phase, reproducing findings of P. brasiliensis infection models produced with both conidia and yeast. However, in the first period of the disease in C57BL/6 mice there was a higher inflammatory burden, reflected by the high cytokine levels (TNF-alpha, MIP-2 and GM-CSF), the latter in particular because it was positively regulated both in vitro and vivo), that persisted through the chronic period. We also observed that starting from 48 hours postinfection to the chronic period there were increased levels of IL-12p70, which together with IL-23 appeared to be responsible for the reduction of infection in the late period. This is the first time that an experimental model with P. lutzii (Pb01) is described, showing an immunological profile with only slight differences compared to the P. brasiliensis model. The present study details important aspects of the pathogenesis of the disease due to different species of Paracoccidioides and helps to understand the different forms of presentation in experimental models
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04082015-090755 |
| Date | 23 April 2015 |
| Creators | Uran Jimenez, Martha Eugenia |
| Contributors | Taborda, Carlos Pelleschi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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